益腎骨康方對(duì)肺癌A549細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的影響

何理玉 楊夢(mèng)霞 蘆殿榮 馮 利

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院,北京,100102; 2 國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院,北京,100021)

肺癌是癌癥相關(guān)死亡最常見的原因,2018年全世界約有209萬(wàn)人被診斷為肺癌,176萬(wàn)人死于肺癌。我國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示2015年新發(fā)肺癌病例73萬(wàn)例,死亡病例61萬(wàn)例。肺癌患者的5年生存率根據(jù)分期和地域差異在4%～17%之間變化[1-2]。肺癌發(fā)病率和死亡率隨著年齡增長(zhǎng)而上升。伴隨我國(guó)人口老齡化、工業(yè)化發(fā)展導(dǎo)致的大氣和環(huán)境污染以及煙草流行率全球最高,我國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率將會(huì)進(jìn)一步攀升[3-4]。臨床上肺癌的治療采用多學(xué)科綜合治療的原則,具體手段包括手術(shù)、放療和化學(xué)治療,以及靶向、免疫、生物治療等。西醫(yī)治療惡性腫瘤占主流地位,但存在瓶頸且尚未突破。中醫(yī)根據(jù)整體觀和辨證論治對(duì)惡性腫瘤及其并發(fā)癥的治療具有獨(dú)到的見解。益腎骨康方(專利號(hào):ZL2013 1 0582907.9,專利權(quán)人:馮利)是馮利教授根據(jù)中醫(yī)理論治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移癌痛研制而成的處方,臨床及基礎(chǔ)研究驗(yàn)證有效。前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)益腎骨康方可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移等[5]。本研究擬用益腎骨康方干預(yù),通過電鏡觀察腫瘤細(xì)胞表面形態(tài)的改變以及通過轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序探討益腎骨康方作用于肺癌A549細(xì)胞的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人肺腺癌A549細(xì)胞株由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院骨傷科研究所藥理室惠贈(zèng)。

1.1.2 藥物 益腎骨康方中藥購(gòu)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院門診中藥房,中藥飲片加水浸泡30 min,煎成60 mg/mL的中藥母液,濾網(wǎng)過濾后,用0.22 μm孔徑的針筒式微孔濾膜過濾器過濾,混勻,分裝,放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)將中藥母液溶于RPMI1640無血清培養(yǎng)基中配置成4.18 mg/mL中藥干預(yù)濃度。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶消化液(北京索寶萊科技有限公司,貨號(hào)分別為10491、11011-8611、P1400、T1300);Trizol(ambion公司,美國(guó),貨號(hào):15596026)。TC處理96孔圓形細(xì)胞爬片(上海臥宏生物科技有限公司,貨號(hào):LY-14-TC)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國(guó),型號(hào):Forma 370);倒置光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,型號(hào):Motic AE2000);離子濺射儀、掃描電鏡(HITACHI公司,日本,型號(hào)分別為:E-1010、S-3400N)。

1.2 方法

1.2.1 電鏡 將TC處理的96孔圓形細(xì)胞爬片(直徑3 mm)放置于96孔板。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞,消化,離心(1 000 r/min,離心半徑13.5 cm),調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為8×104個(gè)/mL,接種于帶有爬片的96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿爬片80%左右,分2組給藥:對(duì)照組,即用不含中藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;益腎骨康方組,即用含中藥4.18 mg/mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后,棄去培養(yǎng)液,將爬片放置于24孔板,PBS洗2遍,每孔加入1.5 mL 2.5%戊二醛固定液固定,4 ℃冰箱過夜,磷酸鹽緩沖液漂洗3遍,1%OsO4固定45 min,磷酸鹽緩沖液漂洗3遍,脫水∶丙酮∶醋酸異戊酯(1∶1)10 min,醋酸異戊酯0.5 h,臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀噴金,分別于掃描電鏡2.00 k、5.00 k放大倍數(shù)下觀察、拍照。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序

1.2.2.1 差異基因篩選 該研究分為益腎骨康方組和對(duì)照組2組分別干預(yù)肺癌A549細(xì)胞,24 h后檢測(cè)mRNA的表達(dá)情況。具體操作步驟為RNA提取、檢測(cè)、mRNA富集、雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)(加A和接頭)、片段選擇和PCR擴(kuò)增、文庫(kù)檢測(cè)、Illumina上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)指控和基因表達(dá)水平定量等。使用DESeq2 R軟件進(jìn)行益腎骨康方組和對(duì)照組2組之間的差異表達(dá)分析(每個(gè)組2個(gè)生物學(xué)重復(fù))。通過DESeq2發(fā)現(xiàn)調(diào)整的P值<0.05的基因被分配為差異表達(dá)的。使用Benjamini&Hochberg方法調(diào)整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作為顯著差異表達(dá)的閾值。

1.2.2.2 差異基因富集分析 通過clusterProfiler R軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,其中修正了基因長(zhǎng)度偏差。考慮具有<0.05的校正的P值的GO term通過差異表達(dá)基因顯著富集。京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)資源,用于從分子水平的信息,特別是基因組測(cè)序產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集和其他高通量數(shù)據(jù)庫(kù)中了解生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和效用,如細(xì)胞,生物體和生態(tài)系統(tǒng)等。我們使用clusterProfiler R軟件分析KEGG通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集。

1.2.2.3 差異基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 Cytoscape 3.6.0是一個(gè)生物信息學(xué)軟件平臺(tái),用于可視化分子交互網(wǎng)絡(luò),通過該軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖;MCODE(Version 1.4.2,Bader Lab,University of Toronto)是一個(gè)能對(duì)構(gòu)建的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析的插件,根據(jù)關(guān)聯(lián)積分值,可獲得整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能形成的蛋白質(zhì)簇和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白,并在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化顯示。選取標(biāo)準(zhǔn)如下:MCODE評(píng)分>5,度截止為2,節(jié)點(diǎn)分值截止為0.2,k分值等于2。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞表面的形態(tài)變化 A549細(xì)胞在正常情況下形態(tài)為梭形和多角形。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常,飽滿,表面有膜皺,絲狀偽足。益腎骨康方組可見細(xì)胞表面膜皺顯著減少,絲狀偽足斷裂,凋亡小體形成。細(xì)胞皺縮和凋亡小體的形成是細(xì)胞凋亡的特征。絲狀足是一種較薄的細(xì)胞質(zhì)突起,在細(xì)胞附著到生長(zhǎng)表面、協(xié)助細(xì)胞遷移等方面起著重要作用,是細(xì)胞與細(xì)胞連接的重要組成部分。見圖1。

圖 1A549細(xì)胞表面形態(tài)變化的掃描電鏡觀察(×6 000)

2.2 轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序

2.2.1 差異基因篩選 益腎骨康方組和對(duì)照組的基因表達(dá)情況,2組比較矯正Pvalue<0.05,|log2FoldChange|>1的差異表達(dá)基因有440個(gè),其中下調(diào)基因有136個(gè),上調(diào)基因有304個(gè),其中與益腎骨康方抑制腫瘤細(xì)胞作用關(guān)系密切的基因?yàn)镾OX2,SOX2在益腎骨康方組中表達(dá)下調(diào)。差異基因火山圖見圖2。

2.2.2 GO和KEGG富集分析 在GO功能富集過程中共得到307條結(jié)果,主要涉及生物過程(237項(xiàng))、細(xì)胞組分(56項(xiàng))和分子功能(14項(xiàng))。在生物過程中,主要包括外源性凋亡信號(hào)通路、轉(zhuǎn)移酶活性

圖2 差異基因火山圖

的負(fù)調(diào)節(jié)等;在細(xì)胞組分中,主要包括黏著連接、細(xì)胞-基質(zhì)連接、細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接等;在分子功能中,主要包括細(xì)胞黏附分子結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞黏附遞質(zhì)活性等。從GO富集分析結(jié)果中,選取最顯著的30個(gè)Term繪制散點(diǎn)圖。見圖3。將分析條件設(shè)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05,分別在生物過程、細(xì)胞成分和分子功能方面篩選出前10個(gè)顯著富集的條目。KEGG通路分析,與益腎骨康方抑制肺癌A549細(xì)胞的作用相關(guān)機(jī)制主要涉及細(xì)胞凋亡方面。從KEGG富集結(jié)果中,選取最顯著的20個(gè)KEGG通路繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行展示。見圖4。

圖3 益腎骨康方組與對(duì)照組差異表達(dá)基因的 GO功能富集分析

圖4 益腎骨康方組與對(duì)照組差異表達(dá)基因的 KEGG功能富集分析

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò) PPI網(wǎng)絡(luò)包含290個(gè)節(jié)點(diǎn)和743條邊。通過MCODE插件篩選出核心基因,根據(jù)Degree值篩選出與益腎骨康方生藥抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的2個(gè)基因:MMP9和CCL2,節(jié)點(diǎn)度(Degree)分別為36和27。益腎骨康方高劑量組與對(duì)照組比較下調(diào)了MMP9和CCL2基因的表達(dá)。見圖5。

圖5 與中藥抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

中醫(yī)藥是我國(guó)的民族瑰寶,我國(guó)中藥資源豐富,價(jià)格相對(duì)低廉,尋找有效的抗腫瘤中藥是研究的熱點(diǎn)。中藥有效成分及復(fù)方抗肺癌機(jī)制包括抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、黏附、侵襲以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬等方面,其內(nèi)在機(jī)制多為可調(diào)節(jié)多個(gè)分子、通路及基因水平的物質(zhì)[6]。益腎骨康方具有補(bǔ)腎健脾,解毒化瘀,滲濕消腫,抗癌止痛的功效,該處方中包含多味中藥單體,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)均具有抗腫瘤作用。課題組前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)益腎骨康方可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移等。

本研究通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)益腎骨康方作用于A549細(xì)胞24 h后,促使A549細(xì)胞表面的膜皺減少、絲狀偽足斷裂及凋亡小體形成,從而降低了A549肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[7-9]。

通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)與益腎骨康方抑制肺癌A549細(xì)胞的作用機(jī)制相關(guān)的差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞黏附和外源性凋亡信號(hào)通路等。通過KEGG通路分析顯示與益腎骨康方抑制肺癌A549細(xì)胞的作用機(jī)制相關(guān)的通路主要涉及到細(xì)胞凋亡方面。

本研究通過比較益腎骨康方組和對(duì)照組,我們篩選出差異倍數(shù)至少2倍(|log2FoldChange|>1)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因,共440個(gè)。通過查閱文獻(xiàn)我們得到了一個(gè)與癌癥密切相關(guān)的基因SOX2,它在益腎骨康方組中表達(dá)下調(diào)。Y染色體性別決定區(qū)域盒2(Sex Determining Region Y-box 2,SOX2)屬于SOX(SRY樣高速泳動(dòng)族蛋白盒)基因家族成員,是干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子,參與維持干細(xì)胞的多能性、增殖、自我更新、多向分化及重新編程等[10-11]。多項(xiàng)研究提示SOX2基因突變、甲基化或表達(dá)異常與多種癌前病變及腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[12-14],同時(shí)有研究顯示SOX2參與了多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展,SOX2過表達(dá)可以促進(jìn)肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移[15-18]。由此我們可以推測(cè)益腎骨康方可能是通過下調(diào)SOX2的表達(dá)來發(fā)揮抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移活性。

本研究我們將440個(gè)差異表達(dá)基因利用生物信息學(xué)方法制作了PPI網(wǎng)絡(luò)圖,剔除孤立的節(jié)點(diǎn),根據(jù)Degree值篩選出了排名前37的關(guān)鍵靶點(diǎn),通過查閱文獻(xiàn)分析找出了2個(gè)連接度較高且與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因:MMP9和CCL2,其中連接度最高的基因是MMP9。在益腎骨康方組中肺癌A549細(xì)胞的MMP9、CCL2基因表達(dá)下調(diào)。在腫瘤發(fā)展過程中,基底膜破壞通常是支持腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的重要步驟。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)家族成員可以分為幾個(gè)組,如明膠酶,膠原酶,基質(zhì)溶酶,母質(zhì)溶酶和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶,MMP能夠降解和修飾細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的大部分成分[19-20],與腫瘤擴(kuò)散及患者預(yù)后相關(guān)[21]。其中,MMP9是研究最廣泛的MMPs之一。MMP9是降解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白和非膠原蛋白最重要的內(nèi)肽酶,在多種腫瘤中高表達(dá)。MMP9在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。CC趨化因子配體2(CC Chemokine Ligand 2,CCL2)是趨化因子家族的成員。趨化因子家族是一類小分子分泌蛋白,能夠引起白細(xì)胞向目的部位聚集,最終引起炎癥反應(yīng)[23]。CCL2可招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤部位、促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟、免疫應(yīng)答逃避和促進(jìn)腫瘤新生血管生成,從而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[24-26]。有研究表明CCL2在乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌和胰腺癌等癌癥中高表達(dá),與不良預(yù)后有關(guān)[27-29]。由此我們可以推測(cè)益腎骨康方可能是通過下調(diào)MMP9和CCL2表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述,益腎骨康方能促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和轉(zhuǎn)移活性。益腎骨康方的抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過下調(diào)SOX2、MMP9和CCL2基因的表達(dá),最終抑制了肺癌A549細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。但是其發(fā)揮藥理學(xué)作用的具體活性成分及更深層面的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究利用轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法初步篩選出益腎骨康方作用的關(guān)鍵基因,但其在體內(nèi)是否是通過該靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。