外周血ADAM19 DNA甲基化生物標記物對慢性阻塞性肺疾病的診斷價值

王 霞，侯 嘉

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，銀川 750004）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續(xù)性氣流受限為特征的疾病，其發(fā)生與氣道和肺組織暴露于香煙等有害氣體或顆粒所致的異常炎性反應(yīng)有關(guān)[1]。目前已為全球第三大疾病死因[2-3]。我國成人COPD患病率為7.8%，估算我國有近1億例COPD患者[4]。該疾病早期診斷和有效治療刻不容緩，但臨床缺乏能夠早期診斷和評價疾病活動度的標記分子。COPD的發(fā)病機制與遺傳易感性和環(huán)境暴露有關(guān)，而表觀遺傳與二者關(guān)系緊密[5-6]。表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等，其中DNA啟動子甲基化與COPD的關(guān)系研究較多，但Body區(qū)甲基化的相關(guān)研究較少[7]。通常DNA啟動子甲基化導(dǎo)致基因沉默，去甲基化導(dǎo)致基因活化，而發(fā)生在Body區(qū)作用相反[7-8]。本研究通過篩查COPD患者外周血Illumina 850K芯片全基因組甲基化測序結(jié)果，選出甲基化差異位點及靶標基因，經(jīng)Agena質(zhì)譜法進行驗證，同時擴大樣本量利用RT-PCR法驗證基因表達，通過分析靶標基因與不同臨床特征指標的相關(guān)性，以期尋找能夠早期用于診斷COPD和評估疾病進展的生物標記物。

1 材料與方法

1.1 材料

甲基化擴增引物由美國Sequenom公司設(shè)計合成；ADAM19基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；外周血提取RNA試劑盒購自天根生華科技（北京）有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；DNA甲基化試劑盒、亞硫酸鹽試劑盒、堿性磷酸酶（SAP）處理試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄（IVT）酶切試劑盒、質(zhì)譜試劑均購自美國Sequenom公司。

MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀、SpectroCHIP 384格式芯片、EpiTYPER軟件均為美國Sequenom公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀器為羅氏480。

1.2 研究對象

選擇2020年10月至2021年4月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科住院的COPD患者102名（COPD組）和同期在本院行健康體檢者61例（對照組）作為研究對象。COPD按照2019版GOLD指南標準診斷[9]，并根據(jù)肺功能GOLD分組為GOLD 1（輕度）、GOLD 2（中度）、GOLD 3（重度）、GOLD 4（極重度）。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研倫理委員會批準，并獲得所有研究對象的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 基本臨床資料 收集兩組研究對象的一般資料（包括性別、年齡、吸煙史）；血氣指標：pH、PCO2、PO2，肺功能指標：FEV（1第1秒用力呼氣容積）、FVC（用力肺活量）、FEV1/FVC（一秒鐘用力呼氣容積與用力肺活量的比值）、FEV1%預(yù)計值（第1秒用力呼氣的容積占預(yù)計值的百分比）。COPD組患者依據(jù)PCO2、PO2分組，無呼吸衰竭組（N組）：PO2≥60 mmHg，PCO2≤50 mmHg；Ⅰ型呼吸衰竭組（Ⅰ型組）：PO2＜60 mmHg，PCO2正常或輕度下降；Ⅱ型呼吸衰竭組（Ⅱ型組）：PO2＜60 mmHg，PCO2＞50 mmHg。

1.3.2 篩選Illumina 850 K芯片數(shù)據(jù) 隨機抽取兩組中各8例研究對象，抽取外周靜脈血5 mL，分析外周血的DNA甲基化Illumina 850K芯片數(shù)據(jù)，篩選差異甲基化位點cg07557896，位點靶標基因ADAM19。

1.3.3 Agena質(zhì)譜法驗證外周血DNA甲基化 取若干離心管標記置于冰上，分別吸取20 μL蛋白酶至離心管底部，加入200 μL待測全血；離心管加入200 μL Butter AL，渦旋震蕩15 s混勻，56 °C孵育10 min，4 °C快速離心；分別加入200 μL的無水乙醇，渦旋振蕩15 s混勻，4 °C快速離心；混合物轉(zhuǎn)移至離心柱中，8 000 r·min-1離心1 min；離心柱轉(zhuǎn)移至2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW1，8 000 r·min-1離心1 min；棄濾液，加入500 μL Buffer AW2，14 000 r·min-1離心3 min；離心柱轉(zhuǎn)移到新1.5 mL收集管，加入50 μL洗脫液，室溫孵育1 min，8 000 r·min-1離心1 min，獲取全基因組DNA。使用EZ-96 DNA甲基化試劑盒對每個樣品中共1 mg的基因組DNA進行處理。處理產(chǎn)物進行PCR擴增，擴增片段為200~600 bp，正向引物5′端加入10mer tag平衡PCR反應(yīng)條件；反向引物5′端加入T7-Promoter序列用于后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄（IVT），cg07575896位點正向引物5′aggaagagagTTTTTTGAGTTTTGAGTTT TT GAG3′；反向引物5′cagtaatacgactcactatagggagaaggctTCCACCATTTCTACAT CTACCCT AA3'。擴增體系總共5 μL，其中無酶水1.37 μL、10×Hot－Star Taq buffer 0.50 μL、dNTP mix 0.04 μL、Hot－Star Taq 0.09 μL、Primer Mix 2.00 μL、DNA模板1.00 μL。PCR程序：94℃，10 min；（94℃，45 s；62℃，48 s；72℃，1 min）共10個循環(huán)；（94℃，45 s；57℃，48 s；72℃，1 min）共35個循環(huán)；72℃，3 min。擴增產(chǎn)物進入堿性磷酸酶（SAP）處理：SAP體系總共5.6 μL，其中無酶水1.36 μL、堿性磷酸酶0.24 μL、PCR產(chǎn)物4.00 μL。PCR程序：37 °C，20 min；85°C，5 min。SAP產(chǎn)物進入體外轉(zhuǎn)錄（IVT）和RNase酶切環(huán)節(jié)，體系共7 μL，其中無酶水3.15 μL、5×T7 polymerase buffer 0.89 μL、T Cleavage Mix 0.24 μL、DTT 0.22 μL、T7 DNA Polymerase 0.44 μL、RNAse A 0.06 μL、SAP處理PCR產(chǎn)物2.00 μL。程序：37 °C，3 h。IVT和酶切結(jié)束進入純化，使用點樣儀將純化后產(chǎn)物點至SpectroCHIP 384芯片上，將點制好的芯片放入MassARRAY系統(tǒng)進行檢測。使用MALDI-TOF（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight）基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)檢測數(shù)據(jù)，最后通過EpiTYPER軟件分析并輸出結(jié)果。

1.3.4 RT-PCR檢測外周血ADAM19 mRNA相對表達水平 抽取COPD患者和健康者外周血5 mL，離心柱法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測相關(guān)基因相對表達量?？偡磻?yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，TB Green Premix EXTaqⅡ10 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件（95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；70℃，30 s）共40個循環(huán)；65℃，1 min結(jié)束。ADAM19上游引物：5′-GGCTCTTCAGTTTACACAACAG-3′，下游引物5′-AAAGCTCCACATACTTCATGGA-3′；GAPDH上游引物：5′-CAGG AGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGG CTGGGGCTCATTT-3′。GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔct計算mRNA相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0、SPSS 25.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，對于大樣本符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)使用t檢驗；多組間比較進行方差齊性檢驗，方差不齊采用韋爾齊法，兩兩比較采用非參數(shù)檢驗Tamhane T2法統(tǒng)計，計數(shù)資料采用χ2檢驗。差異甲基化位點的結(jié)果用R軟件IMA 3.1.2進行分析，采用limma中的empirical Bayes statistics方法。同時針對多重假設(shè)檢驗問題，降低假陽性率，計算錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正的P值。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選Illumina 850K芯片甲基化測序結(jié)果

應(yīng)用GenomeStudio軟件進行分析，采用Illumina官方Methylation Analysis Algorithms進行芯片原始數(shù)據(jù)的提取、質(zhì)量控制分析、校正。每個CpG位點的甲基化程度用β值表示，范圍為0～1，Δβ代表COPD組與對照組CpG位點的差異甲基化程度，Δβ＞0為高甲基化，Δβ＜0為低甲基化。Δβ絕對值越大，其差異甲基化程度越高。根據(jù)差異位點的P值和β值篩選差異甲基化位點cg07557896。與對照組相比，在COPD組發(fā)現(xiàn)差異甲基化位點cg07557896發(fā)生高甲基化，位于Body區(qū)（起始密碼子ATG和終止密碼子之間的區(qū)域）（Δβ=0.08，P＜0.05），對應(yīng)基因為ADAM19，位于5號染色體。與對照組相比，COPD組中ADAM19 DNA發(fā)生最大差異甲基化區(qū)域（DMR）（P＜0.05），見圖1。

圖1 DNA最大差異甲基化區(qū)域（DMR）圖

2.2 研究對象基本資料

兩組在年齡，性別，吸煙史方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。COPD組肺功能指標FEV1/FVC和FEV1%預(yù)計值均低于對照組（P均＜0.001），見表1。

表1 COPD組和對照組的不同臨床特征比較

2.3 兩組甲基化位點cg07575896中CpG4甲基化水平比較

Agena質(zhì)譜法檢測兩組甲基化位點cg07575896中CpG4甲基化水平結(jié)果顯示，COPD組CpG4位點的甲基化水平高于對照組（P＜0.05），見圖2。

圖2 兩組cg07575896_CpG4位點甲基化程度比較

2.4 兩組外周血中ADAM19 mRNA相對表達水平比較

RT-PCR檢測外周血中ADAM19 mRNA的相對表達量，結(jié)果顯示，與對照組相比，COPD組ADAM19 mRNA表達上調(diào)（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組外周血中ADAM19 mRNA相對表達水平比較

2.5 外周血中ADAM19基因?qū)OPD的預(yù)測價值

ROC曲線分析外周血中ADAM19基因?qū)OPD的預(yù)測價值：曲線下面積（AUC）為0.78，截斷值為1.19，約登指數(shù)為0.45，靈敏度為62.1%，特異度為82.9%，95%CI：0.71~0.85，P＜0.001，見圖4。

圖4 ADAM19在COPD疾病中診斷ROC曲線

2.6 COPD患者不同GOLD分級肺功能與ADAM19 mRNA相對表達量的關(guān)系

COPD患者依據(jù)肺功能GOLD分級分為GOLD1、GOLD2、GOLD3、GOLD4組。FEV1、FVC、FEV1%預(yù)計值在GOLD2、GOLD3、GOLD4組均低于GOLD1組（P均<0.05）；GOLD3、GOLD4組的FEV1/FVC比值低于GOLD1組（P均＜0.05）；與GOLD2組相比，F(xiàn)EV1/FVC、FEV1%預(yù)計值在GOLD3、GOLD4組均降低（P均＜0.05），GOLD4組FEV1低于GOLD2（P＜0.05）。COPD組患者外周血中ADAM19mRNA相對表達GOLD4組均高于GOLD1、GOLD2、GOLD3組（P均＜0.05），見表2、圖5。

圖5 ADAM19 mRNA相對表達量與COPD患者肺功能GOLD不同分級的關(guān)系

表2 COPD患者不同GOLD分級肺功能指標比較

2.7 COPD患者不同呼吸衰竭類型與ADAM19 mRNA相對表達量的關(guān)系

與N組比較，Ⅰ型、Ⅱ型組COPD患者PO2、SO2降低，Ⅱ型組PCO2升高（P均＜0.05）；與N組比較，ADAM19的mRNA表達量在Ⅱ組中增加（P＜0.05），見表3、圖6。

圖6 不同呼吸衰竭類型ADAM19 mRNA相對表達量比較

表3 COPD患者不同呼吸衰竭類型PO2、PCO2、SO2的比較

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要方式，不改變NDA序列，調(diào)節(jié)靶基因異常表達[10]。COPD是一種受遺傳和環(huán)境因素影響的慢性疾病。長期暴露于環(huán)境污染，如香煙煙霧等，可引起DNA甲基化改變，參與COPD的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。

本研究在COPD患者外周血中發(fā)現(xiàn)ADAM19表達升高，可能受cg07575896位點高甲基化調(diào)控導(dǎo)致。相關(guān)研究[13-15]顯示，ADAM19是細胞表面的糖蛋白，在信號通路、蛋白水解活性、細胞活性和形態(tài)發(fā)生等方面有廣泛作用。ADAM19基因表達改變會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，在肺纖維化中TGF-α上調(diào)ADAM19從而促進細胞外基質(zhì)沉積和肺瘢痕形成[16]。Melenhorst等[17]發(fā)現(xiàn)ADAM19在腎臟惡性腫瘤中表達升高，可能參與促腎臟纖維化和促炎發(fā)生。實驗研究發(fā)現(xiàn)，ADAM19表達隨著COPD患者肺功能GOLD分級升高而上調(diào)，提示外周血ADAM19的表達與COPD患者肺功能損傷程度呈一致性。同樣地，COPD患者呼吸衰竭程度與ADAM19的表達量也存在相關(guān)性。ADAM19可能涉及COPD的發(fā)病機制，和炎癥、神經(jīng)肌肉、肺的發(fā)育等有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周血高甲基化位點cg07575896及高表達ADAM19可作為COPD疾病早期診斷和病情活動度評價的指標，未來還需大樣本、多中心、前瞻性研究加以驗證。此外，ADAM19參與COPD發(fā)病的具體機制尚需進一步研究闡明。