西安市與上海市百日咳鮑特菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性、耐藥相關(guān)分子特征及多位點(diǎn)抗原序列分型的比較研究

張娟勝 ,張弟強(qiáng) ,林 晨 ,常 玲 ,馬超鋒 ,陳保忠 ,耿 毛

(1.西安市疾病預(yù)防控制中心,陜西西安 710054;2.白銀市平川區(qū)人民醫(yī)院,甘肅白銀 730900;3.上海市浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心,上海 200120;4.西安市雁塔區(qū)電子城社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,陜西西安 710054)

百日咳(pertussis)是由百日咳鮑特菌(Bordetella pertussis,Bp)感染導(dǎo)致的急性呼吸道傳染病,可引起嬰幼兒陣發(fā)性、痙攣性咳嗽。自從廣泛實(shí)施百日咳疫苗免疫接種以來,百日咳的發(fā)病率已大幅度減少。然而,自20世紀(jì)90年代,百日咳開始在高度免疫人群中重新出現(xiàn),全球百日咳病例數(shù)量持續(xù)增加。百日咳桿菌的分子進(jìn)化和病原適應(yīng)性是促成發(fā)病率增加的原因之一。

以紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素一直以來是預(yù)防和治療百日咳的首選藥物。然而,近年來,多項(xiàng)研究報(bào)道了百日咳菌株的紅霉素耐藥現(xiàn)象[1-2]。本課題組的前期研究更是發(fā)現(xiàn)陜西省百日咳菌株不僅對紅霉素耐藥率高,而且耐藥現(xiàn)象開始向大環(huán)內(nèi)酯類其他抗生素蔓延。已有報(bào)道顯示,主動外排基因msr、mef及甲基化酶基因erm的獲得,核糖體蛋白L4突變等是細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機(jī)制[3-4]。此外,有報(bào)道稱百日咳菌株23S r RNA 基因A2047G 位點(diǎn)突變是其對紅霉素耐藥的主要機(jī)制[5]。因此,全面篩查Bp大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥相關(guān)分子特征,對其大環(huán)內(nèi)酯耐藥機(jī)制的研究具有重要意義。

目前尚不清楚百日咳菌株大環(huán)內(nèi)酯類抗生素高耐藥率是否在中國大陸普遍存在,各地流行菌株的基因特征是否一致。為了更好地了解我國當(dāng)下流行百日咳鮑特菌對大環(huán)內(nèi)酯耐藥性及基因型別特征的地區(qū)性差異,我們選取了中國西部代表城市西安市與東部發(fā)達(dá)城市上海市,比較兩市臨床分離百日咳菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性差異和多位點(diǎn)抗原序列分型(MAST)特征的差異。

1 材料與方法

1.1 菌株

根據(jù)臨床表現(xiàn)和現(xiàn)行百日咳診斷標(biāo)準(zhǔn),于2018年至2019年在西安市與上海市哨點(diǎn)監(jiān)測醫(yī)院和社區(qū)采集<1歲臨床疑似百日咳患兒鼻咽拭子(NPS)標(biāo)本作為本次研究樣本。所涉及的對照菌株與序列包括百日咳鮑特菌ATCC9797、金黃色葡萄球菌ATCC29213、23S r RNA 基因標(biāo)準(zhǔn)序列(序列號:X68323)、Gen-Bank 國際標(biāo)準(zhǔn)株Tohama I(BX640415.1)序列、中國百日咳疫苗CS 株(CP002695)序列。

1.2 儀器和試劑

B-G 培養(yǎng)基(含甘油、馬鈴薯和血液的營養(yǎng)培養(yǎng)基,BD,USA),引物合成(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司),基因序列測定(西安擎科生物有限責(zé)任公司),百日咳雙重實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒(生科原,深圳)、百日咳特異性血清(BD,USA)、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素E-Test藥敏條(Bio Merieux,France)。Bio Numerics 7.6軟件(Applied Maths NV,Sint-Latem,Belgium)。

1.3 百日咳鮑特菌的分離培養(yǎng)與PCR檢測

于2018-2019年在西安市和上海市哨點(diǎn)監(jiān)測醫(yī)院和社區(qū)采集<1 歲疑似百日咳患兒鼻咽拭子(NPS)標(biāo)本作為本次研究樣本。提取細(xì)菌總DNA,經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR 方法檢測百日咳特異性IS481基因和百日咳毒素啟動子區(qū)域(ptx-pr)。雙基因陽性患兒可確診為百日咳感染,將雙基因陽性標(biāo)本直接接種于含15%脫纖維羊血、40 mg頭孢氨芐的碳瓊脂培養(yǎng)皿上,可疑菌落通過革蘭染色、觸酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)以及特異性診斷血清凝集試驗(yàn)篩選出百日咳鮑特菌。菌株于30%甘油腦心浸液中-70℃保存待用。

1.4 百日咳鮑特菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性試驗(yàn)

凍存的菌株經(jīng)復(fù)蘇、傳代后挑取菌落稀釋成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?用L棒密涂接種于含10%羊血的B-G培養(yǎng)基。將紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素E-Test藥敏測試條緊貼于B-G 培養(yǎng)基表面,置于35～37℃培養(yǎng)箱孵育,讀取第5～7天的最低抑菌濃度(MIC)值。以百日咳鮑特菌ATCC9797及金黃色葡萄球菌ATCC29213作為質(zhì)控菌株。目前,臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,clsi)和歐洲抗菌藥物敏感性測試委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)尚無關(guān)于百日咳鮑特菌對各種抗菌藥物的敏感及耐藥臨界值。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法,以MIC≤0.016 mg/L判定為敏感,以MIC>0.12 mg/L判定為耐藥[6]。

1.5 可水平轉(zhuǎn)移的耐藥基因檢測

通過抗生素耐藥表型判定后的所有耐藥株及敏感株,參考在多個菌屬的相關(guān)研究中廣泛使用的引物和方法[7-9],對所分離到的百日咳鮑特菌大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥株及敏感株通過PCR 檢測以下可能存在的耐藥基因,包括甲基化酶基因(erm A、erm B、ermC、erm F)、藥物滅活酶基因(ere A、ereB、mph A、mphC)及外排泵基因(mef A、mef E、msr A、msrB、msrC)。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 9797作為陰性對照,本實(shí)驗(yàn)室保存的含有以上耐藥基因的金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、質(zhì)粒Pst Ol-001 及Pst Ol-005 作為陽性對照。

1.6 耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變檢測

參考GenBank中發(fā)布的我國百日咳鮑特菌疫苗株CS的全序列(CP002695.1),對所收集到的百日咳鮑特菌耐藥株、敏感株及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 9797進(jìn)行耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變檢測。分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增23S r RNA 基因的全基因組[10-11],尤其是23S r RNA 基因的Domain Ⅱ的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與 Domain V 區(qū)域(A2047G 位點(diǎn)所在)、核糖體蛋白基因rpl D及rpl V(分別編碼核糖體蛋白L4及L22)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)序列測定和比對,判斷耐藥株中是否存在上述基因的位點(diǎn)突變。

1.7 多位點(diǎn)抗原序列分型 (MAST)

根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]所述方法擴(kuò)增百日咳菌株抗原基因,包括百日咳毒素A 亞基(ptx A)、百日咳毒素啟動子(ptx P)、黏附素(prn)、菌毛(fim)2型和3型并測序,測序所得等位基因提交到https://pubmlst.org/進(jìn)行序列比對。選取百日咳標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC9797和本實(shí)驗(yàn)室保存的等位基因已知的菌株13038 作為對照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)處理數(shù)據(jù)。采用卡方檢驗(yàn)和Fisher 確切概率法分析西安市和上海市分離百日咳菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性和多位點(diǎn)抗原基因型別特征構(gòu)成比的差異,雙側(cè)P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離與特異性基因擴(kuò)增

本研究共采集到疑似百日咳患兒鼻咽拭子1 260例,經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR 方法檢測出IS481和ptx P 雙陽性樣本156份,接種于含脫纖維羊血和頭孢氨芐的碳瓊脂培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)得到百日咳菌株60株,其中西安市34株,上海市26株。

2.2 菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥表型檢測

E-Test試驗(yàn)結(jié)果顯示,西安市分離34株百日咳鮑特菌中,有31株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素均耐藥(MIC≥256 mg/L),1株對紅霉素和阿奇霉素耐藥、對克拉霉素敏感,2株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素均敏感(MIC<0.016 mg/L)。上海市分離26株百日咳鮑特菌中,有14株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素均耐藥(MIC≥128 mg/L);12株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素均敏感(MIC<0.016 mg/L),如圖1。兩市臨床分離百日咳鮑特菌耐藥性的比較見表1,可見兩市菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性存在差異(χ2=13.650,P<0.001),西安市絕大部分菌株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素均耐藥,而上海市菌株耐藥率相對較低,耐藥株與敏感株幾乎各占一半。

表1 西安市和上海市百日咳鮑特菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的比較Tab.1 Comparison of the macrolide resistance of Bordetella pertussis collected from Xi’an and Shanghai

圖1 百日咳鮑特菌分離株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的藥敏試驗(yàn)Fig.1 Test of the macrolide resistance of Bordetella pertussis strains

2.3 耐藥基因檢測

與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥相關(guān)的基因包括甲基化酶基因(erm A、ermB、ermC、erm F)、藥物滅活酶基因(ereA、ereB、mphA、mphC)及外排泵基因(mef A、mef E、msr A、msrB、msrC)。經(jīng)擴(kuò)增檢測,西安市和上海市的60株百日咳菌株中,對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感的14株百日咳鮑特菌均不攜帶以上耐藥基因;對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的46株菌株均不攜帶藥物滅活酶基因(ere A、ereB、mph A、mphC)和外排泵基因(mef A、mef E、msr A、msr B、msrC),甲基化酶基因中攜帶一定比例的erm A、erm B,攜帶率分別為西安市erm A(25.0%,8/32)、erm B(28.1%,9/32),上海市erm A(14.3%,2/14)、erm B(21.4%,3/14),不攜帶ermC、erm F(圖2)。

圖2 erm A與erm B基因PCR 產(chǎn)物鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of gene PCR products of erm A and erm B

2.4 突變位點(diǎn)檢測

通過擴(kuò)增23S r RNA 基因的全基因組,尤其是23S r RNA 基因的Domain V 區(qū)域(A2047G 位點(diǎn)所在)與Domain Ⅱ的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、核糖體蛋白基因rplD及rpl V,經(jīng)純化后測序。測序結(jié)果顯示,西安市和上海市對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感的14株百日咳鮑特菌均未發(fā)現(xiàn)A2047G 位點(diǎn)突變,對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的46株菌株均發(fā)生A2047G位點(diǎn)突變;所有菌株在Domain Ⅱ區(qū)域及rpl D、rpl V 基因上均未發(fā)現(xiàn)突變。

2.5 西安市與上海市分離菌株MAST型別特征比較

西安市分離百日咳菌株抗原基因中,prn得到三個等位基因,為prn1、prn2和prn9;ptx P得到兩個等位基因,為ptx P1和ptx P3;ptx A、fim2和fim3各得到一個等位基因,為ptx A1、fim2-1和fim3-1。共得到三種抗原序列型別,分別為prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1(94.1%,32/34)、prn9/ptx P3/ptx A1/fim3-1/fim2-1(2.9%,1/34)和prn2/ptx P3/ptx A1/fim3-1/fim2-1(2.9%,1/34)。上海市分離百日咳菌株抗原基因中,prn得到三個等位基因,為prn1、prn2 和prn4;ptx P得到兩個等位基因,為ptx P1和ptx P3;fim3得到兩個等位基因,為fim3-1和fim3-4;ptx A和fim2各得到一個等位基因,為ptx A1和fim2-1。菌株共得到四種抗原序列型別,分別為prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1(50.0%,13/26)、prn2/ptx P3/ptx A1/fim3-1/fim2-1(42.3%,11/26)、prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-4/fim2-1(3.8%,1/26)、prn4/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1(3.8%,1/26)。兩市菌株抗原序列型別分布見表2,運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析構(gòu)成比的差異,可得χ2=18.642,P<0.001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 西安市與上海市分離菌株多位點(diǎn)抗原序列分型構(gòu)成比比較Tab.2 Comparison of the MAST types of Bordetella pertussis collected from Xi’an and Shanghai

2.6 MAST分型與耐藥特征之間的關(guān)聯(lián)性分析

研究結(jié)果顯示,所有ptx P3 型菌株(prn2 或prn9/ptx P3/ptx A1/fim3-1/fim2-1型)對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素全部敏感并且未出現(xiàn)2047位點(diǎn)變異;ptx P1 型菌株中,除1 株(prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-4/fim2-1型)對三種抗生素敏感外,其余兩種型別菌株(prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1 型和prn4/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1型)均表現(xiàn)出耐藥表型,并且出現(xiàn)2047位點(diǎn)變異,其中prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1 型菌株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素全部耐藥,prn4/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1型對紅霉素和阿奇霉素耐藥,而對克拉霉素敏感。此外,本研究中所檢出的耐藥基因(甲基化酶基因erm A和erm B)均出現(xiàn)于prn1/ptx P1/ptx A1/fim3-1/fim2-1 型菌株中(表3)。

表3 百日咳鮑特菌多位點(diǎn)抗原基因型與耐藥表型關(guān)聯(lián)性分布Tab.3 Distribution of correlation between MAST types and drug resistance phenotypes of Bordetella pertussis

3 討 論

自1994年美國報(bào)道了第1例對紅霉素耐藥百日咳桿菌以來,國內(nèi)外多地報(bào)道了百日咳菌株的紅霉素耐藥現(xiàn)象,但在國外耐藥尚不多見[9]。在國內(nèi),陜西省分離百日咳菌株超過80%對紅霉素耐藥[10],天津市分離百日咳菌株超過90%對紅霉素耐藥[14],而其他地區(qū)關(guān)于百日咳菌株耐藥的研究較少。在本研究中,西安市和上海市菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=13.650,P<0.001),西安市絕大部分菌株對紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素均耐藥,提示對西安市嬰幼兒感染百日咳的治療中應(yīng)盡量避免使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。有研究提出,對于大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的百日咳患兒采用復(fù)方新諾明進(jìn)行治療可取得較好的療效[15];而對于成人耐藥患者可選用左氧氟沙星或強(qiáng)力霉素進(jìn)行治療,我們在后期將針對這一報(bào)道進(jìn)行深入研究。

目前,關(guān)于百日咳菌株抗原基因型別的研究顯示,國內(nèi)外百日咳菌株ptx A、fim3和fim2基因均以ptx A1、fim3-1、fim2-1 為優(yōu)勢型別,prn1 和ptx P基因型我國以prn1和ptx P1檢出率較高,而國外尤其是發(fā)達(dá)國家以prn2 和ptx P3 更為多見[12]。在本研究中,西安市和上海市ptx A、fim3、fim2基因與前者的研究一致,絕大部分為ptx A1、fim3-1和fim2-1型,而prn和ptx P的分布存在差異。西安市與上海市分離百日咳菌株抗原序列型別分布進(jìn)行構(gòu)成比差異的檢驗(yàn),可得χ2=18.642,P<0.001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西安市百日咳鮑特菌菌株基本上以prn1/ptx P1型別為主,而上海市prn1/ptx P1 與prn2/ptx P3型別幾乎平分秋色,各占一半。發(fā)達(dá)國家于20世紀(jì)50年代至70年代間陸續(xù)引進(jìn)并接種百日咳疫苗[16],上海市從1960 年開始接種百日咳疫苗[17],而西安市從1978年才開始接種。從時間點(diǎn)來看,上海市引進(jìn)并接種百日咳疫苗比西安市更早,人群免疫狀態(tài)更接近發(fā)達(dá)國家,這有可能是上海市當(dāng)下流行百日咳鮑特菌基因型別較西安更接近發(fā)達(dá)國家的可能原因之一。

本研究所發(fā)布的數(shù)據(jù)為改進(jìn)我國百日咳的防治提供了參考,提示應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)我國百日咳菌株耐藥性和基因型演變的監(jiān)測。但本研究所收集菌株只來自西安市和上海市,未涉及其他城市,范圍不夠廣,菌株數(shù)量亦不夠多,故此結(jié)果具有一定的局限性。在以后的研究中還需擴(kuò)大采樣范圍,拓寬采樣年份并加大樣本數(shù),從全國多個城市多采集樣本從而使結(jié)果更具代表性。