肺泡灌洗液宏基因二代測序在不明病原體肺部感染中的診斷價(jià)值

夏勇惠，高秀峰，王 慧，黃友明

(皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,安徽 蕪湖 241000)

肺部感染是呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科常見的疾病之一，當(dāng)肺部感染性疾病的病原體診斷不明確時(shí)，臨床醫(yī)生往往根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選用抗生素，不能使用針對性的抗菌藥物進(jìn)行治療，若抗菌藥物未能覆蓋病原體及治療療程不足會導(dǎo)致患者病情加重，甚至死亡[1]。在不明確病原體時(shí)，臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療同時(shí)標(biāo)本送檢微生物培養(yǎng),但常規(guī)微生物培養(yǎng)陽性率低,往往不能明確，這將導(dǎo)致抗菌藥物多用、濫用，甚至誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，所以肺部感染性疾病診療的決定因素是找到致病病原體[2]。宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一種測定病原體的核酸序列，然后與已知病原體核酸基因庫進(jìn)行對比，從而明確病原體的檢測方法。mNGS檢測高效迅速，并可廣泛覆蓋已知病原體，尤其對重癥、免疫缺陷患者感染的少見病原體、機(jī)會性感染病原體的檢出有重要意義[3-4]。本文回顧性分析皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治30例不明病原體肺部感染患者，研究肺泡灌洗液mNGS對不明病原體肺部感染的診斷和治療價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科2020年8月～2021年8月收治的30名不明病原體肺部感染患者，男18例，女12例，年齡27～86(59.2±16.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①肺部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南2016版[5]；②年齡>18歲；③均行傳統(tǒng)病原體檢測(痰涂片、痰培養(yǎng)、肺泡灌洗液培養(yǎng))及肺泡灌洗液mNGS檢測；④均自愿行支氣管鏡檢查、mNGS檢測并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心臟疾病(嚴(yán)重心功能不全、急性心肌梗死、惡性心律失常)；②急性腦出血或腦梗塞；③嚴(yán)重血液病有出血傾向，血小板計(jì)數(shù)<20×109/L；④活動(dòng)性大咯血；⑤女性妊娠期；⑥患者不能配合。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 痰標(biāo)本采集：晨起后用生理鹽水漱口2次，再用力咳出深部痰，無菌痰杯收集深部痰1～2 mL。立即送檢，行痰涂片、痰培養(yǎng)。肺泡灌洗液標(biāo)本采集：選擇肺部影像上新病變或進(jìn)展性病變的肺段；在目標(biāo)肺段由操作孔注入2%利多卡因1～2 mL局部麻醉后，經(jīng)操作孔分次注射生理鹽水(每次20～30 mL)，總量80～100 mL,回收率≥30%，回收的灌洗液分別用無菌管收集。取肺泡灌洗液20 mL行涂片、培養(yǎng)，取肺泡灌洗液10mL行mNGS檢測。立即送檢，若延遲送檢，將標(biāo)本保存于4℃冰箱。

1.2.2 肺泡灌洗液mNGS檢測及分析 所采集肺泡灌洗液10 mL，冷藏保存，均送檢至杭州杰毅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室行定量宏基因組檢測。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)檢測與肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率的比較 傳統(tǒng)病原體檢測(痰涂片、痰培養(yǎng)、肺泡灌洗液培養(yǎng))陽性患者6例(陽性率20.0%)，肺泡灌洗液mNGS檢測陽性患者25例(陽性率83.3%)。肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率高于傳統(tǒng)病原體檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測陽性率的比較

2.2 肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測病原體分布 25例肺泡灌洗液mNGS檢測陽性患者病原體分布：單一病原體7例(肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、鸚鵡熱衣原體、耶氏肺孢子菌、煙曲霉各1例)；鏈球菌2例(中間鏈球菌、緩癥鏈球菌各1例)；人皰疹病毒2例；分枝桿菌12例(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群7例，龜分枝桿菌4例，鳥型分枝桿菌復(fù)合群1例)；混合感染2例(非典型韋榮氏球菌、空腸普雷沃菌、溶齒放線菌、葛氏放線菌、副血鏈球菌混合1例，嗜麥芽窄食單胞菌、紋帶棒狀桿菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌混合1例)。6例傳統(tǒng)檢測組陽性患者病原體分布：緩癥鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌各1例，結(jié)核分枝桿菌2例(痰涂片抗酸染色陽性)。肺泡灌洗液mNGS對分枝桿菌、真菌及機(jī)會感染病原體的檢出高于傳統(tǒng)病原體檢測。

2.3 肺泡灌洗液mNGS檢測結(jié)果指導(dǎo)用藥和經(jīng)驗(yàn)性治療療效比較 肺泡灌洗液mNGS檢測病原體針對性藥物治療療效(88.0%)優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)性藥物治療(40.0%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 肺泡灌洗液mNGS檢測結(jié)果指導(dǎo)用藥后療效比較

3 討論

肺部感染是呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的常見病，若感染不能有效控制，病情可進(jìn)一步進(jìn)展為重癥感染而危及生命。國外研究報(bào)道[6-7]，成人及兒童肺部感染在全球常見疾病中患病率及病死率居第2位，疾病所致負(fù)擔(dān)僅低于缺血性心臟病。而肺部感染治療的關(guān)鍵在于明確病原體，給予針對性的抗感染治療。肺部感染病原體相對復(fù)雜，有細(xì)菌、病毒、真菌及特殊病原體等。特別是使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，惡性腫瘤，器官移植術(shù)后及免疫功能低下的患者容易出現(xiàn)各種少見病原體感染、混合感染及機(jī)會感染[8-9]，使診斷及治療難度增加。目前臨床上明確病原體方法主要為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，其陽性結(jié)果雖有明確診斷意義，但是存在陽性率低、培養(yǎng)周期長、診斷準(zhǔn)確率有限等缺點(diǎn)[10]。

2014年使用mNGS技術(shù)查找病原體被首次報(bào)道[11]，并起到?jīng)Q定性作用。近年來，mNGS技術(shù)已越來越多地應(yīng)用于肺部感染疾病病原體的診斷。mNGS技術(shù)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)相比具有高通量、廣覆蓋、快速鑒定、高度靈敏等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)陰性患者，特別是危急重癥、合并免疫抑制、疑難罕見病患者行mNGS檢測有重要的診斷價(jià)值[12]。本研究共納入30例患者，傳統(tǒng)病原體檢測陽性患者6例，陽性率20.0%。肺泡灌洗液mNGS檢測陽性患者25例，陽性率83.3%。肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率高于傳統(tǒng)病原體檢測。本研究發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體1例；耶氏肺孢子菌1例；煙曲霉1例；人皰疹病毒2例；分枝桿菌12例；混合感染2例。說明mNGS技術(shù)在分枝桿菌、真菌及機(jī)會感染病原體明確診斷上有一定優(yōu)勢。

有研究報(bào)道m(xù)NGS技術(shù)對重癥肺部感染患者抗感染藥物使用有指導(dǎo)意義，并可使患者臨床獲益[13]。本研究發(fā)現(xiàn)：肺泡灌洗液mNGS陽性患者25例，均根據(jù)肺泡灌洗液mNGS檢測病原體選用針對性藥物治療，治療后肺部影像學(xué)病灶吸收及感染指標(biāo)恢復(fù)正?；颊?2例，好轉(zhuǎn)率88.0%，所以根據(jù)肺泡灌洗液mNGS檢測病原體選用針對性藥物治療，療效明顯優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)性藥物治療。

本研究發(fā)現(xiàn)30例肺部感染患者肺泡灌洗液mNGS檢測陽性患者25例，陰性患者5例，陰性率16.7%。說明盡管mNGS技術(shù)在明確病原體檢測上具有明顯優(yōu)勢，但同時(shí)也有一定局限性。mNGS技術(shù)檢測微生物需與數(shù)據(jù)庫病原微生物基因組序列比對[14]。雖然目前數(shù)據(jù)庫已有大量病原微生物基因序列，但尚需進(jìn)一步完善。mNGS有破壁缺陷，在處理胞內(nèi)菌及厚壁病原體肺泡灌洗液標(biāo)本時(shí)，可出現(xiàn)序列數(shù)減少及假陰性。mNGS尚不能有效區(qū)分檢測到的病原體是污染菌、定植菌，還是致病菌，且病原微生物序列數(shù)、相對豐度與致病性尚無關(guān)聯(lián)性標(biāo)準(zhǔn)。mNGS檢測結(jié)果的判讀尚有人源背景影響，需要完善新數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)以解決上述問題[15]。不同的生物檢測公司數(shù)據(jù)庫、儀器設(shè)備、標(biāo)本處理均不盡相同，都可能使檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差。所以mNGS技術(shù)現(xiàn)在尚不能完全取代傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)方法。

總而言之，肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統(tǒng)檢測相比有助于提高肺部感染的病原體檢出率，特別是分枝桿菌、真菌及機(jī)會感染病原體的檢出，從而指導(dǎo)抗微生物藥物的精準(zhǔn)治療，提升治療效果。肺泡灌洗液mNGS檢測在肺部感染中有非常高的臨床應(yīng)用價(jià)值。但mNGS技術(shù)在臨床應(yīng)用中尚有不足，需進(jìn)一步研究完善。