基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究血府逐瘀湯治療糖尿病腎病的作用機(jī)制

李桂女，李和教，黃 易，余 彬

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海口 570102；2.成都市第一人民醫(yī)院，成都 610041；3.綿陽(yáng)市中心醫(yī)院，綿陽(yáng) 621000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一，屬于微血管并發(fā)癥，是由于長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致代謝及其他功能紊亂而引起的腎小球硬化癥[1]，臨床表現(xiàn)主要為蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球?yàn)V過(guò)率降低，甚至進(jìn)展為腎功能不全、尿毒癥；DN是糖尿病主要的死亡原因之一，亦是增大糖尿病死亡風(fēng)險(xiǎn)的主要原因[2]；相對(duì)于單純的糖尿病患者，DN患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是其12倍，不僅給患者的健康及心理帶來(lái)嚴(yán)重的影響，還給社會(huì)及其家庭帶來(lái)嚴(yán)峻的考驗(yàn)[3-4]。目前，西醫(yī)在治療DN上只能延緩疾病進(jìn)一步發(fā)展，但并未治愈疾病本身，并且治療過(guò)程中長(zhǎng)期服用藥物會(huì)導(dǎo)致藥物依賴性、泌尿道及生殖系統(tǒng)出現(xiàn)感染等不良反應(yīng)，治療效果及患者死亡下降率尚未滿意。因此，尋找治療DN的新方法尤為迫切。

中藥在治療疾病的作用中體現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)及多通路等特點(diǎn)。研究[5]表明，中醫(yī)中藥在臨床上治療DN的效果顯著，尤其在DN前期的治療效果尤佳。中醫(yī)認(rèn)為DN發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氣陰兩虛及血瘀，因此，治療也應(yīng)以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主[6]。血府逐瘀湯（口服液、膠囊）是治療“胸中血府淤血”的常用理血藥方之一，具有活血化瘀、行氣通絡(luò)之效，在臨床上治療DN具有較好的療效，可過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、改善腎微循環(huán)、改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂與高凝狀態(tài)及減少致病性細(xì)胞因子等改善DN患者臨床癥狀[7-8]。但基礎(chǔ)研究較少，血府逐瘀湯治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)及機(jī)制尚不明確。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選血府逐瘀湯的活性成分靶點(diǎn)，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點(diǎn)”和“成分-潛在靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，尋找潛在通路，從整體上對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用進(jìn)行系統(tǒng)和多層次的解析[9]，為更深入研究血府逐瘀湯治療DN的潛在作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血府逐瘀湯活性成分的篩選

以“桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、赤芍、牛膝、柴胡、桔梗、甘草、枳殼、地黃”為關(guān)鍵字，通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及查詢相關(guān)文獻(xiàn)，收集符合口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18條件[10]的活性成分，篩選血府逐瘀湯的活性成分，并且通過(guò)Pub－Chem數(shù)據(jù)查詢活性成分對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式（SMILES）。

1.2 血府逐瘀湯活性成分靶點(diǎn)反向預(yù)測(cè)

通過(guò)將SMILES依次輸入Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]中的Swiss，以“人類”為研究物種預(yù)測(cè)活性成分的靶點(diǎn)，整合去重得到血府逐瘀湯的作用靶點(diǎn)。

1.3 DN的靶點(diǎn)獲取

利用“diabetic nephropathy”為關(guān)鍵詞，對(duì)Gene Card數(shù)據(jù)庫(kù)[12]進(jìn)行疾病靶點(diǎn)的檢索及篩選。整合去除重復(fù)靶點(diǎn)，即可獲得DN的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用韋恩圖（Venn diagram）得到成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，即潛在靶點(diǎn)，使用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)（node）分別為活性成分和潛在靶點(diǎn)；邊（edge）表示三者的相互關(guān)系。使用Cytoscape中Network Analysis插件對(duì)相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（degree）和介數(shù)中心性（betweenness centrality）設(shè)置網(wǎng)絡(luò)樣式，節(jié)點(diǎn)大小反映degree大小，邊的粗細(xì)反映betweenness centrality大小。

1.5 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將血府逐瘀湯治療DN的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，得到潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，將結(jié)果中的node1、node2、combined score信息以TXT格式導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化和Network Analyzer分析，以節(jié)點(diǎn)度值（degree）和介數(shù)中心度（betweenness centrality）大于等于所有點(diǎn)中位數(shù)值2倍的靶點(diǎn)，并滿足接近中心度（closeness centrality）大于所有點(diǎn)中位數(shù)值條件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)作為血府逐瘀湯治療DN的“關(guān)鍵靶點(diǎn)”，研究關(guān)鍵靶標(biāo)可能存在的藥理作用。

1.6 GO富集分析與KEGG通路分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)血府逐瘀湯治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行Gene Ontology分析（生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分3個(gè)層面）和Pathways分析，保存并整理結(jié)果，篩選排名靠前的生物過(guò)程或信號(hào)通路，通過(guò)Omicshare進(jìn)行可視化分析。

1.7 構(gòu)建活性成分-潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)KEGG分析結(jié)果篩選出關(guān)鍵基因富集基因數(shù)相對(duì)較大的通路，通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 血府逐瘀湯的活性成分篩選結(jié)果

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)分別檢索血府逐瘀湯的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)等信息，滿足OB≥30%和DL≥0.18條件的成分作為主要活性成分，共得到活性成分212個(gè)，其中桃仁23個(gè)、紅花22個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、川芎7個(gè)、赤芍29個(gè)、牛膝20個(gè)、柴胡17個(gè)、桔梗7個(gè)、甘草23個(gè)、枳殼5個(gè)、地黃57個(gè)，去重及去除無(wú)結(jié)構(gòu)式的活性成分后有105個(gè)活性成分，部分主要活性成分見(jiàn)表1。

表1血府逐瘀湯主要活性成分信息

2.2 構(gòu)建血府逐瘀湯活性成分-血府逐瘀湯治療DN的潛在靶點(diǎn)藥理網(wǎng)絡(luò)

活性成分-潛在靶點(diǎn)藥理網(wǎng)絡(luò)共包括202個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 249個(gè)邊，該網(wǎng)絡(luò)包含了98個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和104個(gè)潛在靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，見(jiàn)圖1。潛在的活性成分與靶點(diǎn)產(chǎn)生1 436個(gè)相互作用關(guān)系。通過(guò)Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與潛在靶點(diǎn)相互作用的活性成分中，橙皮素（Degree28）、木脂素（Degree27）、刺槐黃素（Degree27）、刺甘草查爾酮（Degree27）、漢黃芩素（Degree26）等與其他靶點(diǎn)連接度大于活性成分的中位數(shù)度值，即與6個(gè)以上靶點(diǎn)連接，是血府逐瘀湯治療DN的主要成分；在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，藥物活性成分可作用于相同的靶點(diǎn)，也可作用于不同的靶點(diǎn)，一種成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)也對(duì)應(yīng)多種成分，這體現(xiàn)了其多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

圖1 血府逐瘀湯的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

使用STRING網(wǎng)站對(duì)得到的血府逐瘀湯治療DN的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析，為獲得更加簡(jiǎn)潔的PPI網(wǎng)絡(luò)，首先刪除自相作用關(guān)系的蛋白邊，然后刪除沒(méi)有相互作用蛋白的節(jié)點(diǎn)，再使用Cytoscape軟件構(gòu)建潛在蛋白質(zhì)-潛在蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。PPI網(wǎng)絡(luò)中有104個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 316個(gè)邊緣。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的大小與其在網(wǎng)絡(luò)中的度值呈正相關(guān)。節(jié)點(diǎn)的度值越大，其在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，相應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)在疾病過(guò)程中有著更重要的作用。而在PPI圖中，用紅色代表度值較大的關(guān)鍵蛋白，在PPI網(wǎng)絡(luò)中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6（Degree74）、TNF（Degree73）、GAPDH（Degree73）、AKT1（Degree70）、VEGFA（Degree62）、IL-1B（Degree62）、IL-2（Degree38）、MMP9（Degree50）、MMP2（Degree39）、STAT1（Degree36）蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的程度較高，大于節(jié)點(diǎn)中位數(shù)對(duì)應(yīng)的度的2倍以上，這些靶點(diǎn)蛋白可能在DN的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，見(jiàn)表2。

圖2 血府逐瘀湯治療DN潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 生物通路富集分析

使用DAVID網(wǎng)站對(duì)血府逐瘀湯治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到P<0.05的富集GO條目共計(jì)109個(gè)，其中包含生物過(guò)程條目共74個(gè)，最顯著的為ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)正調(diào)控、蛋白磷酸化、MAP激酶活性的正調(diào)節(jié)、GTP酶活性的正調(diào)控等；細(xì)胞組成分析結(jié)果共有13條，最顯著的為核質(zhì)、細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等；分子功能分析結(jié)果共有22條，最顯著的為酶活性、ATP結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA結(jié)合等，各類分別取前20條。通過(guò)對(duì)血府逐瘀湯治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析得到P<0.05的通路共76條，包括JAK-STAT信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等，見(jiàn)圖3。此20條作用通路均與血府逐瘀湯治療DN相關(guān)的8個(gè)以上靶基因富集重疊，揭示血府逐瘀湯的有效成分可能通過(guò)作用于以上多條信號(hào)通路來(lái)治療DN。相關(guān)通路信息及富集基因，見(jiàn)表3。

圖3 GO富集分析和KEGG富集分析氣泡圖

表2血府逐瘀湯治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 構(gòu)建血府逐瘀湯活性成分-潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

為研究血府逐瘀湯治療DN的主要作用通路，本研究將血府逐瘀湯治療DN作用的35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白置入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行通路富集分析，刪除結(jié)果中含有特殊疾病信號(hào)通路，并將結(jié)果在Cytoscape軟件中構(gòu)建血府逐瘀湯活性化合物-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。該網(wǎng)絡(luò)共有127個(gè)節(jié)點(diǎn)和289個(gè)邊，該網(wǎng)絡(luò)有77個(gè)血府逐瘀湯中的化合物，27個(gè)主要的DN潛在靶點(diǎn)和13個(gè)通路。其中TNF信號(hào)通路有8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)富集、JAK-STAT信號(hào)通路有4個(gè)靶點(diǎn)富集、HIF-1信號(hào)通路有8個(gè)蛋白富集、Toll樣受體信號(hào)通路有10個(gè)蛋白富集、胰島素抵抗和FoxO信號(hào)通路有9個(gè)蛋白富集，其余通路富集蛋白數(shù)量見(jiàn)表3。

圖4 血府逐瘀湯治療DN的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 KEGG富集通路條目信息

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，DN屬于“消渴證”“尿濁證”范疇，屬于“水腫”和“消渴”類型，腎是主要病位，主要累及脈絡(luò)、脾和肝。血府逐瘀湯中的成分有甘草、生地黃、牛膝、桔梗、枳殼、柴胡、紅花、赤芍、桃仁、川芎和當(dāng)歸。赤芍、川芎和當(dāng)歸不僅可以起到養(yǎng)血療效，還可以活血化瘀；赤芍、枳殼和柴胡主要療效為疏肝理氣；川芎、當(dāng)歸、紅花、生地黃和桃仁不僅可以養(yǎng)陰潤(rùn)燥，還能活血化瘀。一般可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和改善微循環(huán)來(lái)發(fā)揮活血化瘀對(duì)于DN的防治作用。各種藥物一起使用，則可以有效通暢氣血、疏通血脈，起到消腫的療效。DN的生理病理機(jī)制十分復(fù)雜，越來(lái)越多的現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示其可能跟炎性因子、糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激及遺傳因素等多方面[13-14]有關(guān)，共同參與了DN的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。

3.1 血府逐瘀口服液的中藥化學(xué)成分靶標(biāo)分析

在血府逐瘀湯治療DN的成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，包括103個(gè)活性成分和104個(gè)潛在主要靶點(diǎn)，其中有28個(gè)化合物能與20個(gè)及以上靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，包括山柰酚（kaempferol）、黃芩黃素（baicalein）、刺甘草查爾酮（glypallichalcone）、刺槐黃素（acacetin）、木犀草素（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）、表小檗堿（epiberberine）。槲皮素具有抗炎、抗氧化等作用，對(duì)糖尿病并發(fā)癥如DN、視網(wǎng)膜病變等具有較好的療效[15]，還可通過(guò)抑制糖尿病腎臟的氧化和糖化來(lái)控制糖尿病并發(fā)癥[16]。與槲皮素化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的山柰酚具有降空腹血糖、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、抗氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等作用[17-18]。查爾酮類可通過(guò)抑制相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)（p22phox、p47phox mRNA）、轉(zhuǎn)錄及翻譯，降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，減輕腎臟氧化應(yīng)激程度。在臨床治療中，中藥與西藥相比，其治療疾病的作用機(jī)制更為復(fù)雜，但毒性較小，DN發(fā)病機(jī)制主要是高血糖所引起的腎臟血流動(dòng)力學(xué)變化、氧化應(yīng)激、腎組織炎性反應(yīng)增加等。血府逐瘀口服液作用原理主要是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、改善腎微循環(huán)、改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂與高凝狀態(tài)及減少致病性細(xì)胞因子等治療DN。

3.2 血府逐瘀湯治療DN的核心靶標(biāo)分析及關(guān)鍵通路分析

本研究通過(guò)構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及對(duì)相關(guān)的通路進(jìn)行分析，探討血府逐瘀湯治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。對(duì)“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治鰸撛诎悬c(diǎn)，推測(cè)血府逐瘀湯的活性成分主要通過(guò)作用于MAPK8、STAT1、IL-2、MMP2、MTOR、SIRT1、ESR1、MMP9、STAT3、IL-1B、VEGFA、AKT1、TNF、IL-6等關(guān)鍵基因上發(fā)揮調(diào)控DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO富集和KEGG通路富集結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于TNF信號(hào)通路、JKA-STAT信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，涉及ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)正調(diào)控、蛋白磷酸化、MAP激酶活性的正調(diào)節(jié)等生物過(guò)程。炎性因子介導(dǎo)的微炎環(huán)境與DN的發(fā)生發(fā)展存在緊密關(guān)系[19]，產(chǎn)生了極大影響。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1B、IL-6及TNF等炎性因子參與DN病情發(fā)生及進(jìn)展并直接與患者的蛋白尿程度相關(guān)[15]，通過(guò)引起腎小球基底膜厚度增加而加速了2型糖尿病患者終末期腎病的病情進(jìn)展[16-17]。這說(shuō)明改善或抑制DN患者機(jī)體微炎環(huán)境（抑制炎癥因子的分泌等）可影響及優(yōu)化DN患者的預(yù)后和治療效果。絲裂原活化蛋白激酶，即MAP酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與調(diào)控細(xì)胞代謝凋亡及基因表達(dá)等效應(yīng)，活化后的p38MAPK可通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞應(yīng)激、炎性反應(yīng)和凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)DN的發(fā)生、發(fā)展[18，20]；抑制p38MAPK表達(dá)水平可以明顯減少DN的蛋白尿，減輕巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性介質(zhì)的釋放，最終延緩DN的進(jìn)展、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡、降低炎性介質(zhì)水平，對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟組織起保護(hù)作用。而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）是MAPK家族最主要成員，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、凋亡等多種生理反應(yīng)的過(guò)程，是胞內(nèi)介導(dǎo)胞外刺激的重要信號(hào)系統(tǒng)之一[21]。激活ERK1/2信號(hào)通路可誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷、腎間質(zhì)炎癥及纖維化等，參與DN的發(fā)生發(fā)展[22]。也證實(shí)ERK1/2信號(hào)通路激活可促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球的硬化。

JAK2/STAT3信號(hào)途徑參與了多種重要致炎/抗炎細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF）、IL-1等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因調(diào)控過(guò)程[23]，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起腎組織的免疫炎癥性反應(yīng)，通過(guò)氧化應(yīng)激與糖脂代謝交叉調(diào)控進(jìn)而引起糖代謝紊亂[24]；有實(shí)驗(yàn)證明[25-26]，糖尿病大鼠腎小球及系膜細(xì)胞中JAK/STAT途徑活性明顯增強(qiáng)，相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高，而活化的JAK2/STAT3信號(hào)通路可進(jìn)一步刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成及腎小球系膜細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致腎損傷；抑制JAK/STAT信號(hào)通路及其調(diào)控的炎癥因子及纖維化相關(guān)蛋白的活化與表達(dá)，從而對(duì)DN的進(jìn)展起到延緩作用[27]。由此可見(jiàn)，血府逐瘀湯有效活性成分可能通過(guò)參與調(diào)控血漿黏稠程度、血清總膽固醇等血液流變學(xué)保護(hù)腎臟，通過(guò)細(xì)胞凋亡有效清除大量的增生細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)腎臟功能給予有效保護(hù)。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了血府逐瘀湯的化學(xué)成分，治療DN的關(guān)鍵靶點(diǎn)、關(guān)鍵通路，并進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，為后期研究其治療DN的機(jī)制提供參考，為其臨床治療DN提供理論依據(jù)，但其具體的機(jī)制還需通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步確證。