仙樂雄膠囊對環(huán)磷酰胺誘導的小鼠生精功能損傷的保護作用

徐詩霞，李麗華，梁 亮，李 萍，張超凡，王 娟，沈可欣，喻麗珍,1b

(1.皖南醫(yī)學院 a.藥學院;b.現代中藥研究所，安徽 蕪湖 241002;2.蕪湖綠葉制藥有限公司 中藥制劑研究中心，安徽 蕪湖 241008)

據統計，全球約10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，即使現代診斷學技術日趨進步，其中仍有約40%～75%的男性患者存在不明原因的精液質量問題[1]。有文獻報道，少弱精癥的發(fā)生可能與機體內氧化應激損傷有關，正常男性體內存在動態(tài)平衡的氧化系統和抗氧化系統，生殖器官產生的各類活性氧(reactive oxygen species,ROS)可通過抗氧化系統的各類酶清除，使得睪丸、附睪尾等組織免于損傷[2]。近年來，國內外增強男性性功能的西藥存在較多副作用，而中醫(yī)藥因具有藥理作用緩和、毒副作用較小等特點逐漸受到認可[3]。仙樂雄膠囊是基于我國天然藥物資源開發(fā)出的中藥復方制劑，其君藥淫羊藿苷成分可顯著提高雄性動物的性器官指數和血清睪酮(Testosterone,T)水平，使去垂體大鼠仍表現出一定的類性激素樣作用[4]，主要用于腎陽不足導致的勃起功能障礙的治療。目前仙樂雄膠囊對男性少弱精癥引起的不育研究較少，本研究主要探討仙樂雄膠囊對少弱精癥小鼠生精功能的作用，為擴大該藥臨床適應證提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級ICR小鼠，雄性，60只，體質量約16～18 g，購自山東省濟南朋悅實驗動物有限公司[許可證號SCXK(魯)20190003]，自由給水和食物，12 h光照/12 h黑暗。

1.2 藥物與試劑 仙樂雄膠囊(0.3 g/粒，批號180327)，蕪湖綠葉制藥有限公司提供。注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)(0.2 g/瓶，批號18111725)，購于江蘇盛開迪醫(yī)藥有限公司；生精膠囊(每粒裝0.4 g)，購于遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司；復方玄駒膠囊(每粒裝0.42 g，批號20190207)，購于浙江施強制藥有限公司；小鼠T ELISA試劑盒(批號CK-E30384)購于上海酶聯生物科技有限公司；小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(貨號A001-3)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)(貨號A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-px)(貨號A005)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)等試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動物模型的建立與分組 將購進的ICR小鼠隨機分為6組，每組10只，依次為正常對照組、CP模型組、仙樂雄膠囊低劑量組(300 mg/kg)、高劑量組(600 mg/kg)、生精膠囊組(100 mg/kg)、復方玄駒膠囊組(500 mg/kg)，其中仙樂雄膠囊低劑量組、生精膠囊組、復方玄駒膠囊組均為臨床等效劑量組[5]。除正常對照組給予同等劑量的溶媒外，其余各組給予相應藥物灌胃30 d，自第25天開始模型組及各給藥組以CP(60 mg/kg，腹腔注射)進行造模，持續(xù)5 d，正常對照組腹腔注射等劑量生理鹽水。

1.4 觀察指標 統計分析各組小鼠臟器指數(質量)、精子濃度、精子畸形率、單側睪丸或附睪尾組織病理學特征、外周血清T水平、睪丸組織SOD、GR、GSH-px、MDA等的活性。

2 結果

2.1 仙樂雄膠囊對各組小鼠器官指數和質量的影響 CP模型組小鼠的睪丸指數、附睪尾質量均低于正常對照組(P<0.05)；與CP模型組相比，仙樂雄高劑量組、生精膠囊組和復方玄駒膠囊組睪丸指數、附睪尾質量均增加(P<0.05)，仙樂雄低劑量組小鼠附睪尾質量增加，但各組腎臟質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠器官指數或質量

2.2 仙樂雄膠囊對各組小鼠精子數量的影響 CP模型組小鼠附睪尾部精子濃度低于正常對照組(P<0.05)；與CP模型組相比，仙樂雄低劑量及高劑量組、生精膠囊組和復方玄駒膠囊組精子濃度均增加(P<0.05)，且高劑量組精子濃度增加優(yōu)于復方玄駒膠囊組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠精子計數

2.3 仙樂雄膠囊對各組小鼠精子形態(tài)的影響 CP模型組小鼠畸形率高于正常對照組(P<0.05)，精子畸形主要表現為斷頭或斷尾、香蕉型以及少見的雙體等形態(tài)，見圖1；與CP模型組相比，仙樂雄低劑量及高劑量組、生精膠囊組和復方玄駒膠囊組精子畸形率均降低(P<0.05)；且生精膠囊組精子畸形率低于仙樂雄高劑量組(P<0.05)。見表3。

A.正常小鼠精子；B～D.箭頭所指為CP誘導下的畸形精子。

表3 各組小鼠精子畸形率

2.4 仙樂雄膠囊對各組小鼠睪丸和附睪尾組織病理學影響 HE染色結果顯示，正常對照組小鼠睪丸組織生精小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整緊密，管內可見大量精子；附睪尾組織管腔亦可見大量精子，附睪管排列有序，未見明顯異常(圖2A、3A)。CP造模后，CP模型組小鼠睪丸組織曲細精管細胞層數減少，管腔內各級生精細胞排列紊亂，生精細胞出現較多脫落壞死；附睪尾組織出現大量浸潤的炎癥細胞和部分圓形細胞，精子數量及比例明顯減少(圖2B、3B)。給藥后，仙樂雄低劑量組組織病理改變并不明顯(圖2C、3C)，仙樂雄高劑量組小鼠睪丸及附睪尾病理明顯改善(圖2D、3D)。生精膠囊組小鼠睪丸組織均較CP模型組有明顯改善，但復方玄駒膠囊組小鼠的附睪尾組織仍可見少量浸潤的炎性細胞和圓形細胞(圖2E～F、3E～F)。

A.正常對照組；B.CP模型組；C.仙樂雄低劑量組；D.仙樂雄高劑量組；E.生精膠囊組；F.復方玄駒膠囊組。

A.正常對照組；B.CP模型組；C.仙樂雄低劑量組；D.仙樂雄高劑量組。

2.5 仙樂雄膠囊對各組小鼠外周血清T的影響 CP模型組小鼠外周血清T水平低于正常對照組(P<0.05)；與CP模型組相比，仙樂雄高劑量組、生精膠囊組以及復方玄駒膠囊組血清T水平均改善(P<0.05)，且高劑量仙樂雄組小鼠的外周血T水平高于低劑量組與生精膠囊組(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠外周血清T表達水平

2.6 仙樂雄膠囊對各組小鼠睪丸組織氧化應激相關指標的影響 與正常對照組比較，CP模型組小鼠睪丸組織SOD、GR、GSH-px活力降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)；與CP模型組相比，仙樂雄高劑量組、生精膠囊組和復方玄駒膠囊組SOD、GR、GSH-px活力上調(P<0.05)，仙樂雄低劑量組SOD活力增強(P<0.05)，各用藥組MDA下降(P<0.05)，詳見表5。

3 討論

近年來，“氧自由基”學說的研究倍受關注，由于ROS類物質可與細胞內DNA等作用發(fā)生氧化反應，損傷細胞結構。而精子內含細胞質成分較少，非飽和脂肪酸較多，因此抗氧化能力較差，易產生精子結構和功能的損傷[6]。有研究顯示，CP可通過使機體內氧化系統與抗氧化系統失衡，造成睪丸組織內ROS代謝物積累，進而引起精子細胞膜脂質發(fā)生過氧化，DNA發(fā)生碎片化，引發(fā)男性少精弱精或精子畸形[7]。本研究發(fā)現經CP誘導后，ICR小鼠睪丸指數、附睪尾質量顯著降低，精液濃度明顯下降，畸形精子數量大大增加，睪丸組織曲細精管細胞層數減少，管腔內各級生精細胞排列紊亂且脫落壞死，附睪尾組織出現大量浸潤的炎癥細胞和部分圓形細胞，精子數量明顯減少，血清T水平明顯下降。

仙樂雄膠囊是由淫羊藿、人參、鹿茸、狗鞭、牛鞭、熟地黃構成的中藥復方制劑，具有溫腎補氣、益精助陽的功效。仙樂雄膠囊聯合強精沖劑治療1個月后可將精液濃度和活力升高至近正常水平，3個月后外周血T和雌二醇水平接近正常值[8]。淫羊藿作為仙樂雄膠囊的君藥，主要成分淫羊藿苷可顯著提高皮質氧化應激快速老化小鼠的抗氧化能力[9]。許立等研究發(fā)現，仙樂雄膠囊中臣藥人參可通過抑制氧自由基的產生而顯著降低小鼠睪丸組織過氧化物的含量，進而產生抗氧化保護作用[10]。

本研究檢測了睪丸組織抗氧化相關酶，結果顯示，CP模型組小鼠SOD、NOS以及GSH-px顯著降低，MDA顯著增加。CP模型組小鼠睪丸組織MDA顯著增加，SOD、GR以及GSH-px酶活力明顯降低。仙樂雄顯著改善了上述指標，推測可能通過改善SOD、GR以及GSH-px酶活性或含量，進而增加精子濃度，減少精子畸形率，改善睪丸、附睪尾病理評分等，提高生殖器官指數或質量。而仙樂雄膠囊對雄性小鼠外周血清T的影響可能是其淫羊藿苷成分通過調節(jié)下丘腦-性腺-睪丸軸體現該藥的性激素樣作用，這與文獻報道基本一致[11-12]。

綜上所述，仙樂雄膠囊可通過增強CP誘導的少精畸精癥小鼠模型睪丸組織SOD、GR以及GSH-px等抗氧化酶活性，降低MDA水平，改善CP誘導的睪丸組織損傷，提高小鼠外周血T水平和器官指數或質量，具有重要的臨床價值。