維生素D干預(yù)對(duì)再次體外受精鮮胚移植結(jié)局的影響

宋國(guó)紅，趙君利

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，銀川 750021；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，銀川 750004）

維生素D（vitamin D）是人體必需的一種維生素，其活化代謝物為1，25-（OH）2D3，機(jī)體主要通過(guò)自身合成以及從食物中攝取獲得。多年來(lái)，人們對(duì)維生素D的研究?jī)H集中在對(duì)鈣、磷、骨代謝的調(diào)節(jié)。Parikh等[1]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D能提高芳香化酶的活性，增加孕酮（progesterone，P）、雌激素、雌酮等在人類卵巢細(xì)胞中的產(chǎn)生，1，25-（OH）2D3可使人黃素化顆粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的P，為胚胎著床提供更佳的子宮內(nèi)膜環(huán)境。1，25-（OH）2D3還可參與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞HOXA基因的表達(dá)[2]，影響子宮內(nèi)膜的容受性及胚胎的種植[3]。維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）廣泛存在于人體的多種組織細(xì)胞中。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，敲除VDR及1α-羥化酶后的小鼠模型，其子宮發(fā)育不良、卵泡生成障礙、卵巢血管因子表達(dá)水平下降。目前雖然對(duì)維生素D與體外受精（in vitro fertilization，IVF）-胚胎移植（embryo transplantation，ET）技術(shù)結(jié)局關(guān)系的研究較多，但結(jié)論差異較大。故本課題擬研究IVF鮮胚移植失敗者血清25（OH）D水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討維生素D干預(yù)能否對(duì)再次IVF鮮胚移植結(jié)局產(chǎn)生影響，以期為臨床診治工作提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月至2019年1月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心前次長(zhǎng)方案行IVF鮮胚移植失敗后擬再次行IVF鮮胚移植的不孕患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡20～42歲；2）不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩?、卵巢?chǔ)備功能下降、排卵功能障礙、不明原因；3）男方因素不育。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）有輔助生殖助孕技術(shù)禁忌證者；2）內(nèi)分泌代謝性疾病者；3）生殖系統(tǒng)發(fā)育異常者。

1.2 分組

1）根據(jù)2011年《美國(guó)內(nèi)分泌協(xié)會(huì)臨床實(shí)踐指南》及我國(guó)2014年《維生素D與成年人骨骼健康應(yīng)用指南》，將維生素D的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)劃分為維生素D適宜［血清25（OH）D＞30 ng·mL-1］、維生素D不足（A組）［20 ng·mL-1≤血清25（OH）D≤30 ng·mL-1］4例、維生素D缺乏（B組）［10 ng·mL-1≤血清25（OH）D＜20 ng·mL-1］35例、維生素D重度缺乏（C組）［血清25（OH）D＜10 ng·mL-1］12例，轉(zhuǎn)換系數(shù)：2.5 nmol·L-1血清25（OH）D=1 ng·mL-1血清25（OH）D。2）我國(guó)體質(zhì)量分組標(biāo)準(zhǔn)（中國(guó)肥胖問(wèn)題工作組，2001）。根據(jù)體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）將所有研究對(duì)象分為消瘦（BMI＜18.5 kg·m-2）、正 常（18.5 kg·m-2≤BMI＜24 kg·m-2）、超重（24 kg·m-2≤BMI＜28 kg·m-）2及肥胖（≥28 kg·m-2）4組。3）根據(jù)研究對(duì)象的年齡將其分為高齡（≥35歲）組與非高齡（＜35歲）組。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本收集及測(cè)定 檢測(cè)擬再次行IVF鮮胚移植的患者血清25（OH）D的水平。對(duì)血清25（OH）D＜30 ng·mL-1的患者均給予維生素D210 mg，2周/次，肌肉注射3次+碳酸鈣D3片500 mg·d-1/次，口服治療6周后再次進(jìn)入IVF周期行鮮胚移植。檢測(cè)移植日患者空腹血清雌二醇（estradiol，E2）及P水平。

1.3.2 治療方案及獲卵 所有患者均采用長(zhǎng)方案，即于患者月經(jīng)周期第19～22天給予皮下注射長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（達(dá)菲林，注射用醋酸曲普瑞林）0.935 mg，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，即給予外源性促性腺激素（gonadotropins，Gn）進(jìn)行控制性超促排卵。根據(jù)患者血清E2、P、促黃體生成素（LH）水平及卵泡發(fā)育情況調(diào)整Gn劑量，當(dāng)至少有一個(gè)卵泡直徑＞18 mm或2個(gè)卵泡直徑＞17 mm或3個(gè)卵泡直徑＞16 mm時(shí)，當(dāng)日晚9時(shí)皮下注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）2 000 U+注射用重組人絨促性素（艾澤，德國(guó)默克雪蘭諾公司）250 μg，36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺采卵。統(tǒng)計(jì)患者Gn使用總天數(shù)及Gn總用量，記錄取卵日的總獲卵數(shù)。

1.3.3 ET卵母細(xì)胞培養(yǎng)4～6 h行常規(guī)IVF，在實(shí)驗(yàn)室觀察，第2次減數(shù)分裂中期的成熟卵母細(xì)胞又稱為MⅡ卵，其具備受精能力；精卵結(jié)合后，細(xì)胞核會(huì)分別形成1個(gè)原核，當(dāng)有2個(gè)原核即為2PN，說(shuō)明正常授精，記錄MⅡ卵數(shù)及2PN數(shù)。胚胎受精48 h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分，若卵裂球細(xì)胞大小一致、數(shù)目為7～9個(gè)，無(wú)核碎片≤20%則為優(yōu)質(zhì)胚胎[5]。對(duì)于滿足鮮胚移植條件的患者，選擇1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。于移植當(dāng)日行陰道B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜形態(tài)及厚度，對(duì)于子宮內(nèi)膜的不同形態(tài)臨床用A、B、C型表示。

1.3.4 妊娠確定ET后第14天測(cè)得血清HCG陽(yáng)性確定妊娠，移植后28 d行陰道超聲檢測(cè)提示宮腔內(nèi)可見(jiàn)妊娠囊則診斷為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，維生素D干預(yù)前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同BMI患者血清25（OH）D水平比較

結(jié)果顯示，消瘦、正常、超重、肥胖組血清25（OH）D水平分別為（10.05±3.32）、（13.93±4.91）、（13.59±4.47）、（9.60±4.24）ng·mL-1，各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.388，P=0.454）。

2.2 不同年齡患者血清25（OH）D水平比較

高齡組與非高齡組患者血清25（OH）D水平分別為（12.84±4.04）、（14.01±5.22）ng·mL-1，不同年齡組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.402）。

2.3 不同血清25（OH）D水平患者臨床指標(biāo)比較

A、B、C三組患者的年齡、BMI、抗繆勒氏管激素（anti mullerian hormone，AMH）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）及甲狀腺素（thyroxine，T4）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表1。

2.4 維生素D干預(yù)前、后IVF鮮胚移植相關(guān)指標(biāo)比較

干預(yù)前后患者Gn天數(shù)、Gn用量、ET日子宮內(nèi)膜形態(tài)及厚度、移植日血清E2、P水平及E2/P差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），而獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)在維生素D干預(yù)后均優(yōu)于維生素D干預(yù)前（P均＜0.05），見(jiàn)表2。

表1不同血清25（OH）D水平患者臨床指標(biāo)比較（±s）

表1不同血清25（OH）D水平患者臨床指標(biāo)比較（±s）

組別A組B組C組F值P值n 4 3 5 12年齡/歲 AMH/（ng·mL-1）BMI/（kg·m-2）TSH/（mIU·L-1）T3/（nmol·L-1） T4/（nmol·L-1）31.50±5.97 1.63±0.63 20.90±1.69 1.79±0.41 1.63±1.00 5.94±3.45 32.80±4.71 2.89±2.41 22.26±3.26 2.83±1.56 1.27±0.56 7.06±2.51 32.42±4.32 2.68±2.00 22.30±3.62 2.65±1.48 1.57±0.87 6.63±3.38 0.150 0.572 0.562 1.119 1.235 0.346 0.861 0.568 0.574 0.336 0.300 0.709

2.5 不同血清25（OH）D水平患者維生素D干預(yù)后臨床妊娠率及活產(chǎn)率比較

A、B、C三組患者臨床妊娠率分別為25.00%、22.86%和41.67%，活產(chǎn)率分別為25.00%、14.29%和41.67%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.601，P=0.449；χ2=3.991，P=0.136）。

表2維生素D干預(yù)前、后IVF鮮胚移植相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表2維生素D干預(yù)前、后IVF鮮胚移植相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

相關(guān)因素 干預(yù)前 干預(yù)后 t值 P值Gn天數(shù)/d 10.45±3.10 11.25±3.41 1.469 0.148 Gn用量/U 2 009.10±690.03 2 262.49±863.18 1.976 0.054獲卵數(shù)/個(gè) 6.67±3.84 8.41±4.80 3.534 0.001 MⅡ卵數(shù)/個(gè) 5.37±3.3 2.77±2.46 7.14±4.00 3.841 0.001 2PN數(shù)/個(gè) 6 4.26±3.33 3.070 0.003 ET日子宮內(nèi)膜厚度/cm 12.86±2.35 12.56±2.52 1.017 0.310 ET日子宮內(nèi)膜形態(tài) 2.14±0.45 2.24±0.47 1.218 0.229 ET日E2/（pg·mL-1） 894.29±854.90 1 080.79±981.94 1.421 0.161 ET日P/（ng·mL-1） 90.63±60.33 85.51±45.18 0.521 0.605 ET日E2/P 11.39±13.50 13.93±13.01 1.059 0.290

3 討論

血清25（OH）D在整個(gè)月經(jīng)周期中波動(dòng)較小[6]，且易測(cè)量、結(jié)果較準(zhǔn)確。故本次研究以接受IVF鮮胚移植患者月經(jīng)周期任意一天的空腹血清25（OH）D水平為樣本。因?yàn)檠?5（OH）D為親脂性分子，更易儲(chǔ)存于人體脂肪組織。研究[7]表明，肥胖與體內(nèi)維生素D水平相互影響，多囊卵巢綜合征（PCOS）患者維生素D水平與BMI呈負(fù)性相關(guān)。Wehr等[8]采用多元回歸分析研究也發(fā)現(xiàn)血清25（OH）D水平與BMI、腰圍、腰臀比、血壓、空腹和刺激后葡萄糖水平、葡萄糖曲線下面積、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)HOMA－IR等呈負(fù)相關(guān)。Parikh等[1]研究發(fā)現(xiàn)，成人BMI每增加1 kg·m-2，血清25（OH）D濃度就下降0.75 nmol·L-1。Stokic′等[9]對(duì)50例肥胖患者的研究同樣也證實(shí)，高BMI個(gè)體較低BMI個(gè)體的血清25（OH）D水平降低。這不僅因肥胖者戶外活動(dòng)減少導(dǎo)致日照減少，也與其維生素D的生物合成效率明顯下降有關(guān)。本研究中患者BMI范圍為16.2~35.7 kg·m-2，根據(jù)BMI的水平將患者分為消瘦、正常、超重、肥胖組，各組間血清25（OH）D水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)榇舜窝芯繕颖玖坑邢?，且進(jìn)入IVF周期的患者臨床醫(yī)師會(huì)建議其進(jìn)行飲食控制及體質(zhì)量管理。

AMH基因僅表達(dá)于性腺，AMH由顆粒細(xì)胞分泌，在女性中的生理作用主要體現(xiàn)為參與卵泡形成過(guò)程中二次重要募集，即調(diào)控卵泡起始募集和參與調(diào)控卵泡生長(zhǎng)發(fā)育至成熟卵泡的周期募集。研究[10-11]證明，AMH可以反映女性原始卵泡的庫(kù)存情況，能較好地評(píng)估卵巢儲(chǔ)備能力及預(yù)測(cè)卵巢低反應(yīng)。Merhi等[12]研究表明，在卵巢顆粒細(xì)胞中，維生素D參與AMH信號(hào)通路，1，25-（OH）2D3可改變顆粒細(xì)胞對(duì)AMH的敏感性，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的分化與發(fā)育。本研究中患者的AMH與血清25（OH）D水平不存在相關(guān)性，這與有關(guān)研究[13]結(jié)果相同。有研究[14]表明，甲狀腺功能與維生素D之間有復(fù)雜的相互作用，甲狀腺激素能抑制25（OH）D 1α－羥化酶分泌。此外，維生素D能抑制TSH分泌，從而對(duì)甲狀腺濾泡細(xì)胞產(chǎn)生直接效應(yīng)。然而，有關(guān)維生素D與甲狀腺功能的研究很少，結(jié)果也不盡相同，本研究發(fā)現(xiàn)鮮胚移植患者的T3、T4、TSH水平與其血清25（OH）D水平均無(wú)相關(guān)性。但因本生殖中心前次IVF鮮胚移植失敗后再次行鮮胚移植的患者人數(shù)較少，血清25（OH）D水平對(duì)不孕患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)的預(yù)測(cè)作用尚待后續(xù)研究補(bǔ)充。

卵子質(zhì)量直接影響妊娠結(jié)局。研究[15]發(fā)現(xiàn)，維生素D可抑制AMH基因的表達(dá)，上調(diào)促卵泡刺激素受體基因表達(dá)，在卵泡發(fā)育成熟并成功排卵過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VDR發(fā)生無(wú)效突變后，可導(dǎo)致卵巢功能過(guò)早衰退，直接影響卵子質(zhì)量[16]。萬(wàn)彥伶等[17]也認(rèn)為，維生素D可調(diào)節(jié)卵泡的募集，也可通過(guò)影響卵巢性激素的水平來(lái)干擾卵泡的成熟與排卵。這與本研究中給予維生素D干預(yù)后患者獲卵數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目提高的結(jié)論相符。也有研究[18]結(jié)論與之相反，認(rèn)為VDR與卵子質(zhì)量無(wú)關(guān)。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，只有在短暫的特定時(shí)期內(nèi)，子宮內(nèi)膜才允許胚胎著床，這一時(shí)期稱為“著床窗口期”。Vitiello等[2]認(rèn)為1，25-（OH）2D3參與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞HOXA10/11基因的表達(dá)，從而影響子宮內(nèi)膜的容受性及胚胎的種植。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，維生素D可通過(guò)調(diào)節(jié)胎盤泌乳素、HCG的合成和分泌，營(yíng)養(yǎng)子宮內(nèi)膜，維持黃體功能。一項(xiàng)通過(guò)對(duì)供卵周期的研究[19]認(rèn)為，維生素D可能并不影響卵子質(zhì)量，而是通過(guò)影響子宮內(nèi)膜從而影響妊娠率。內(nèi)膜的樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生1α－羥化酶及1，25-（OH）2D3，而1，25-（OH）2D3能與子宮內(nèi)膜上的VDR結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因，如鈣結(jié)合蛋白、骨調(diào)素等，而這些靶基因與胚胎植入和胎盤形成有著重要關(guān)系。一項(xiàng)回顧性分析顯示[20]，扳機(jī)日血清P和E2水平的平衡是提高子宮內(nèi)膜容受性、維持妊娠的必要條件，P/E2可以較好地預(yù)測(cè)IVFET妊娠結(jié)局。本研究將維生素D干預(yù)前后患者子宮內(nèi)膜形態(tài)及厚度、移植日血清E2、P及E2/P進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明維生素D水平可能不是通過(guò)影響子宮內(nèi)膜及血清激素水平而影響妊娠結(jié)局，但仍需大樣本進(jìn)一步研究。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)維生素D與IVF-ET結(jié)局關(guān)系的研究較多，但結(jié)論差異較大。有研究[19，21-22]認(rèn)為，不孕癥患者普遍存在維生素D缺乏，IVF-ET患者的妊娠率下降可能與維生素D缺乏有關(guān)。Polyzos等[21]研究結(jié)果顯示，維生素D缺乏是導(dǎo)致低臨床妊娠率的獨(dú)立因素。一項(xiàng)對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能良好的IVF-ET女性的研究結(jié)果[23]也同樣顯示，維生素D缺乏是不孕癥發(fā)生及影響IVF-ET結(jié)局的重要因素。Aleyasin等[15]在接受輔助生殖技術(shù)治療的82例不孕婦女中發(fā)現(xiàn)，血清和卵泡液中的25（OH）D水平和IVF結(jié)局無(wú)明顯的相關(guān)性。Irani等[24]Meta分析結(jié)果顯示，維生素D水平并不能預(yù)測(cè)IVF-ET結(jié)局。這與本研究中維生素D干預(yù)對(duì)IVF鮮胚移植者的妊娠率及活產(chǎn)率無(wú)明顯影響的結(jié)論一致。也有研究[18]結(jié)果顯示，過(guò)高的維生素D水平能夠使胚胎質(zhì)量下降，可降低IVF-ET患者的臨床妊娠率。

綜上所述，IVF鮮胚移植失敗患者的血清維生素D水平與其年齡、BMI、AMH及甲狀腺體功能無(wú)相關(guān)性。維生素D干預(yù)治療可以改善不孕患者的卵巢功能及卵子質(zhì)量，對(duì)IVF鮮胚移植患者的妊娠結(jié)局無(wú)明顯影響。由于本研究樣本量的局限性，對(duì)維生素D參與調(diào)節(jié)鮮胚移植及對(duì)人類生殖系統(tǒng)功能的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。