計算機軟件模擬α-乳白蛋白與皂苷的分子對接

胡嘉倫，姜瞻梅

（東北農業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

皂苷是在許多植物中發(fā)現(xiàn)的次生化合物，在肥皂水等溶液中形成穩(wěn)定的泡沫，因此得名“皂苷”。皂苷廣泛分布于中藥植物和一些海洋動物中，含有多種生物活性物質，這些物質是由三萜或非極性甾體苷元通過糖苷醚或酯鍵連接到親水寡糖的一個或多個部分組成的[1]。皂苷的分類方法有很多種，根據皂苷配基的結構將皂苷分為甾體皂苷和三萜皂苷。甾體皂苷大部分由27 個碳原子組成，其配基是螺甾烷的衍生物，主要存在于豆科、遠志科、天南星科等植物中；三萜皂苷大部分由30 個碳原子組成，其配基為三萜的衍生物，主要存在于薯蕷科、百合科等植物中。皂苷具有多種藥理作用，包括保護心腦血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫調節(jié)等[2]。此外，最近有研究報道稱，皂苷分子可以通過誘導細胞凋亡或促進細胞分化來減輕化療后的副作用[3]。

α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）是乳清蛋白中的一種重要蛋白質，占乳清蛋白總量的20%～25%。作為一種鈣結合蛋白，α-LA廣泛分布于人類和其他哺乳動物的乳中，在牛乳中的質量濃度為1.0～1.5 g/L（約占牛乳總蛋白的3.4%）[4]。除此之外，α-LA作為一種球狀蛋白，主要含有α-螺旋結構，包括4 個主要的α-螺旋和3 個小的β-折疊。α-LA由于其高營養(yǎng)價值、功能特性和高生物相容性，在食品工業(yè)加工中發(fā)揮著關鍵作用[5]。

分子對接是運用計算機技術和理論模型相結合，在線上對分子間的結合過程進行模擬，將小分子和蛋白質的作用結果直觀展現(xiàn)出來。分子對接原理主要基于受體理論（“鎖鑰模型”）和“契合學說”[6]。分子對接技術通過不斷優(yōu)化小分子化合物的空間位置、構象、分子可旋轉的二面角和受體氨基酸殘基側鏈和骨架，根據軟件相應的打分函數，篩選出小分子與靶向大分子結合的最佳構象并進行分析[7]。目前，分子對接技術可以直觀反映配體與受體的相互作用信息，已發(fā)展成為一種預測分子間相互作用結合位點的新方法。Chen Wei等[8]比較α-LA與3 種脂溶性維生素的相互作用，并利用分子對接技術說明其作用機理；Bagheri等[9]通過熒光光譜法、紫外可見光譜法、傅里葉變換紅外光譜法和分子建模法研究α-LA與索拉非尼相互作用時的結合特性和構象變化；Shi Ruijie等[10]通過多光譜分析，結合計算機模擬方法，闡明了α-LA和甘草酸在中性和酸性條件下被靜態(tài)猝滅，同時結合親和力的遞減順序為pH 7.0＞4.5＞2.5；同時，Shi Ruijie等[11]還采用多光譜、分子對接和分子動力學模擬等方法，系統(tǒng)研究了α-LA與甘草酸和人參皂苷在pH 7.0條件下的結合行為機制和發(fā)泡性能。

近年來，α-LA由于其特有的空間構象引起各國學者關注。皂苷與蛋白質的相互作用可以改變食品的發(fā)泡和乳化能力、使溶液形式發(fā)生變化、增加蛋白質變性等。與蛋白質發(fā)生以上反應是因為皂苷中存在各種不同基團。同時，皂苷對蛋白質不同的作用取決于蛋白質中不同的空間結構和氨基酸組成。皂苷小分子與蛋白之間的相互作用可能是由于疏水鍵、氫鍵、分子間作用力等或幾種作用力的共同作用。正常小分子進入體內以游離態(tài)存在，與靶細胞結合后發(fā)揮作用。而皂苷屬于結合能力較弱的藥物小分子，因此，將皂苷包埋在蛋白里可以有效減少皂苷小分子的游離，使其到達靶細胞處釋放，提高其藥效，實現(xiàn)了蛋白與結合態(tài)及游離態(tài)皂苷的動態(tài)平衡。本研究主要利用計算機分子模擬技術，在“鎖鑰模型”和結合能量最優(yōu)理論基礎上，探究不同皂苷小分子與α-LA的相互作用。通過對皂苷小分子和α-LA進行模擬分子對接，利用對接軟件SYBYL可以更加全面、清晰地了解二者相互作用的狀態(tài)。部分皂苷可以明顯猝滅蛋白的內源熒光，從而導致發(fā)色團周圍的疏水性減弱、部分肽鏈延伸、分子極性增強等。除此之外，通過模擬對接的情況，將對接結果與目前成熟的研究結果對比，可以更加深入討論不同小分子與蛋白質之間相互作用的熱力學本質，進一步探究皂苷小分子的結構及其猝滅蛋白發(fā)光基團熒光之間的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 結構查詢

人參皂苷Rb1、酸棗仁皂苷A、絞股藍皂苷、大豆皂苷Ⅰ、三七皂苷R1、苜蓿皂苷P1、白頭翁皂苷D、山茶花皂苷C2的分子結構由有機小分子生物活性數據庫（PubChem）獲得；α-LA的三維結構由蛋白質結構數據庫（PDB）獲得。

1.2 實驗軟件

本研究采用Sybyl 2.0模擬軟件運算藥物小分子皂苷與α-LA的可視化對接。生物蛋白受體與小分子相互結合時，通常使用方法為計算機分子模擬（Sybyl 2.0版本），包括“計算化學”和“分子模擬”，Sybyl可以研究大分子或小分子的結構性能。除此之外，Sybyl中的Surflex-Dock對接模式，可以更好地針對分子的柔性狀態(tài)進行限制性對接。在分子模擬中，蛋白活性位點口袋通過利用Protomol（原型分子）標記。原型分子是在形狀和性能方面能夠與受體蛋白的結合口袋較好匹配的臆想分子結構。如果蛋白質中有配體小分子，可以通過小分子來確定結合口袋；如果沒有已知小分子，則可通過軟件自動搜索或通過文獻確定蛋白質活性口袋中的關鍵殘基，從而分析對接信息。

1.3 分子對接

1.3.1 皂苷單體的結構查詢

打開PubChem后，輸入對應皂苷的編號（人參皂苷CID 9898279、大豆皂苷CID 122097、三七皂苷CID 449134、苜蓿皂苷CID 190920、白頭翁皂苷CID 11650910、山茶花皂苷CID 44202125、絞股藍皂苷CID 102600811、酸棗仁皂苷CID 51346169），在PubChem下載這些小分子的二維結構后，另存為PDB模式，運行Sybyl對小分子進行優(yōu)化處理后保存。

1.3.2α-LA的結構查詢

打開PDB后，輸入α-LA的編號（ID：1F6S，牛源），在PDB將其三維結構下載后，用Sybyl進行加氫、去金屬離子、去水分子等預處理后保存。

1.3.3 皂苷與α-LA的分子對接

利用Sybyl中Surflex-Dock模塊進行對接。在Sybyl中輸入蛋白結構與皂苷結構后運行此模塊，將蛋白與皂苷分子進行整合，通過Surflex-Dock的精確對接程序運算，對接后的蛋白與皂苷分子的結構將顯示在Sybyl界面，并出現(xiàn)一系列Surflex-Dock打分。

將對接好的結果導入Pymol和Ligplot軟件中，進行角度的旋轉、鍵長鍵能的顯示、結構的美化等一系列處理后保存，得到最終的可視化處理結果。分子對接流程示意圖如圖1所示。

圖1 分子對接流程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the molecular docking process

2 結果與分析

2.1 α-LA的預處理

在計算分子模擬對接過程中，受體物質（蛋白質）的預處理一般包括如下幾個方面：1）根據能量最低原則和蛋白分子與皂苷小分子幾何互補的評價標準來篩選蛋白活性口袋；2）通過Sybyl確定蛋白質與皂苷分子的高精確結合模式；3）通過Sybyl上的動力學模塊對受體蛋白進行預處理，如去配體、加磁場、能量優(yōu)化等。除此之外，通過軟件的柔性對接方法可以讓蛋白質氨基酸殘基的側鏈和骨架在某一程度上發(fā)生改變[12]。具體如圖2所示。

圖2 導入處理的α-LA結構Fig. 2 Three-dimensional structure of α-LA before and after pretreatment

2.2 皂苷小分子的預處理及Surflex-Dock打分

當利用分子模擬軟件Sybyl對蛋白質和小分子進行對接時，軟件會選擇結構最佳的小分子進行對接。由于程序運算和尋找的方式具有隨機性，在Sybyl對接模塊中，程序會根據藥物分子結構的能量模式是否與蛋白質進行最優(yōu)結合進行打分。因此，在對接前需將藥物小分子皂苷進行能量最小化處理。Surflex-Dock的對接結果以打分形式表現(xiàn)?？偡诛@示了二者對接結果的好壞；配體和受體之間的不適當滲透一般為負值，接近零更好；二者形成的復合物中的氫鍵作用和靜電作用，分數越高，作用越強。由表1可知，大豆皂苷Ⅰ、苜蓿皂苷P1、酸棗仁皂苷A和人參皂苷Rb1與α-LA親和力較強，結合程度相對較好，且它們與α-LA之間形成的氫鍵作用和靜電作用較強。

表1 Surflex-Dock對接結果打分Table 1 Results of Surflex-Dock docking

除此之外，運用Pymol和Ligplot將對接結果進行可視化處理。

2.3 達瑪烷型三萜皂苷與α-LA間相互作用

達瑪烷型皂苷為四環(huán)三萜型皂苷，其結構由全椅式構象從環(huán)氧鯊烯形成達瑪烷骨架，羥基取代在C3、C12、C20位，β-構型的角甲基存在于C8位。除此之外，β-H連在C13位，β-CH連在C10位，β-側鏈在C17位?，F(xiàn)有的研究表明，達瑪烷型皂苷可有效預防和治療糖尿病[13]。人參皂苷Rb1是含有4 種糖的人參三醇，可以改善新生幼鼠的肺損傷[14]，其結構式如圖3A所示；三七皂苷R1是從三七中分離得到的主要成分，具有抗炎等作用[15]，其結構式如圖3B所示；絞股藍皂苷具有多種生物活性，如抗脂質活性、抗炎、預防心腦血管疾病[16]等功能，其結構式如圖3C所示；酸棗仁皂苷A是從酸棗仁中提取的一種中草藥活性成分，其在癡呆小鼠模型中具有神經保護作用，可以對抗氧化應激[17]，其結構式如圖3D所示。

圖3 不同達瑪烷型皂苷的分子結構Fig. 3 Structures of different dammarane-type saponins

人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、絞股藍皂苷和酸棗仁皂苷A與α-LA的相互作用過程中，二者之間相互作用模式和在結合過程中涉及的主要氨基酸殘基分別如圖4～5所示，疏水作用和氫鍵參與了達瑪烷型皂苷與α-LA之間的相互作用。

由圖4A和5A可知，Leu105、Ala106、Thr33、Val142、Gly35、Ser34、Phe31、Leu110和Ala109參與了人參皂苷Rb1與α-LA結合時的疏水作用。人參皂苷Rb1與His32上的羰基、Arg10上的氨基、Lys122上的羰基、Lys13上的氨基相結合，共形成6 個氫鍵，這是維持二者之間穩(wěn)定結合的重要作用力，左天等[18]也通過分子模擬手段證明人參皂苷分子與蛋白質活性口袋內的氨基酸殘基可以通過疏水作用、氫鍵作用及靜電作用結合。由圖4B和5B可知，氨基酸殘基Ser34、Asp37、Gly37、Ala106、Thr33、Leu105、Trp104、Tyr103、Phe53、Glu49、Gln54、Val42和Ala140參與了三七皂苷R1與α-LA相互結合的疏水作用。三七皂苷R1與Ile41上的氨基和羰基、Phe31和His32上的羰基相結合，形成的3 個氫鍵維持二者的穩(wěn)定結合。由圖4C和5C可知，絞股藍皂苷與Leu105、Ala109、His32和Phe31上的羰基相結合，形成4 個氫鍵，維持二者之間的穩(wěn)定結合。何麗君等[19]通過熒光光譜方法證明絞股藍皂苷與牛血清白蛋白主要靠疏水作用和靜電引力結合，與計算機模擬結果相似。由圖4D和5D可知，酸棗仁皂苷A與Phe31上的羰基、Gly35上的羰基、Lys98上的氨基、Ile41上的氨基和羰基相結合，共形成7 個氫鍵，使酸棗仁皂苷A與α-LA穩(wěn)定結合。

圖4 經過Pymol可視化處理后達瑪烷型皂苷與α-LA相互作用細節(jié)圖Fig. 4 Schematic of the interaction between dammarane-type saponins and α-LA after Pymol visualization

由上述4 種皂苷與α-LA相互作用的比較可知，達瑪烷型皂苷與α-LA復合物的主要相互作用力為疏水相互作用和氫鍵作用，范德華力微弱。α-LA中氨基酸殘基Ser34、Gly35、Thr33、Glu49、Gln54、Val42和苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）和丙氨酸（Ala）最容易形成疏水口袋，Ile41、Phe31、His32和賴氨酸（Lys）容易與小分子皂苷形成氫鍵。

圖5 Ligplot顯示達瑪烷型皂苷與α-LA相互作用的二維平面圖Fig. 5 Two-dimensional plot of the interaction between dammaranetype saponins and α-LA

2.4 齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷與α-LA間相互作用

齊墩果烷型又稱β-香樹脂烷型，其基本骨架為多氫蒎的五環(huán)母核。A/B、B/C、C/D為反式，D/E為順式，有8 個甲基存在其母核上，11位和12位一般為雙鍵。大豆皂苷是近些年才被人們所熟知的皂苷，因其具有明顯的溶血作用而被視為抗營養(yǎng)因子[20]，其結構如圖6A所示。苜蓿皂苷P1為紫花苜蓿的次生代謝主要成分，其β構型的羥基或苷化存在3位，苷化的羧基一般連在28位[21]，其結構如圖6B所示。白頭翁皂苷D均為五環(huán)三萜類皂苷，其在抗炎方面有顯著效果[22]，其結構如圖6C所示。山茶屬于山茶科山茶屬植物，山茶花皂苷C2具有抗菌[23]等作用，其結構如圖6D所示。

圖6 不同齊墩果烷型皂苷的分子結構Fig. 6 Structures of different oleanane-type saponins

大豆皂苷Ⅰ、苜蓿皂苷P1、白頭翁皂苷D和山茶花皂苷C2與α-LA的相互作用過程中，二者之間相互作用模式和在結合過程中涉及的主要氨基酸殘基分別如圖7～8所示，疏水作用和氫鍵參與了齊墩果烷型皂苷與α-LA的相互作用。

由圖7A和8A可知，大豆皂苷Ⅰ與Lys62上的氨基、Glu49上的羰基、Leu105上的氨基、Thr33上的羰基和Tyr103相互結合，共形成6 個氫鍵，保證二者穩(wěn)定結合。由圖7B和圖8B可知，苜蓿皂苷P1與His32上的羰基、Tyr103上的羰基、Leu105上的氨基、Glu49上的羰基和Asn44上的氨基相互結合，一共形成8 個氫鍵來維持二者穩(wěn)定結合。由圖7C和8C可知，白頭翁皂苷D與Phe31上羰基、His32上的羰基、Glu49上羰基相互作用，形成3 個氫鍵，在白頭翁皂苷D與α-LA相互作用形成的復合物中起主要作用。由圖7D和8D可知，山茶花皂苷C2與Asp64上的羰基、Asn44上的氨基、Asn44上的羰基、Glu49上的羰基、Tyr103上的羰基和Ala106上的氨基相互結合，共形成8 個氫鍵，保證二者相互作用穩(wěn)定。

圖7 經過Pymol可視化處理后齊墩果烷型皂苷與α-LA相互作用細節(jié)圖Fig. 7 Schematic of the interaction between oleanane-type saponins and α-LA after Pymol visualization

圖8 Ligplot顯示齊墩果烷型皂苷與α-LA相互作用的二維平面圖Fig. 8 Two-dimensional plot of oleanane-type saponins and α-LA interaction

由4 種皂苷與α-LA相互作用的比較可知，齊墩果烷型皂苷與α-LA相互作用形成的復合物中主要存在疏水相互作用和氫鍵作用，范德華力較弱。其中參與疏水口袋形成的氨基酸殘基有Val42、Trp104、Ala40、Ser34、Gly35、Thr33和天冬酰胺（Asn）。氨基酸殘基Glu49、Tyr103最容易與齊墩果型皂苷形成氫鍵；除此之外，氨基酸殘基Asn44一般與齊墩果型皂苷同時形成3 個氫鍵。

通過上述比較，發(fā)現(xiàn)達瑪烷型皂苷與α-LA的疏水相互作用和氫鍵作用中參與的氨基酸殘基多于齊墩果型皂苷與α-LA相互作用時參與的氨基酸殘基?？赡苁且驗檫_瑪烷型皂苷具有環(huán)戊烷駢多氫菲的結構，C8有β-CH3，C13有β-H，C20構型不定（R型或S型）[24]，而齊墩果烷型皂苷只有E環(huán)為六元環(huán)，D/E為順式，E環(huán)上二甲基均位于C20，為偕二甲基[25]。從結構上分析，達瑪烷型皂苷更復雜，可以提供更多的結合位點[26]。

3 結 論

通過計算機模擬分子對接方法，進行不同結構三萜皂苷與α-LA相互作用的模擬，證明小分子三萜皂苷與α-LA之間相互作用力主要為疏水相互作用和氫鍵作用，除此之外，可能還存在范德華力。在選取的達瑪烷三萜皂苷中，酸棗仁皂苷A與α-LA結合效果最好，氫鍵作用和靜電作用最強；在選取的齊墩果型三萜皂苷中，大豆皂苷Ⅰ與α-LA結合效果最好，氫鍵作用和靜電作用最強；但相比之下，達瑪烷型三萜皂苷與α-LA的結合效果比齊墩果烷型皂苷要好。因此，在之后進行功能性食品設計、小分子皂苷包埋時，選擇達瑪烷型皂苷在一定程度上可以提高包埋效率，在增強功能性食品的效果應用上有一定意義。