基質(zhì)金屬蛋白酶-7、9基因多態(tài)性與卵巢癌遺傳易感性的相關(guān)性研究

胡 鵬，朱小鵬

（鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院，湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院腹盆腫瘤內(nèi)科，黃石 435000）

卵巢癌是女性較為常見的生殖器官惡性腫瘤，2018年全球的卵巢癌新發(fā)病例數(shù)約為30萬，占惡性腫瘤的1.6%，而死亡病例數(shù)約為18萬（1.9%），并且發(fā)病率和死亡率呈逐年增長趨勢，對女性健康造成嚴(yán)重威脅[1]。單核苷酸多態(tài)性是基因變異的常見形式，每1 000個核苷酸即存在1個單核苷酸多態(tài)性位點，與腫瘤的發(fā)生聯(lián)系密切[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）均屬于MMP家族成員，其表達(dá)異常與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。rs138970782位點和rs3918255位點分別位于MMP-7和MMP-9上，其對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響仍缺乏研究。本研究檢測卵巢癌患者M(jìn)MP-7和MMP-9的基因多態(tài)性，旨在探討二者基因多態(tài)性與卵巢癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年2月至2020年12月在鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院接受治療的90例卵巢癌患者作為研究對象，并將其納入卵巢癌組。選擇同期在本院接受體檢的90名健康體檢者作為對照組。卵巢癌組年齡45~66歲，平均年齡（52.34±4.34）歲，其中包括低分化42例、中分化29例以及高分化19例。FIGO分期Ⅰ期31例，Ⅱ期14例，Ⅲ期36例，Ⅳ期9例。對照組年齡45~66歲，平均年齡（52.34±4.34）歲，研究對象對本研究具有知情權(quán)并簽署知情同意書，本研究獲本院倫理委員會的同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）卵巢癌患者經(jīng)過病理學(xué)診斷確診；2）臨床相關(guān)資料完整；3）預(yù)計生存時間超過3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并除卵巢癌外的其他腫瘤者；2）有放化療治療史者；3）接受卵巢癌根治術(shù)者。

1.2 主要試劑與儀器

10×Takara buffer購自美國Takara生物科技有限公司（貨號：9151N）。蝦堿酶（shrimp alkaline enzyme，SAP）購自哈爾濱新?；驒z測有限公司（貨號：C4901A，規(guī)格：500 U）。血漿DNA抽提試劑盒購自美國默克生命科技有限公司（貨號：NA2010-1KT）。ABI PCR儀購自美國ABI科技有限公司（型號：ABI9700）。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行合成。核酸外切酶Ⅰ（exonucleaseⅠ，ExonⅠ）購自美國賽默飛世爾生物科技有限公司（貨號：EN0581，規(guī)格：4 000 U）。Snapshot mix購自美國ABI科技有限公司（貨號：4323154）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本收集 采集患者晨起空腹血液4 mL于抗凝管中，2 500 r·min-1離心10 min分離血漿。采用血漿DNA抽提試劑盒對血液中的DNA進(jìn)行抽提，操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 MMP-7和MMP-9基因產(chǎn)物PCR采用Snapshot技術(shù)進(jìn)行MMP-7和MMP-9基因分型。PCR擴(kuò)增包含MMP-7的rs138970782位點及MMP-9的rs3918255位點的DNA片段，MMP-7上游引物序列為5’-AGTGCGACACGCCCACCATA-3’，下游引物序列為5’-CGTGCGCGTACGGG TTTCTTTCA-3’。MMP-9上游引物序列為5’-TGGTACGCTGTCCTCAATGG-3’，下游引物序列為5’-TTCAAGGCAGGGAAGCATCGTGA-3’。PCR體系：4.13 μL水，1 μL的10×Takara buffer，1.2 μL的dNTP，0.6 μL的MgCl2，上下游引物各1 μL、0.07 μL的Takara Taq，1 μL的DNA（20 ng·μL-1），體積總共10 μL，PCR產(chǎn)物大小為200 bp。PCR反應(yīng)使用ABI PCR儀進(jìn)行，PCR條件：95℃2 min，（94℃20 s，65℃40 s，72℃1.5 min）×11，（94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min）×24，72℃2 min，16℃∞。PCR產(chǎn)物用SAP和ExonⅠ進(jìn)行純化，純化體系：10 μL PCR產(chǎn)物中加入1.5 μL的SAP（1 U/μL）和0.5 μL的ExonⅠ。反應(yīng)條件：37℃30 min，65℃10 min。延伸反應(yīng)：延伸引物分別用MMP-7-rs138970782-G：5’-GGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGACC TGCTCAGTAAGTGACCATTCG-3’和MMP-7-rs138970782-A：5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGG G GGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGAC C GCTCAGTAAGTGA CCATTCA-3’；MMP-9-rs3918255-C：5’-GGGGG GGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGTTCCGTGGCACTAGGTCCAA-3’和MMP-9-rs3918255-A：5’-GGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGG GGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTCCG TGGCACTAGGTCCAA-3’。

1.3.3 Snapshot延伸反應(yīng) 延伸反應(yīng)體系：5.2 μL水，1.2 μL的5×測序buffer，1.6 μL的Snapshot mix，引物各加入1 μL，PCR產(chǎn)物加入2 μL。延伸條件:96℃1 min，（96℃10 s，52℃5 s，60℃30 s）×28，4℃∞。取延伸產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和卵巢癌組的一般臨床資料比較

對照組和卵巢癌組的年齡、初潮年齡、初次生育年齡、末次生育年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、產(chǎn)次、流產(chǎn)史以及月經(jīng)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），見表1。

表1對照組和卵巢癌組患者的一般臨床資料比較

2.2 Snapshot分析基因型結(jié)果

MMP-7的rs138970782位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)過延伸引物延伸后能夠形成兩種不同的條帶。GG純合基因型有65 bp的一個條帶，GA雜合基因型有65 bp和90 bp的兩個條帶，而AA純合基因型只有90 bp的一個條帶。MMP-9的rs3918255位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)過延伸引物延伸后也能夠形成兩種不同的條帶。CC純合基因型有63 bp的一個條帶，CA雜合基因型有63 bp和92 bp的兩個條帶，而AA純合基因型只有92 bp的一個條帶，見圖1。

圖1 MMP-7的rs138970782位點及MMP-9的rs3918255位點延伸產(chǎn)物分析

2.3 MMP-7及MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌風(fēng)險的關(guān)系

卵巢癌組MMP-7的rs138970782位點AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位點AA基因型比例、A等位基因比例均高于對照組（P均<0.05），見表2。

表2 MMP-7及MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌風(fēng)險的關(guān)系［例（%）］

2.4 MMP-7及MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌FIGO分期的關(guān)系

FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期者M(jìn)MP-7的rs138970782位點AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位點AA基因型比例、A等位基因比例均高于FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期者（P均<0.05），見表3。

表3 MMP-7及MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌FIGO分期的關(guān)系［例（%）］

2.5 MMP-7及MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌分化程度的關(guān)系

低分化組MMP-7的rs138970782位點AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位點AA基因型比例、A等位基因比例均高于中分化組和高分化組（P均<0.05）；中分化組MMP-7的rs138970782位點AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位點AA基因型比例、A等位基因比例均高于高分化組（P均<0.05），見表4。

表4 MMP-7及MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌分化程度的關(guān)系［例（%）］

3 討論

卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程涉及多種促癌基因和抑癌基因的表達(dá)異常[5-6]，有研究[7-8]報道，腫瘤轉(zhuǎn)移是卵巢癌進(jìn)展的主要危險因素，調(diào)節(jié)卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的多態(tài)性與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MMP-7和MMP-9均屬于MMP蛋白家族，具有蛋白酶活性，能夠降解胞外基質(zhì)蛋白而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)對照組和卵巢癌組的年齡、初潮年齡、初次生育年齡、末次生育年齡、BMI、產(chǎn)次、流產(chǎn)史和月經(jīng)情況相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而卵巢癌組MMP-7的rs138970782位點A等位基因比例明顯升高，表明卵巢癌的發(fā)生與年齡和初潮年齡等臨床資料無關(guān)，而與MMP-7基因的多態(tài)性有關(guān)。分析原因可能為MMP-7是促癌基因，MMP-7包括前肽區(qū)和催化區(qū)兩個結(jié)構(gòu)區(qū)，其基因多態(tài)性能夠上調(diào)MMP-7基因表達(dá)，MMP-7基因啟動子多態(tài)性能夠上調(diào)MMP-7表達(dá)，在膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖及層粘連蛋白等各種細(xì)胞外基質(zhì)中MMP-7具有廣泛水解酶活性，MMP-7可以通過誘導(dǎo)明膠酶活化起到促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[11]。同時，對膀胱癌的研究結(jié)果顯示，MMP-7的基因多態(tài)性能夠影響MMP-7基因轉(zhuǎn)錄，從而影響膀胱癌進(jìn)展[12]。進(jìn)一步研究顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ-Ⅳ和低分化卵巢癌患者M(jìn)MP-7的rs138970782位點A等位基因比例升高，表明MMP-7的基因多態(tài)性與卵巢癌患者的惡性程度密切相關(guān)，并且G等位基因突變成A等位基因會促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展。分析原因可能為MMP-7基因表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)，MMP-7基因多態(tài)性會引起MMP-7基因表達(dá)異常，MMP-7能夠切割HSPG2蛋白復(fù)合物，因此MMP-7在基因位點變化影響下異常升高，從而增加卵巢癌的惡性程度；同時MMP-7基因多態(tài)性能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合MMP-7基因啟動子達(dá)到調(diào)節(jié)MMP-7基因表達(dá)作用，進(jìn)而影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組年齡和初潮年齡等臨床資料與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而卵巢癌組MMP-9的rs3918255位點A等位基因比例升高，實驗結(jié)果表明MMP-9的rs3918255位點從C等位基因突變成A等位基因會促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。分析原因可能為MMP-9基因多態(tài)性會引起MMP-9表達(dá)異常，從而激活腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路，導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生，另外上調(diào)MMP-9表達(dá)能通過激活VEGF信號通路、ERK1/2信號通路促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞增殖[15-16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌的FIGO分期和分化程度密切相關(guān)，并且rs3918255位點從C等位基因突變成A等位基因與患者FIGO分期增高以及分化程度下降聯(lián)系密切，分析原因可能為MMP-9的rs3918255位點多態(tài)性會影響微小RNA對MMP-9的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而上調(diào)MMP-9表達(dá)并促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展。

本研究不足之處是與研究的MMP-7基因、MMP-9基因的SNP位點完全相關(guān)的文獻(xiàn)相對較少，結(jié)論性的文獻(xiàn)支持較少，因此后續(xù)應(yīng)針對其SNP位點的變化以及具體機(jī)制進(jìn)行深入研究。

綜上所述，MMP-7和MMP-9的基因多態(tài)性與卵巢癌易感性聯(lián)系密切，MMP-7的rs138970782位點從G等位基因突變成A等位基因以及MMP-9的rs3918255位點從C等位基因突變成A等位基因均會導(dǎo)致卵巢癌FIGO分期增高以及分化程度下降。