基于反相高效液相色譜技術測定市售羊乳粉中蛋白

宋卓巖，喬春艷，張雪茹，郝 果，劉永峰,*

（1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710062；2.富平縣檢驗檢測中心，陜西 富平 711700）

羊乳作為一種天然產物，含有豐富的高生物價蛋白質、必需脂肪酸、維生素和礦物質等200多種營養(yǎng)和生物活性物質[1]，其所含的鈣質能有效預防骨質疏松癥，促進骨骼發(fā)育。此外，羊乳的脂肪顆粒體積比牛乳更小，更利于人體吸收，并且長期飲用羊乳也不會引起肥胖[2]。研究證實，嬰兒對羊乳的消化率可達94%以上，具有較高的生物利用度，因此羊乳也被視為人乳最好的替代品[3]，是兒童、成人和老人的理想食物[4-5]。乳蛋白含量及組成作為羊乳粉的特征性成分可以反映乳粉制品真實的質量信息，酪蛋白作為乳蛋白的主要組成，其含量可有效反映乳品營養(yǎng)價值的高低[6]。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）又稱高壓液相色譜，其原理是基于混合物中各組分在兩相中的分配系數(shù)差異達到分離各物質的目的，通過紫外檢測器或示差檢測器對物質的響應得到對應吸收峰，從而實現(xiàn)對物質定性、定量檢測的目的。該技術已經(jīng)作為一項常規(guī)檢測技術用于各行各業(yè)的檢測需求，它具有分析速度快、分離效率高、操作自動化等優(yōu)點。HPLC技術已經(jīng)廣泛應用于乳及乳制品中多種質量控制指標的檢測，如乳的營養(yǎng)成分及含量分析、乳的風味物質種類及含量分析等[7]。Ochirkhuyag[8]利用HPLC對馬乳αs-酪蛋白（αs-casein，αs-CN）的不同基因型進行了分離純化。楊璐桐等[9]通過HPLC準確測定了人乳和牛乳中總核苷酸含量和組成，該方法具有較好的靈敏度、準確性和精密度，能滿足日常對人乳或牛乳中總核苷酸定量測定的要求。Kaminarides等[10]采用HPLC分離奶牛乳、綿羊乳和山羊乳的酪蛋白成分，發(fā)現(xiàn)3 種酪蛋白組分均得到了很好的分離，山羊乳和綿羊乳的色譜圖相似，但它們與牛乳的色譜圖有很大不同。Veloso等[11]優(yōu)化了HPLC-紫外檢測分離定量牛乳κ-CN、α-CN和β-CN的方法，同樣地，HPLC也可用于分離山羊乳清蛋白。

反相HPLC（reversed-phase HPLC，RP-HPLC）技術是利用不同蛋白質氨基酸側鏈與RP-HPLC介質的疏水表面發(fā)生的可逆疏水作用的差異來實現(xiàn)對蛋白質的分離[12-13]。與其他色譜分析法相比，RP-HPLC具有更高的乳蛋白分離能力，可實現(xiàn)高速和自動化的乳制品品質測定[14]。Mora-Gutierrez等[15]利用等電點沉降法分別提取法國高山山羊和英國努比亞山羊乳中的酪蛋白，通過RP-HPLC技術從酪蛋白中分離出4 種成分，發(fā)現(xiàn)利用色譜分辨山羊乳中的αs1-CN含量差異明顯。

近年來，羊乳粉在國內開始迅速發(fā)展，我國的羊乳粉品牌逐漸增多，確保市售羊乳粉質量是保證其持續(xù)高速發(fā)展的重要條件，但是目前對市售羊乳粉品質的系統(tǒng)研究比較少見。由于產地、季節(jié)、飼料、環(huán)境等因素的影響，羊乳的產量、質量、風味等均存在差異[16-18]，且羊乳經(jīng)過殺菌、濃縮、干燥等處理后，羊乳粉組成也會產生變化[19-20]。準確測定羊乳粉中主要營養(yǎng)指標是評價羊乳粉品質的關鍵，本研究采用RP-HPLC技術，通過對不同地區(qū)市售羊乳粉中酪蛋白及乳清蛋白的種類、含量進行對比分析，評價不同地區(qū)市售羊乳粉的品質，以期為市售羊乳粉的品質評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊乳粉，市售，共35 種，產品種類包括純羊乳粉與配方羊乳粉，同時對其中純羊乳粉按產地分為陜西地區(qū)純羊乳粉及非陜西地區(qū)純羊乳粉，具體分類見表1。

BisTris、檸檬酸鈉、鹽酸胍、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（分析純） 天津市天力化學試劑有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙腈（色譜純） 天津市福晨化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

U-3000 HPLC儀 美國熱電公司；TGL-16aR高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳粉乳蛋白預處理

參考雷穎穎[13]的方法進行蛋白樣品預處理。準確稱取60 mg羊乳粉，用去離子水溶解并定容至2 mL；取400 μL羊乳粉溶液加入等體積工作液A（含0.1 mol/L BisTris、5.37 mmol/L檸檬酸鈉、6 mol/L鹽酸胍、19.5 mmol/L DTT），混勻靜置1 h后于4 ℃、16 000 r/min離心5 min，除去上層脂肪；取300 μL下層溶液加入3 倍體積的工作液B（含4.5 mol/L鹽酸胍的0.1% TFA水溶液）混勻，用0.22 μm濾膜過濾，待上機測定。

1.3.2 RP-HPLC測定羊乳粉乳蛋白

參考雷穎穎[13]的方法并略作修改，使用C18色譜柱，進樣量20 μL，流速0.7 mL/min，在214 nm波長處采集信號，柱溫保持在45 ℃洗脫32 min。流動相A為0.1% TFA水溶液，流動相B為0.1% TFA-乙腈溶液，經(jīng)過抽濾、超聲脫氣后上機使用。梯度洗脫程序：33%～40%流動相B 9 min，40%～50%流動相B 15 min，50%～60%流動相B 2 min，60%流動相B 3 min，60%～33%流動相B 3 min。

根據(jù)出峰的順序，通過峰面積對乳蛋白進行定性及相對定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品5 個平行，將RP-HPLC分析得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，由儀器自帶軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 羊乳粉乳蛋白的RP-HPLC測定結果

羊乳蛋白主要組成包括酪蛋白和乳清蛋白，其占比分別為75%和25%[21-22]。由圖1可知，峰1保留時間約為13.7 min，為κ-CN，峰2保留時間約為14.0 min，為αs2-CN，峰3保留時間15.6～16.4 min，為αs1-CN，峰4保留時間16.3～16.4 min，為β-CN，峰5保留時間16.7～19.0 min，為乳清蛋白。

圖1 羊乳粉乳蛋白的RP-HPLC圖Fig. 1 RP-HPLC profile of goat milk powder proteins

2.2 羊乳粉乳蛋白組成

由表2可知，所有羊乳粉的乳蛋白組成中含量最多的是β-CN，含量最少的是αs1-CN。配方羊乳粉乳清蛋白相對含量高出純羊乳粉50%左右，κ-CN相對含量高于純羊乳粉30%左右，αs2-CN相對含量低于純羊乳粉20%左右，β-CN相對含量低于純羊乳粉24%左右，二者αs1-CN相對含量差異不大。經(jīng)分析可得，不同區(qū)域的純羊乳粉各組分含量區(qū)別不大，κ-CN、αs2-CN、αs1-CN、β-CN組成相似。

表2 羊乳粉乳蛋白組成測定結果Table 2 Protein composition of goat milk powder %

2.3 純羊乳粉和配方羊乳粉乳蛋白組成與分析

為了解配方羊乳粉和純羊乳粉的差異情況，選擇4 個配方羊乳粉與4 個純羊乳粉進行研究。由圖2可知，純羊乳粉乳蛋白中κ-CN相對含量12.70%～14.53%，αs2-CN相對含量12.90%～13.12%，αs1-CN相對含量7.21%～15.15%，β-CN相對含量38.57%～47.51%，乳清蛋白相對含量17.46%～21.23%。配方羊乳粉蛋白中κ-CN相對含量14.44%～21.45%，αs2-CN相對含量9.26%～11.96%，αs1-CN相對含量9.40%～12.33%，β-CN相對含量25.16%～41.35%，乳清蛋白相對含量20.53%～34.72%。對比純羊乳粉和配方羊乳粉各蛋白組分相對含量發(fā)現(xiàn)，配方羊乳粉和純羊乳粉各蛋白組分組成相似但相對含量有明顯差異。

圖2 純羊乳粉與配方羊乳粉中各乳蛋白相對含量Fig. 2 Relative content of each protein in pure and formulated goat milk powder

2.4 不同地區(qū)純羊乳粉乳蛋白組成與分析

為了有針對性地了解不同地區(qū)純羊乳粉的差異情況，本研究選擇6 個陜西地區(qū)純羊乳粉與4 個非陜西地區(qū)純羊乳粉進行研究。由圖3可知，陜西地區(qū)純羊乳粉乳蛋白中κ-CN相對含量12.70%～16.74%，αs2-CN相對含量12.81%～14.54%，αs1-CN相對含量7.21%～15.15%，β-CN相對含量38.57%～47.51%，乳清蛋白相對含量15.89%～21.23%。非陜西地區(qū)純羊乳粉乳蛋白中κ-CN相對含量14.84%～16.98%，αs2-CN相對含量10.40%～13.67%，αs1-CN相對含量9.13%～13.74%，β-CN相對含量37.75%～49.25%，乳清蛋白相對含量6.72%～23.31%。對比陜西地區(qū)和非陜西地區(qū)純羊乳粉各蛋白組分相對含量發(fā)現(xiàn)，各組分相對含量差異均不明顯，表明不同地區(qū)純羊乳粉蛋白組成及含量均相似。

圖3 不同地區(qū)純羊乳粉乳蛋白中各乳蛋白相對含量Fig. 3 Relative content of each protein in pure goat milk powder from different regions

3 討 論

本研究中配方羊乳粉αs2-CN和β-CN相對含量分別低于純羊乳粉20%和24%，κ-CN和乳清蛋白相對含量分別高于純羊乳粉30%和50%，二者的αs1-CN相對含量基本一致。配方羊乳粉主要針對嬰幼兒、老年人及特殊人群需要調配，由于不同人群在蛋白需求上的差異，所以與純羊乳粉蛋白組成（除αs1-CN）差異顯著。而酪蛋白含量與編碼酪蛋白的基因緊密相關，如高頻率基因CSN3BIEF能提高乳中酪蛋白的相對含量。酪蛋白基因多態(tài)性對αs1-CN和αs2-CN含量有一定影響，對αS1-CN的影響尤為明顯。不同基因型對αs1-CN含量影響也不同，如強等位基因對應αs1-CN含量為3.6 g/L，中度等位基因對應αs1-CN含量為1.6 g/L，弱等位基因對應αs1-CN含量為0.6 g/L，而無效等位基因對應αs1-CN含量極少甚至沒有[23-25]。由此說明，配方羊乳粉和純羊乳粉的蛋白含量有差異與編碼酪蛋白的基因不同緊密相關。

αs1-CN和β-乳球蛋白是乳源中主要的致敏性蛋白，二者含量較高時，不適于患有“過敏癥”的人群食用。山羊乳中的αs1-CN含量比牛乳中低38.57%，山羊乳中的κ-CN和β-CN總含量比牛乳中的κ-CN和β-CN總含量高24.60%[26-27]，因此，羊乳可以作為牛乳不耐受患者的理想乳源。Park[18]的研究結果發(fā)現(xiàn)，山羊乳中αs1-CN占總蛋白的5.6%，而本研究中羊乳粉αs1-CN相對含量均在11%左右，也較杭鑫茹等[22]測定的羊乳粉中αs1-CN的平均含量10%偏高，可能原因是不同單體蛋白含量導致酪蛋白空間結構復雜不一，造成分離羊乳乳清蛋白時酪蛋白的殘余量不同。酪蛋白以多種蛋白膠束形式存在，各酪蛋白的穩(wěn)定性、敏感性不同，造成了在分離乳清蛋白過程中酪蛋白殘留的差異[28-29]。同時，純乳粉乳蛋白中αs1-CN平均相對含量11.77%，配方羊乳粉蛋白中αs1-CN平均相對含量11.36%，二者αs1-CN相對含量無明顯差異，表明無論是配方羊乳粉還是純羊乳粉其致敏蛋白含量都很低。

本研究中配方羊乳粉與純羊乳粉所含κ-CN、αs2-CN、β-CN及乳清蛋白相對含量均具有明顯差異，其中配方羊乳粉乳清蛋白相對含量明顯高于純羊乳粉，而總蛋白質含量較純羊乳粉明顯降低，原因可能與配方羊乳粉額外添加乳清蛋白粉、脫鹽乳清粉等有關，在分離乳清過程中，乳球蛋白與酪蛋白之間發(fā)生復雜的化學反應，導致產生酪蛋白聚沉物[30]，影響酪蛋白殘余量，乳清蛋白粉不但能夠增加乳清蛋白相對含量，對其他蛋白質相對含量也有影響[31]。同時，配方羊乳粉中食品添加劑也會對蛋白產生影響，如乳樣中添加羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）后，能夠增強蛋白質間的靜電排斥作用，提高酪蛋白的穩(wěn)定性，減少蛋白質間的絮凝作用；且CMC與明膠配合使用后，能明顯提高酪蛋白穩(wěn)定性[32]。因此，配方羊乳粉乳清蛋白含量明顯高于純羊乳粉的主要原因是配方羊乳粉額外添加了食品添加劑。

RP-HPLC是分離純化的重要方法，在多肽、蛋白質的分離純化工藝中顯示出優(yōu)良性能，特別適用于分子質量較小的蛋白質和多肽物質的分離純化，具有十分強大的分辨能力[33]。在分離純化乳品方面，RP-HPLC有其天然的優(yōu)勢。但是，一種分離手段往往不能達到純度、數(shù)量等方面的要求。因此，應該在現(xiàn)有分離技術的基礎上，進一步優(yōu)化組合，將多種分離手段的優(yōu)勢結合起來，在乳品的分離純化中發(fā)揮更強大的作用，同時，進一步深入研究多種色譜方法，使更復雜多樣的乳品樣品得到分離。

4 結 論

對市售羊乳粉乳蛋白進行RP-HPLC測定發(fā)現(xiàn)，配方羊乳粉αs2-CN和β-CN相對含量分別低于純羊乳粉20%和24%，κ-CN和乳清蛋白相對含量分別高于純羊乳粉30%和50%。不同地區(qū)純羊乳粉中乳蛋白組成及含量相似。本研究結果可為市售羊乳粉中乳蛋白檢測方法提供借鑒，為不同類型羊乳粉質量評估和品質初步監(jiān)控提供理論指導和技術支撐。