一株高效微生物絮凝菌的篩選與鑒定1)

吳麗紅 邵楠 韓紅玉 孫瑞婷 馮邱思 杜榮杰

(遼寧科技學(xué)院，遼寧·本溪，117002)

在水和廢水處理過(guò)程中，絮凝可以去除水中的濁度、色度、COD、BOD等指標(biāo)和一些溶解性的雜質(zhì)，該技術(shù)現(xiàn)己被廣泛用于給排水、廢水處理和污泥脫水等領(lǐng)域，絮凝劑的種類與性能會(huì)直接影響絮凝效果。傳統(tǒng)的絮凝劑主要分為無(wú)機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑兩大類[1]，這些絮凝劑均是用于工廠廢水處理的有效絮凝劑；但是形成的絮凝廢渣不能或難于被生物降解，會(huì)造成二次污染。

微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的有絮凝活性的代謝產(chǎn)物或有絮凝活性的菌體，主要成分為糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等。微生物絮凝劑不但具有傳統(tǒng)絮凝劑的特點(diǎn)，而且具有無(wú)毒無(wú)害、無(wú)二次污染，使用范圍廣，凈化效果好，生產(chǎn)和使用成本較低等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。

我國(guó)從20世紀(jì)80年代以來(lái)展開對(duì)微生物絮凝刑的研究，但是目前對(duì)微生物絮凝劑的應(yīng)用研究多處于實(shí)驗(yàn)室階段，大規(guī)模的應(yīng)用還比較少[4-5]。本研究以活性污泥作為絮凝劑菌種來(lái)源，在特定培養(yǎng)基中富集馴化、選擇培養(yǎng)，進(jìn)行絮凝菌的分離、篩選，并對(duì)優(yōu)選菌株進(jìn)行初步鑒定，旨在為微生物絮凝劑的研制開發(fā)提供參考。

1 研究方法

本研究以某污水處理廠二沉池剩余活性污泥作為菌種來(lái)源。

1.1 絮凝菌的分離、純化與篩選

牛肉膏蛋白胨富集培養(yǎng)基[6]：在1 L水中培養(yǎng)基各成分——牛肉膏為5 g/L、蛋白胨為10 g/L、NaCl為5 g/L、pH為7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加入15 g/L的瓊脂作為凝固劑。

絮凝菌篩選培養(yǎng)基[7]：在1 L水中培養(yǎng)基各成分——葡萄糖為20 g/L、K2HPO4為5 g/L、KH2PO4為2 g/L、NaCl為0.1 g/L、(NH4)2SO4為0.2 g/L、尿素為0.5 g/L、酵母膏為0.5 g/L、MgSO4為0.5 g/L，pH為7.8，105 ℃滅菌30 min。

1.1.1 絮凝菌的培養(yǎng)與分離純化

將采集的剩余活性污泥樣品置于錐形瓶中，用無(wú)菌蒸餾水稀釋，加入幾粒玻璃珠進(jìn)行充分震蕩搖勻后，靜置20 min后，用無(wú)菌移液管吸取10 mL上清液注入含有100 mL富集培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中。置于恒溫振蕩器中(30 ℃)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為120 r/min，震蕩培養(yǎng)48 h[8]。

采用倍比稀釋法，將富集培養(yǎng)后的混合培養(yǎng)液制得10-1～10-7的菌懸液；用接種環(huán)分別蘸取10-3～10-7的混合菌懸液，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，置于恒溫生化培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，48 h后根據(jù)不同菌落特征再分別挑取菌落進(jìn)行劃線分離；反復(fù)操作，直至獲得單菌落。結(jié)合顯微鏡觀察菌種的形態(tài)特征，獲得純菌落后進(jìn)行斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩Ｒ陨喜僮骶鶠闊o(wú)菌操作條件下完成。

1.1.2 微生物絮凝產(chǎn)生菌的篩選

絮凝菌培養(yǎng)液制備：在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)分別少量挑取上述已經(jīng)純化的菌落，置于含100 mL絮凝菌篩選培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min的條件培養(yǎng)48 h獲得菌種培養(yǎng)液。

絮凝菌初篩：絮凝微生物的篩選，以菌種培養(yǎng)液對(duì)高嶺土懸浮液的絮凝效果判定，取菌株培養(yǎng)液測(cè)其對(duì)高嶺土懸浮液的絮凝率。取200 mL的量筒，加入150 mL的質(zhì)量濃度為8 g/L的高嶺土懸濁液，同時(shí)向量筒內(nèi)加入40 mL菌株培養(yǎng)液和10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2溶液，充分混合后靜置20 min，以加入不加菌的絮凝菌篩選培養(yǎng)基的高嶺土懸濁液為對(duì)照進(jìn)行目測(cè)觀察，選出有明顯的絮凝效果的菌種，完成初篩。

復(fù)篩：復(fù)篩是對(duì)初篩得到的菌種進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，采用混凝試驗(yàn)進(jìn)行絮凝菌的絮凝能力測(cè)定[9]。將初選出來(lái)的菌種按“絮凝菌培養(yǎng)液制備”方法制成菌懸液，在燒杯中加入質(zhì)量濃度為4 g/L的高嶺土懸濁液500 mL，再按5%的接種量加入25 mL的初篩菌株培養(yǎng)液，并加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CaCl2水溶液作為助凝物質(zhì)。置于六聯(lián)攪拌器，以150 r/min攪拌5 min之后，靜止20 min；相同條件下，以加入不加菌的絮凝菌篩選培養(yǎng)基的高嶺土懸濁液為對(duì)照?；炷Y(jié)束后，采用可見光分光光度計(jì)在550 nm波長(zhǎng)條件測(cè)定不同燒杯中上清液的吸光值。以投加絮凝菌培養(yǎng)液高嶺土上清液的吸光值(A1)、對(duì)照高嶺土上清液吸光值(A2)，計(jì)算絮凝率=[(A2-A1)/A1]×100%，用不同菌種的絮凝率定量表示其絮凝效果。通過(guò)復(fù)篩得到具有較高絮凝率的菌株，將復(fù)篩純菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)，待其充分生長(zhǎng)后，置于冰箱中4 ℃保藏備用。

菌種優(yōu)選：經(jīng)過(guò)復(fù)篩后，對(duì)優(yōu)選出的代表菌株進(jìn)行相關(guān)特性分析，優(yōu)選出絮凝性能最好的絮凝菌。

1.2 優(yōu)選菌株特征的檢驗(yàn)方法

借鑒文獻(xiàn)[10]，通過(guò)優(yōu)選菌種固體平板培養(yǎng)特征、半固體培養(yǎng)特征、液體培養(yǎng)特征，檢驗(yàn)高效絮凝菌的培養(yǎng)特征。

優(yōu)選菌株的生理生化試驗(yàn)：通過(guò)對(duì)高效絮凝菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，鑒別菌株的革蘭氏染色特性及顯微形態(tài)；通過(guò)生理生化試驗(yàn)檢驗(yàn)菌種代謝的多樣性。本研究共設(shè)計(jì)了優(yōu)選菌株接觸酶試驗(yàn)、含碳化合物及含氮化合物的分解等12項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

優(yōu)選菌株的16S rDNA的序列測(cè)定：對(duì)優(yōu)選菌株在進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步鑒定其屬種。

優(yōu)選菌株的時(shí)間生長(zhǎng)曲線：挑取少量?jī)?yōu)選菌株菌落，置于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，以空白培養(yǎng)基為參比，測(cè)定接菌量吸光值，在30 ℃、120 r/min條件進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液吸光值，繪制優(yōu)選菌株的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效絮凝菌的篩選

污泥經(jīng)馴化培養(yǎng)后共分離純化16株菌，經(jīng)初篩后16株菌中7種有絮凝效果，7株菌分別標(biāo)記為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7。通過(guò)混凝試驗(yàn)，對(duì)7株菌進(jìn)行絮凝率測(cè)定復(fù)篩，并對(duì)產(chǎn)生的絮體外觀進(jìn)行觀察測(cè)定(見表1)。由表1可見：有3株菌株(X1、X5、X6)具有明顯的絮凝效果；3株菌(X1、X5、X6)形成的絮凝體顆粒較大，X6更大些。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮絮凝率與絮體顆粒大小，優(yōu)選出絮凝性能最好的菌株為X6，作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 復(fù)篩菌株的絮凝率及絮體顆粒大小

2.2 優(yōu)選菌株X6的培養(yǎng)特征

菌株X6的固體平板菌落相關(guān)特性(見圖1(1))——單菌落為直徑1～2 mm較小的乳白色圓形菌落，隆起形狀為低凸，菌落邊緣形狀規(guī)則，沒(méi)有向外擴(kuò)展，菌落不透明，易被接種環(huán)挑起，黏稠。從在半固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況看(見圖1(2))，菌種僅在半固體培養(yǎng)基表面及沿穿刺線生長(zhǎng)，沒(méi)有外擴(kuò)現(xiàn)象。所以菌株X6不具有運(yùn)動(dòng)性，且具有兼性厭氧的呼吸類型。在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況取決于菌體的密度，由圖1(3)可見，菌株X6的液體培養(yǎng)基上部清澈，菌種以菌團(tuán)的形式沉降到試管底部，說(shuō)明其密度大于培養(yǎng)基密度。從培養(yǎng)特征可看出，菌株X6應(yīng)為無(wú)鞭毛、能產(chǎn)生莢膜的細(xì)菌。

圖1 優(yōu)選菌株X6的培養(yǎng)特征

2.3 優(yōu)選菌株X6的生理生化檢驗(yàn)

菌株X6經(jīng)革蘭氏染色鏡檢呈紫色(見圖2)，所以為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體形狀為桿狀，且清晰可見菌體中有芽孢。對(duì)菌株X6進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表2。綜合各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，并經(jīng)檢索，將絮凝菌X6鑒定到屬，為芽孢桿菌屬。

圖2 菌株X6革蘭氏染色結(jié)果

表2 菌株X6生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

2.4 16S rDNA的序列測(cè)定

利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)菌株X6進(jìn)行了16S rDNA序列測(cè)定分析。將測(cè)得的序列采用DNA序列分析軟件(Sequcecher軟件)進(jìn)行拼接，去掉載體序列及重復(fù)序列，得到菌種jc1的16SrRNA序列(有效序列長(zhǎng)度1 488 bp)。以BLASTN軟件在基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中進(jìn)行相似性檢索，菌株jc1與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis，Genbank Accession No.MT573877.1)同源性達(dá)到99.86%。

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是環(huán)境中常見的具有廣泛功能性的細(xì)菌種類，而其分類地位與物種名稱的確定卻是細(xì)菌分類研究者一直以來(lái)爭(zhēng)論的焦點(diǎn)，直到最近貝萊斯芽孢桿菌有效的物種名稱才得到確定[11]。貝萊斯芽孢桿菌在自然界中廣泛分布，對(duì)人類和動(dòng)物無(wú)害，不污染環(huán)境。其代謝產(chǎn)物豐富，具有廣譜抗菌活性和較強(qiáng)的抗應(yīng)激能力，因此該細(xì)菌在農(nóng)業(yè)、環(huán)境和發(fā)酵工業(yè)等許多領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[12]。

2.5 優(yōu)選菌株的生長(zhǎng)曲線

通過(guò)分批培養(yǎng)，在波長(zhǎng)為600 nm條件測(cè)定菌株X6的吸光值，定時(shí)取樣，繪圖得到株菌的X6生長(zhǎng)曲線(見圖3)。

由圖3可見：菌株在前12 h內(nèi)吸光值增量很少，前期曲線平緩，斜率約為0，此時(shí)菌株X6屬于適應(yīng)期；此后12 h內(nèi)吸光度增長(zhǎng)量逐漸增大，從加速期進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，約48 h菌量達(dá)到最大，增長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；48 h后，緩慢進(jìn)入衰亡期。說(shuō)明菌株X6最佳生長(zhǎng)時(shí)間是分批培養(yǎng)后12～48 h，所以在研究菌種特性時(shí)可取該期菌種作為研究對(duì)象。穩(wěn)定期是收獲菌體或代謝產(chǎn)物的最佳時(shí)期。在水處理過(guò)程中，常規(guī)活性污泥法一般應(yīng)用穩(wěn)定期菌種，該期菌體代謝活力雖然比對(duì)數(shù)期差，但代謝活力也較強(qiáng)，而且穩(wěn)定期菌體生物吸附能力強(qiáng)，泥水分離效果好，出水水質(zhì)好，所以培養(yǎng)48h左右的穩(wěn)定期菌種可作為菌種絮凝活性研究對(duì)象。

圖3 產(chǎn)絮菌生長(zhǎng)曲線

3 結(jié)論

從污水處理廠二沉池剩余活性污泥中初篩出7株具有絮凝效果的菌株。通過(guò)混凝試驗(yàn)對(duì)7株菌進(jìn)行復(fù)篩，最終優(yōu)選出代號(hào)為X6的高效絮凝菌株。該菌在150 r/min攪拌5 min之后，靜止20 min，對(duì)質(zhì)量濃度為4 g/L的高嶺土懸濁液，絮凝率可達(dá)到86.9%，且形成的絮凝體顆粒大，絮凝速率快。

對(duì)菌株X6進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)測(cè)序，經(jīng)鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。該菌具有快速生長(zhǎng)和穩(wěn)定的良好特性，易于分離和培養(yǎng)，且具有芽孢微生物的抗逆性特點(diǎn)，以該菌作為菌源進(jìn)行廢水生物絮凝研究有很強(qiáng)的應(yīng)用性。

研究菌株X6的時(shí)間生長(zhǎng)曲線可得，菌株X6最佳生長(zhǎng)時(shí)間是分批培養(yǎng)后12～48 h，所以在研究菌種特性時(shí)可取該期菌種作為研究對(duì)象，培養(yǎng)48 h左右的穩(wěn)定期菌種可作為菌種絮凝活性研究對(duì)象。