丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

石國榮，魏秀琴，王雪芳，王志旭，張海清

（1.武威市人民醫(yī)院麻醉科，武威 733300；2.武威市人民醫(yī)院肝病科，武威 733300；3.武威市人民醫(yī)院產(chǎn)科，武威 733300；4.武威市人民醫(yī)院藥劑科，武威 733300）

腦膠質(zhì)瘤（gliomas）是大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的最常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤。高級別膠質(zhì)瘤（high-grade gliomas，HGG）是指根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）所列的惡性程度，分類為Ⅲ～Ⅳ級的膠質(zhì)瘤。HGG惡性程度較高，5年存活率較低，目前影響其進(jìn)展的既定因素較多，包括患者年齡、腫瘤等級、基因突變、手術(shù)切除范圍和放化療等[1]。盡管在腦膠質(zhì)瘤切除手術(shù)中麻醉藥的暴露時間相對較短，但涉及的血流動力學(xué)變化和所用藥物也可能影響腦膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后結(jié)局[2]。研究[3]表明，麻醉方式的選擇會影響非腦癌的預(yù)后，此外，一些麻醉藥物如丙泊酚、右美托咪定及硫噴妥鈉等靜脈麻醉藥物可能通過某種途徑影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型，被考慮是潛在的抑癌藥物，但其在腦膠質(zhì)瘤中的效應(yīng)仍有待揭示。研究[4]顯示，C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2是影響腫瘤細(xì)胞惡性行為的重要原癌基因，影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究就腦膠質(zhì)瘤手術(shù)常用的靜脈麻醉藥物對HGG細(xì)胞惡性表型的影響及與相關(guān)原癌基因表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1）細(xì)胞：人HGG細(xì)胞U251（上海生命科學(xué)研究院）。2）試劑：RPMI-1640、胎牛血清由美國Gibco公司提供，丙泊酚注射液（200 mg/支，批號：1910031，西安力邦制藥有限公司），右美托咪定注射劑（0.2 mg/支，批號：190926，四川國瑞藥業(yè)有限公司），注射用硫噴妥鈉（1 g/支，批號：190714，上海新亞藥業(yè)有限公司），CCK-8試劑由日本同仁化學(xué)研究所提供，Matrigel基質(zhì)膠及轉(zhuǎn)移小室（Transwell chamber）由美國Corning公司提供，RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及核酸熒光染料SYBR Green（日本Takara公司），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），GAPDH、C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2抗體及相應(yīng)二抗（美國Proteintech公司），ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（上海翌圣生物科技有限公司）。3）儀器：7500型實時熒光定量PCR儀（美國Ap－plied Biosystems公司），T100 PCR儀及Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組U251細(xì)胞采用90%RPMI-1640+10%FBS，于37℃、95%相對濕度、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，1∶2傳代，接種至10 cm培養(yǎng)皿中并分為對照組、丙泊酚組、右美托咪定組（右美組）及硫噴妥鈉組（硫噴組）。對照組用生理鹽水處理6 h，丙泊酚組以4 mg·L-1丙泊酚處理6 h，右美組以50 nmol·L-1右美托咪定處理6 h，硫噴組以500 μmol·L-1硫噴妥鈉處理6 h，更換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，處理條件參照文獻(xiàn)中用量[5-7]。

1.2.2 CCK-8實驗檢測各組U251細(xì)胞增殖能力 將各組細(xì)胞以1×103/孔接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，總體積100 μL，每組實驗設(shè)置5個平行孔，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2～4 h，使用酶聯(lián)儀檢測細(xì)胞的OD450值，相同的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后的OD450值，以細(xì)胞OD24/48/72h/OD0h表示細(xì)胞相對增殖能力。

1.2.3 克隆形成實驗檢測各組U251細(xì)胞克隆形成能力 將細(xì)胞以1×103/孔接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2 mL 90% RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)基，2周后使用無水乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，每組重復(fù)3個孔，拍照并采用Image J軟件計數(shù)。

1.2.4 Transwell實驗檢測各組U251細(xì)胞的侵襲及遷移能力 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠至50 mg·L-1，均勻鋪至Transwell小室上室面，37℃風(fēng)干4 h備用，另取等量未鋪膠的小室備用，1% FBS＋RPMI-1640重懸各組細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至5×105個/mL，200 μL細(xì)胞懸液接種至Transwell小室上室面，下室面加入10%FBS＋RPMI-1640共600 μL，鋪膠的小室作為細(xì)胞侵襲模型，未鋪膠的小室作為細(xì)胞遷移模型，37℃、95%相對濕度、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拭去上室面未穿透細(xì)胞，無水乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，200倍光鏡下計數(shù)，隨機從中間和4周選取5個視野計數(shù)細(xì)胞，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5 PCR檢測各組U251細(xì)胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2的mRNA表達(dá) 采用RNAiso Plus試劑抽提細(xì)胞總RNA，檢測RNA濃度，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA后稀釋至500 μL，合成引物稀釋至0.2 μmol·L-1，設(shè)置3個平行孔，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。預(yù)變性：50℃2 min，94℃10 min；擴(kuò)增階段：94℃15 s，60℃1 min；熔解階段：94℃15 s，60℃1 min，94℃30 s，60℃15 s，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT法計算C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2的mRNA的相對表達(dá)水平，相關(guān)引物序列見表1。

表1各待測基因引物序列

1.2.6 Western blot實驗檢測各組U251細(xì)胞CMYC、PDGFR、EGFR及MDM2蛋白的表達(dá) 采用RIPA蛋白裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，取30 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，穩(wěn)壓120 V，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，穩(wěn)流260 mA，10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，1∶1 000 C-MYC、PDGFR、EGFR、MDM2及內(nèi)參GAPDH一抗4℃孵育條帶過夜，1∶3 000二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液孵育條帶，化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光顯影并掃描條帶灰度，利用Image J軟件計算條帶灰度，用目的基因灰度與內(nèi)參基因GAPDH灰度比值衡量目的基因表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，丙泊酚組、右美組及硫噴組U251細(xì)胞相對增殖能力在48 h及72 h時均低于對照組（P均＜0.05）；克隆形成實驗顯示，對照組、丙泊酚組、右美組及硫噴組克隆形成數(shù)分別為（152.2±14.55）、（86.01±8.679）、（102.50±5.015）及（107.6±5.329）個，各麻醉藥物組的克隆形成數(shù)均低于對照組（P均＜0.01），見圖1。

圖1 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

對照組、丙泊酚組、右美組及硫噴組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（53.33±3.21）、（27.02±4.58）、（33.41±3.07）及（35.67±4.16）個，遷移細(xì)胞數(shù)分別為（133.00±9.84）、（79.67±8.02）、（92.90±6.15）及（108.17±6.57）個，各麻醉藥組的侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)均低于對照組；丙泊酚組侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)均低于硫噴組（P均＜0.05），右美組僅侵襲細(xì)胞數(shù)低于硫噴組（P＜0.05），見圖2。

圖2 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

2.3 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞C-MYC、PDGFR、EGFR和MDM2 mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，丙泊酚組C-MYC、PDGFR、EGFR和MDM2的mRNA表達(dá)均降低（P均＜0.01），右美組C-MYC及EGFR mRNA表達(dá)均降低（P均＜0.01），硫噴組PDGFR及EGFR mRNA表達(dá)均降低（P均＜0.01），見圖3。

圖3 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2 mRNA表達(dá)的影響

2.4 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，丙泊酚組C-MYC、PDGFR、EGFR和MDM2的蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05或P＜0.01），右美組C-MYC及EGFR蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05或P＜0.01），硫噴組PDGFR和EGFR蛋白表達(dá)均降低（P均＜0.01），見圖4。

圖4 丙泊酚、右美托咪定和硫噴妥鈉對U251細(xì)胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

手術(shù)切除是治療HGG的主要手段，而其中靜脈麻醉是不可或缺的環(huán)節(jié)。近年來，多種麻醉藥物被發(fā)現(xiàn)影響惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展：其一，丙泊酚作為烷基酸類的短效靜脈麻醉藥，與腫瘤細(xì)胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)有關(guān)[8]，并通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞放化療敏感性[9]，其可通過調(diào)節(jié)多種微小RNA（microRNA）如microRNA-195、microRNA-1284、microRNA-24及EGFR通路、免疫抑制分子PD-L1等，抑制胃癌、肺癌、乳腺癌及宮頸癌等腫瘤的進(jìn)展[10-14]。此外有研究[15-17]表明，丙泊酚也被發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌作用，其可抑制Wnt及NF-κB信號通路，上調(diào)抑癌基因microRNA-218，降低HGG細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其二，右美托咪定是選擇性α2-腎上腺素受體激動劑，因其強大的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用在腫瘤切除手術(shù)中廣泛應(yīng)用，有研究[18-19]顯示，50 nmol·L-1劑量下的右美托咪定可顯著抑制細(xì)胞的侵襲，但激活了細(xì)胞ERK1/2及PI3K通路，促進(jìn)細(xì)胞對順鉑的抵抗能力并通過激動α2-腎上腺素受體信號傳導(dǎo)促進(jìn)肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的癌細(xì)胞存活。其三，硫噴妥鈉作為臨床麻醉藥物同樣參與影響HGG細(xì)胞惡性表型，Hurmath等[7]研究顯示，2.5%的七氟醚及不同濃度的硫噴妥鈉均對HGG細(xì)胞U87MG的遷移能力及基質(zhì)金屬蛋白酶-2存在抑制作用，有研究[20]認(rèn)為硫噴妥鈉還可通過抑制NF-κB信號通路，降低顱內(nèi)炎性水平。

為了揭示上述靜脈麻醉劑對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能的機制，本研究挑選了與腫瘤細(xì)胞惡性行為相關(guān)的多種核心調(diào)控分子作為研究對象，包括C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2。結(jié)果顯示，丙泊酚、右美托咪定及硫噴妥鈉均可抑制HGG細(xì)胞惡性增殖、侵襲及遷移能力，且丙泊酚效應(yīng)最強。C-MYC是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡過程的關(guān)鍵因子，包括腦膠質(zhì)瘤[21]；PDGFR及EGFR是重要的酪氨酸激酶受體，其在腫瘤中常被異常激活，促進(jìn)下游多條原癌信號通路的活化，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性行為[22-23]；MDM2可引起抑癌基因TP53的泛素化降解，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚、右美托咪定及硫噴妥鈉可不同程度地抑制上述原癌基因的表達(dá)，且丙泊酚對C-MYC及MDM2表達(dá)的抑制能力較強，相應(yīng)地對HGG細(xì)胞惡性增殖及轉(zhuǎn)移的抑制作用較強。綜上所述，本研究表明，丙泊酚、右美托咪定及硫噴妥鈉均能抑制HGG細(xì)胞體外增殖及轉(zhuǎn)移能力，且丙泊酚抑制作用優(yōu)于右美托咪定及硫噴妥鈉。后期將進(jìn)一步通過實驗動物模型明確三種靜脈麻醉藥物體內(nèi)的抑癌作用，為腦膠質(zhì)瘤手術(shù)麻醉方案的優(yōu)化提供研究基礎(chǔ)。