m CIM、eCIM 聯(lián)合試驗對CRE 中的碳青霉烯酶檢測價值

朱勝明

（羅田縣人民醫(yī)院 湖北 羅田 438600）

近年來，隨著藥物的濫用，細菌耐藥性成為至關(guān)重要的問題，產(chǎn)生耐藥性的多數(shù)為耐碳青霉烯腸桿菌類細菌（CRE）[1]，因此及時檢出CRE 是控制感染最重要的途徑。臨床常以基因測序檢測作為金標準，但此方案檢查過程中要求較高，需對DNA 進行擴增，檢查時間較長，因此不利于患者及時治療，臨床應用受到限制。改良的碳青霉烯滅活（mCIM）是現(xiàn)階段臨床較為多見的檢查方案，主要將接種環(huán)生長在營養(yǎng)肉湯中，然后采用無菌試紙浸沒于液體中，再將其取出貼于大腸桿菌平板中。根據(jù)抑菌圈直徑進行判定，能在短時間內(nèi)作出判定，但此方案易產(chǎn)生抵抗相應，出現(xiàn)中性結(jié)果，不能準確判斷出是否存在CRE。mCIM、eCIM 聯(lián)合試驗主要將兩者的美羅培南試紙放置于同一塊涂有大腸埃希菌的平板上，可通過兩種結(jié)果共同判定[2]，但將兩者聯(lián)合用于檢測CRE 的效果并未明確?；诖耍狙芯繉⑻接憁CIM、eCIM 聯(lián)合試驗對CRE 中的碳青霉烯酶檢測價值，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2020 年2 月至2021 年3 月92 例感染患者，將患者體內(nèi)分離的88 株CRE 行耐藥性分析，以基因測序?qū)蛐偷拇_定作為金標準，進行mCIM、eCIM 聯(lián)合檢測及mCIM 檢測。男性50 例，女性42 例；獲取途徑：痰液12 例，尿液13 例，肺泡灌洗液16 例，血液10 例，腦脊液5 例，分泌物15 例，穿刺液11 例，腹腔引流液8 例，淺靜脈導管2 例。

1.2 方法

以基因測序?qū)蛐偷拇_定作為金標準，進行mCIM、eCIM 聯(lián)合檢測，主要儀器包括PCR 擴增儀器（廠家：南京貝登醫(yī)療股份有限公司；型號：Lepgen-96）及所需的聚合酶試劑、營養(yǎng)肉湯、dNTPs、美羅培南試紙，全自動細菌檢測儀（廠家：上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；型號：IGL-200），凝膠成像系統(tǒng)儀[廠家：迪圖（上海）生物科技有限公司；型號：JS-680D]，電泳儀（廠家：浙江賽德；型號：DYCP-37B）。

mCIM、eCIM 聯(lián)合檢測：

（1）mCIM。首先在2 毫升營養(yǎng)肉湯內(nèi)加入過夜的培養(yǎng)純菌，震蕩10 秒～15 秒以達到混勻的目的，美羅培南試紙置于管內(nèi)，并保證均浸于懸液內(nèi)，在35℃環(huán)境中孵育4 小時，結(jié)束時立即將大腸埃希菌懸液（主要由生理鹽水或營養(yǎng)肉湯制備）涂布在水解蛋白的平板上，確保15 分鐘內(nèi)完成菌懸液的制備及平板涂布，干燥時間為3 分鐘～10 分鐘。在肉湯中采用10 微升接種環(huán)將試紙從TSB 內(nèi)取出，并將其貼在試管內(nèi)側(cè)壁，輕按脫去水分，然后將取出的紙片置于大腸桿菌平板上，倒置，在35℃環(huán)境中孵育18 小時～24 小時，測量抑菌圈直徑。

（2）eCIM 。將0.5 毫摩爾/ 升20 微升EDTA液置于2 毫升肉湯內(nèi)，將1 微升接種環(huán)生長于血瓊脂平板上，同時震蕩10 秒～15 秒以混勻。在每管中均完全浸入10 微克無菌試紙，于35℃環(huán)境中孵育4小時，結(jié)束時立即將大腸埃希菌懸液（主要由生理鹽水或營養(yǎng)肉湯制備）涂布在水解蛋白的平板上，確保15 分鐘內(nèi)完成菌懸液的制備及平板涂布，干燥時間為3 分鐘～10 分鐘，涂布于MHA 平板上，確保15分鐘內(nèi)完成菌懸液和平板涂布，干燥3 分鐘～10 分鐘。在營養(yǎng)肉湯中采用接種環(huán)取出美羅培南試紙，在試管內(nèi)壁貼上紙片，并適當按壓將多余水分擠去，然后MHA 平板上放置紙片。倒置平板，在35℃環(huán)境中孵育18 小時～24 小時，量抑菌圈直徑。mCIM、eCIM 聯(lián)合進行；將mCIM、eCIM 內(nèi)的美羅培南試紙放置于同一塊涂有大腸埃希菌的平板上。

（3）解讀與判斷。①mCIM：碳青霉烯酶（+）：抑菌圈直徑6 毫米～15 毫米/直徑16 毫米～18 毫米，但散在菌落存在于抑菌圈；碳青霉烯酶（-）：抑菌圈直徑超過19 毫米；中性：直徑16 毫米～18 毫米。②eCIM：陽性：直徑≥5 毫米；陰性：直徑≤4 毫米。③mCIM、eCIM：mCIM 陰性時，不管eCIM 怎樣，報告均為陰性；mCIM 顯示陽性，eCIM 顯示陰性時，報告均為絲氨酸酶；mCIM 顯示陽性，eCIM 顯示陽性，報告顯示金屬酶：mCIM 顯示中性，不管eCIM如何，均不能判斷碳青霉烯酶存在與否，需分子生物學方法進一步檢查核實。

基因測序：以加熱煮沸法做DAN 提取形成PCR 模版，同時擴增碳青霉烯酶，合成4 對基因引物，反應結(jié)束后采取PCR 產(chǎn)物5 微升行凝膠電泳，結(jié)束后，攝像（主要是采用成像儀），保存圖片，對PCR 擴增的陽性產(chǎn)物進行測序，以確定基因亞型。

1.3 觀察指標和評價標準

觀察兩組檢測靈敏度、特異度、陰性與陽性預測值。88 株CRE 行基因檢測出84 株為陽性、4 株為陰性，經(jīng)mCIM、eCIM 聯(lián)合檢測出83 株陽性、5 株陰性（聯(lián)合檢測過程中只要出現(xiàn)1 株陽性即為陽性），經(jīng)mCIM 單獨檢測出76 株陽性、12 株陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)錄入SPSS22.0 軟件中分析，計數(shù)資料用%表示，采用X2檢驗；計量資料用（）表示，采用t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 檢驗效能對比

mCIM、eCIM 聯(lián)合檢測靈敏度（97.62%）高于mCIM 檢測組（88.09%）（P＜0.05），特異度（75.00%）、陰性與陽性預測值（60.00%、98.80%）與mCIM 檢測組（50.00%、16.67%、97.37%）對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1 和表2。

表1 兩種方案檢驗效能對比

表2 兩種方案檢驗效能對比（n，%）

3 討論

隨著抗生素藥物的使用，細菌出現(xiàn)耐藥性在臨床上較為常見，細菌耐藥性已經(jīng)成為世界抗感染治療中重要的問題之一。細菌耐藥性問題的日益嚴重，很容易導致對患者抗感染治療的失敗，不僅會提升人們的患病概率，還會增加患者疾病致死率，且患者會增加一定的治療費用，帶來更大的經(jīng)濟負擔。細菌耐藥性是臨床現(xiàn)階段極其常見的臨床研究，CRE 產(chǎn)生耐藥性在臨床上較為常見，碳青霉烯酶內(nèi)主要攜帶在轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等物質(zhì)上，從而促進環(huán)境中腸桿菌細菌的存儲，并能產(chǎn)生多重耐藥作用。因此需及時檢出耐藥狀況，作出相應的用藥調(diào)整，加快感染的康復[3]，并進一步減少患者抗感染藥物的使用量，減輕患者經(jīng)濟負擔。臨床過往主要以基因測序作為金標準[4]，但此項技術(shù)檢測花費時間較長，且檢查過程較繁重，在臨床上應用受到限制?，F(xiàn)在臨床主要以mCIM 檢測為主，時間相對較短，但單獨使用此項技術(shù)會抵抗美羅培南活性，因此對提高檢測靈敏度的效果不佳[5]，可與eCIM 聯(lián)合，以提升臨床應用價值。mCIM、eCIM 聯(lián)合試驗是將兩張美羅培南試紙同時放置于平板中，以減少對美羅培南活性的抵抗作用，從而共同判定檢測結(jié)果，若將其用于CRE 中的碳青霉烯酶檢測或許對提高靈敏度效果更佳。

本研究結(jié)果表明，88 株CRE 行基因檢測出84株為陽性、4 株為陰性，經(jīng)mCIM、eCIM 聯(lián)合檢測靈敏度（97.62%）高于mCIM 檢測組（88.09%）（P＜0.05），特異度（75.00%）、陰性與陽性預測值（60.00%、98.80%）與mCIM 檢測組（50.00%、16.67%、97.37%）對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明mCIM、eCIM 聯(lián)合試驗對CRE 中的碳青霉烯酶的檢出結(jié)果高，具有較高的臨床應用價值。分析原因可能是單純使用mCIM 試驗時，菌株能產(chǎn)生碳青霉烯酶，可抵抗美羅培南的活性，而eCIM 試驗能有效結(jié)合菌株中的金屬酶，以此產(chǎn)生螯合物，此類物質(zhì)能有效保護美羅培南活性，聯(lián)合使用具有較高的診斷效應。mCIM、eCIM 聯(lián)合試驗主要是將兩類試驗中美羅培南試紙同時浸沒于平板中，達到一定時間后將其撈出，以兩者共同結(jié)果行比對鑒定。在黃軍祉[6]研究中說到，mCIM 試驗主要適用于金屬內(nèi)酰胺酶檢測，當菌株攜帶了碳青霉烯酶時，則及有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。李世榮[7]等學者在研究中表明，mCIM、eCIM 聯(lián)合試驗特異度大于92%，靈敏度大于95%，試驗結(jié)果中出現(xiàn)兩例假陰性，而聯(lián)合試驗對NDM 及KPC 基因的單獨存在時，能區(qū)分金屬酶及絲氨酸酶。雖然此項技術(shù)比傳統(tǒng)檢驗較為復雜，但能加強基因的檢測結(jié)果，從而提高檢測靈敏度，具有較高的診斷效能，臨床應用效果較好。

綜上所述，mCIM、eCIM 聯(lián)合試驗診斷CRE中的碳青霉烯酶的效能更高，臨床應用效果值得肯定。