NOD蛋白在漿細(xì)胞性乳腺炎患者病變組織中的表達(dá)

徐政杰，方 堃，姜蘇曉，張 萍

（銀川市婦幼保健院外科，銀川 750004）

漿細(xì)胞性乳腺炎（plasma cell mastitis，PCM）是一種特殊的乳腺炎，易被誤診為炎癥性乳腺癌[1-2]。PCM好發(fā)于非哺乳期的年輕女性，常表現(xiàn)為乳頭后腔腫塊，乳頭和分泌物倒置。最常見的并發(fā)癥是乳腺瘺[3]。手術(shù)切除是有效的治療方法[4]。如治療不及時(shí)或手術(shù)切除不徹底，可能導(dǎo)致全乳房切除，還可能罹患抑郁癥甚至威脅患者生命。因此探索合適的檢測指標(biāo)具有重要的研究意義[5]。核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域受體（NOD）1和NOD2蛋白是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族兩個(gè)主要成員，與其配體結(jié)合后可以激活下游的受體相互作用蛋白2（RIP2），繼而引起炎性反應(yīng)[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，NOD與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，NOD樣蛋白的激活最終導(dǎo)致Caspase-1通路半胱氨酸天冬氨酸酶激活介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。而NOD1、NOD2蛋白與PCM發(fā)病之間的聯(lián)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究主要通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測PCM病灶組織和正常組織中NOD1、NOD2的mRNA和蛋白水平的變化，探討NOD1、NOD2蛋白與PCM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇銀川市婦幼保健院2018年1月至2020年1月收治入住的26例PCM患者資料，均為經(jīng)產(chǎn)婦，產(chǎn)后1.5～6.0年發(fā)病，年齡23～36歲，平均年齡（26.15±5.21）歲，病程1～12個(gè)月；其中雙側(cè)PCM 1例（4%），左側(cè)PCM 9例（35%），右側(cè)PCM 16例（61%）。收集患者的病變組織樣本，同時(shí)采集炎性腫塊組織樣本及距離炎性腫塊邊緣≥3 cm且鏡檢為正常乳腺組織的樣本。所有組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后立即無菌操作于磷酸鹽緩沖液（PBS）沖凈后放入5 mL的EP管中，標(biāo)記好后放入液氮罐中暫存，并迅速轉(zhuǎn)移保存于-80℃低溫冰箱中備用。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)[8-10]

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）患者均經(jīng)皮組織病理活檢確診為PCM；2）不同程度地存在乳房腫塊，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果提示陰性；3）均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）有惡性腫瘤者；2）有自身免疫性疾病者；3）有肝腎功能障礙或伴有其他系統(tǒng)疾病者；4）有血液疾病者。

1.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

提取PCM患者乳腺炎性腫塊組織（PCM組）和距離炎性腫塊邊緣≥3 cm且鏡檢為正常乳腺組織（正常乳腺組）的總RNA后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將1 000 ng的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍后用DNA熒光染料（SYBR Green）法檢測mRNA的表達(dá)量。選取GAPDH作為內(nèi)參基因，在CFX Manger軟件系統(tǒng)中，采用2－ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，引物序列見表1，該引物由上海生工生物工程有限公司合成。RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑由大連寶生物工程提供，SYBR Green染料購于瑞士Roche公司。

表1 NOD1、NOD2引物序列

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

采用含苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取凍存的PCM炎性腫塊組織及正常乳腺組織的總蛋白，用蛋白質(zhì)定量（BCA）法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白，然后利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到活化的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h。用1×PBST洗膜3次，每次15 min，一抗4℃敷育過夜。用1×PBST洗滌膜，二抗常溫下敷育2 h。洗膜，顯影，分析條帶。Anti-NOD1抗體（1∶1 000，Proteintech，中國），Anti-NOD2抗體（1∶1 000，Proteintech，中國），Anti-β-actin內(nèi)參抗體（1∶5 000，Proteintech，中國），Mouse源二抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國），Rabbit源二抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用軟件Image Pro Plus進(jìn)行處理，并分析組間條帶灰度值的差異（蛋白定量分析=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值）。RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜、10×PBST及BCA蛋白定量試劑盒均購于碧云天生物科技有限公司（中國）；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司（中國）；脫脂奶粉購于BD公司（美國）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCM組與正常乳腺組樣本中NOD1和NOD2 mRNA表達(dá)及相關(guān)性分析

PCM組炎性腫塊中NOD1、NOD2 mRNA水平均高于正常乳腺組（P均＜0.05）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示NOD1和NOD2 mRNA水平呈正相關(guān)（r=0.963 2，P＜0.05），見圖1。

圖1 PCM患者乳腺炎性組織與正常組織中NOD1、NOD2 mRNA表達(dá)及相關(guān)性

2.2 PCM及正常乳腺組樣本中NOD1和NOD2蛋白表達(dá)及相關(guān)性分析

以β-actin為內(nèi)參，PCM組炎性腫塊中NOD1、NOD2蛋白均較正常乳腺組升高（P均＜0.01）。Pearson相關(guān)分析顯示，NOD1蛋白表達(dá)水平與NOD2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.997 2，P＜0.05），見圖2。

圖2 PCM組與正常乳腺組中NOD1與NOD2蛋白表達(dá)及相關(guān)性

3 討論

PCM是乳腺實(shí)質(zhì)的炎性疾病，其特征是導(dǎo)管周圍炎性反應(yīng)，伴有導(dǎo)管擴(kuò)張。本病由于缺乏診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，主要結(jié)合臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)和輔助檢查進(jìn)行綜合分析，在排除乳腺結(jié)核和特異性肉芽腫性病變的基礎(chǔ)上進(jìn)行診斷[11]。PCM病因不明，其治療后復(fù)發(fā)概率較大且病程長，不恰當(dāng)和不規(guī)則的治療方式常使PCM患者病情加重，甚至需后期采取根治性病灶措施及乳腺切除術(shù)[12]。

目前，有研究[13]表明，NOD1與NOD2蛋白與炎癥及免疫性疾病呈正相關(guān)，像Toll樣受體（Tolllike receptors，TLR）一樣，NOD1和NOD2屬于免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體（PRR），用于識(shí)別多種細(xì)菌和病毒抗原，從而通過炎性細(xì)胞因子來組織免疫防御。NOD1、NOD2已被證明在牙周炎[14]、特發(fā)性皮炎[15-16]、過敏性哮喘[17]、克羅恩病[18]和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）[19-20]中均有表達(dá)，并且NOD1或NOD2的激活產(chǎn)生與TLR協(xié)同促炎作用和破壞性介質(zhì)的作用，能夠在RA的慢性和破壞性炎癥中發(fā)揮重要作用[21-22]。

徐丹丹等[23]在利用金黃色葡萄球菌構(gòu)建的小鼠乳腺炎模型中發(fā)現(xiàn)，隨著NOD1、NOD2 mRNA表達(dá)升高，其下游RIP2、NF-KB、IL－6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的mRNA表達(dá)水平也升高，表明NOD1、NOD2可能參與金黃色葡萄球菌的識(shí)別及下游通路的激活，從而參與乳腺免疫應(yīng)答。提示NOD1和NOD2蛋白可能在乳腺炎致病過程中發(fā)揮作用，但在人乳腺炎中的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，NOD1、NOD2 mRNA水平在PCM炎性病灶中較正常乳腺組織中升高；同時(shí)在病灶中NOD1、NOD2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。Western blot檢測結(jié)果也顯示，上述兩種蛋白的表達(dá)在PCM病灶中較正常乳腺組織升高；而NOD1和NOD2蛋白的表達(dá)水平在PCM病灶中亦呈正相關(guān)，說明兩者在PCM的致病過程中可能共同發(fā)揮促炎作用，在一定程度上說明NOD1及NOD2蛋白參與了PCM的發(fā)病，為探索新的診斷標(biāo)記物提供了新的思路，對(duì)漿細(xì)胞性乳腺炎開展分子靶向治療具有一定的參考價(jià)值。但由于本研究僅從轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)層面對(duì)NOD1及NOD2的差異表達(dá)及兩者相關(guān)性進(jìn)行了檢驗(yàn)，有一定局限性。