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    TXNIP/Trx-1/GPX4通路促進(jìn)新生大鼠缺氧缺血后海馬神經(jīng)元鐵死亡的作用機(jī)制

    2022-09-08 03:34:50張新月劉晨萌馬瑜徽孟楠蔣景英余小河王曉莉
    中國當(dāng)代兒科雜志 2022年9期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞造模海馬

    張新月 劉晨萌 馬瑜徽 孟楠 蔣景英 余小河 王曉莉

    (1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院,山東濰坊 261053;2.北京航空航天大學(xué),北京 100191;3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院,湖南長沙 410008)

    新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是圍生期常見的嚴(yán)重疾病,可導(dǎo)致癲癇、永久性認(rèn)知和神經(jīng)功能障礙等并發(fā)癥[1],但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。氧化應(yīng)激在缺氧缺血 性 腦 損 傷 (hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中發(fā)揮重要作用[2],鐵死亡作為氧化應(yīng)激依賴性的新型程序性細(xì)胞死亡,不同于細(xì)胞凋亡、自噬和焦亡,多由鐵積累和谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的丟失誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化引起[3]。有研究表明,新生大鼠缺氧缺血可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元鐵死亡,引起HIBD[4],但其發(fā)生鐵死亡的具體機(jī)制尚待闡明。硫氧還原蛋白-1(thioredoxin-1,Trx-1)作為抗氧化劑,可以維持氧化還原穩(wěn)態(tài),在清除脂質(zhì)活性氧和還原氧化蛋白方面發(fā)揮重要作用[5]。已有研究表明Trx-1 在抑制帕金森病相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡中起關(guān)鍵性作用,可上調(diào)GPX4表達(dá)參與調(diào)控鐵死亡[6]。硫氧還原蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是硫氧還原蛋白系統(tǒng)的內(nèi)源性抑制劑,可結(jié)合并負(fù)調(diào)控Trx-1,抑制其氧化還原調(diào)節(jié)能力,從而引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞死亡[7-8]。缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)后是否通過TXNIP/Trx-1/GPX4通路導(dǎo)致鐵死亡,從而導(dǎo)致HIBD,目前尚不清楚。因此,本研究通過建立HIBD模型,觀察造模后海馬TXNIP/Trx-1/GPX4通路諸分子及鐵死亡的變化,并于側(cè)腦室注射TXNIP 小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),沉默上游信號分子TXNIP mRNA的表達(dá),觀察下游信號分子及鐵死亡的變化,從而探討HI后腦神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生機(jī)制,以期為HIE的臨床診療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及分組

    SPF 級7 日 齡Sprague-Dawley 新 生 大 鼠72 只[SCXK(魯)20190003,山東省濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司],雌雄不限,平均體重(11.8±1.5)g,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=30)、HIBD 組(n=30) 及siRNA (TXNIP siRNA) 組(n=12)。假手術(shù)組與HIBD組根據(jù)造模后時間分為6 h、24 h、72 h 及7 d 4 個亞組,行Western blot 法檢測(n=3);造模后24 h,假手術(shù)組與HIBD 組行激光散斑成像、組織切片檢測(n=6);假手術(shù)組、HIBD組及siRNA組行組織鐵、血清鐵測定(n=4),實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative realtime polymerase chain reaction,qPCR)檢測(n=4)和Western blot法檢測(n=4)。

    1.2 HIBD 模型的建立

    采用經(jīng)典的Rice-Vannucci 法建立HIBD 模型[9]。7日齡新生大鼠乙醚吸入麻醉后,剪開頸部正中皮膚,分離損傷(右)側(cè)頸總動脈,電凝筆(RS-300,Roboz 公司,美國)電凝,消毒并縫合皮膚,置于低氧艙(DYC-Ⅲ,武漢七〇一研究所)內(nèi)缺氧(氧艙氧濃度8.0%±0.1%,溫度37℃)2 h,實驗過程中全程監(jiān)測,后放回母鼠籠中喂養(yǎng)。HIBD組與siRNA 組大鼠均建立HIBD 模型,假手術(shù)組大鼠僅分離右側(cè)頸總動脈,不予電凝及缺氧處理。

    1.3 顱骨表面血流量測定

    造模后24 h,HIBD 組和假手術(shù)組新生大鼠乙醚吸入麻醉后,手術(shù)剪沿頭背部正中縱向剪開皮膚,暴露顱骨,將新生大鼠置于激光散斑成像臺內(nèi),調(diào)整焦距使圖像清晰。采用moorO2Flo 組織血流血氧實時成像系統(tǒng)觀察新生大鼠腦血流量,激光檢視光源,前囟到“人”字點設(shè)置感興趣區(qū)(region of interest,ROI)[10],觀察過程中可滴入丙三醇保持顱骨表面濕潤。通過系統(tǒng)將原始散斑圖像轉(zhuǎn)換成腦血流圖像并計算ROI腦血流量。

    1.4 側(cè)腦室注射TXNIP siRNA

    siRNA組新生大鼠固定于立體定位儀上,正中剪開頭皮,于損傷側(cè)側(cè)腦室(坐標(biāo)AP:-0.5 mm,ML:-2 mm,DV:-2 mm)緩慢注入3 μL TXNIP siRNA 與轉(zhuǎn)染試劑混合液[11],1 μL/min 緩慢注入,留針2 min后拔針縫合頭皮,復(fù)溫蘇醒后回母鼠身邊飼養(yǎng)。假手術(shù)組與HIBD組于相同部位注射3 μL 0.9%氯化鈉溶液。

    1.5 標(biāo)本的采集與處理

    造模后24 h,3 組新生大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉15 mg/kg,分別取血清和損傷側(cè)海馬組織,放至-80℃冰箱凍存,行血清鐵含量、組織鐵含量、Western blot及qPCR檢測;另行常規(guī)心臟灌注取腦組織,4%多聚甲醛后固定,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,浸蠟、石蠟包埋,取海馬層面腦組織行冠狀位連續(xù)切片,厚度為4 μm,每3~5 張切片取1 張切片,分別行蘇木精-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色、免疫熒光染色。

    1.6 HE染色

    石蠟切片,二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,采用HE 染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,G1120)染色,行蘇木精染核10 min后,鹽酸酒精分色30 s,去離子水沖洗,伊紅染液染漿2 min,無水乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變。

    1.7 Western blot 法檢測新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1及GPX4蛋白表達(dá)

    造模后6 h、24 h、72 h 及7 d,Western blot 法檢測造模后新生大鼠損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)。造模后24 h,Western blot 法檢測造模后新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1 蛋白表達(dá)。提取新生大鼠損傷側(cè)海馬組織,采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,PC0020)測定蛋白濃度。制備12%SDS-PAGE分離膠,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入兔抗TXNIP、Trx-1、GPX4 (濃 度 均 為1∶500), 鼠 抗GAPDH(Proteintech,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,濃度1∶10 000)一抗后,4℃冰箱過夜。次日,分別加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗。使用高性能成像系統(tǒng)(Protein Simple,美國) 曝光并拍照,采用Image J進(jìn)行灰度值測定。

    1.8 免疫熒光染色法檢測新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞TXNIP、Trx-1及GPX4蛋白表達(dá)

    造模后24 h,石蠟切片,脫蠟、水化,進(jìn)行抗原修復(fù),0.3%TritonX-100透膜,5%BSA-PBS封閉1 h 后,加入兔抗GPX4(1∶200,Affinity,英國)與鼠抗NeuN(1∶200,Chemicon,美國)一抗混合液或兔抗GPX4(1∶200,Affinity,英國)與鼠抗GFAP(1∶200,武漢博士德生物工程有限公司) 一 抗 混合液、兔抗Trx-1 (1∶200,Cell Signaling Technology, 美 國)、 兔 抗 TXNIP(1∶200,Affinity,英國),4℃冰箱過夜。次日37℃孵育箱復(fù)溫,0.01M PBS 洗滌3 遍后,滴加Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶200)、Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶200)熒光二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)混合液,37℃避光孵育1 h 后PBS 沖洗,含4',6-二脒基-2-苯 基 吲 哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)的熒光封片劑(F6507,Sigma,美國)封片。置于正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并統(tǒng)計各組損傷側(cè) 海 馬CA1 區(qū)NeuN+GPX4+/NeuN+、 GFAP+GPX 4+DAPI+、TXNIP+DAPI+、Trx-1+DAPI+細(xì)胞數(shù)。

    1.9 血清鐵測定

    造模后24 h,3組取新生大鼠上層清亮血清,采用血清鐵測定試劑盒(A039-1-1,南京建成生物工程研究所),加入鐵顯色劑,取上清液置于96孔板中,酶標(biāo)儀在520 nm波長下測定各孔吸光度OD值。

    1.10 損傷側(cè)海馬組織鐵測定

    造模后24 h,采用組織鐵含量測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,BC4355)測定新生大鼠損傷側(cè)海馬組織鐵含量。3組分別稱取損傷側(cè)海馬組織,以1 g/mL 比例加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿。5 952 r/min,4℃離心10 min,取上清120 μL,加入組織鐵試劑,后加入60 μL 氯仿,充分震蕩混勻,室溫下10 000 r/min 離心10 min,吸取上層無機(jī)相200 μL置于96孔板,酶標(biāo)儀在520 nm波長下測定吸光度。組織鐵含量計算公式:每克組織中鐵 含 量(μg/g) =6.98× ΔA 測 定(定 義 為0.125 μmol/mL Fe3+標(biāo)準(zhǔn)液吸光度A-蒸餾水吸光度A)÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)(定義為樣本吸光度A-蒸餾水吸光度A)÷樣本質(zhì)量(g)。

    1.11 qPCR 檢測新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA表達(dá)

    3組分別取新生大鼠損傷側(cè)海馬組織,提取樣本總RNA,將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板,采用Bio Rad CFX Manager熒光定量PCR儀,SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行相對定量。采用20 μL體 系,加 入cDNA 模 板1 μL、無 酶 水7.8 μL、SYBR Premix 熒光定量反應(yīng)試劑10 μL,上游、下游引物各0.6 μL,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,PCR 反應(yīng) 階段:95℃變 性10 s,60℃退 火10 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)40 次,結(jié)果以Cq 值表示,采用2-△△Cq法比較TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA 在各組新生大鼠損傷側(cè)海馬組織中表達(dá)的差異。

    引 物 序 列 為: GAPDH: 上 游(5'-3'):ACAGCAACAGGGTGGTGGAC, 下 游 (5'-3'):TTTGAGGGTGCAGCGAACTT;TXNIP:上游(5'-3'):CATGTTCCCGAATCGTGGTC,下游(5'-3'):CTTGGAGCCAGGGACACTAA;Trx-1:上游(5'-3'):AAGGAAGCTTTTCAGGAGGC,下游(5'-3'):GGCAGTCATCCACGTCTACT;GPX4:上 游(5'-3):AATTCGCAGCCAAGGACATC,下游(5'-3):AGGCCAGGATTCGTAAACCA。

    1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用兩樣本t檢驗分析,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)腦血流量變化

    造模后24 h,假手術(shù)組新生大鼠可維持一定的腦血流量;HIBD組損傷側(cè)ROI腦血流量急劇下降,低于假手術(shù)組[(687±75)PU vs(1 432±99)PU,t=14.654,P<0.001]。見圖1。

    圖1 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)腦血流量變化

    2.2 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

    造模后24 h,假手術(shù)組新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列緊密整齊,形態(tài)規(guī)則;HIBD組新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列疏松紊亂,形態(tài)不規(guī)則。見圖2。

    圖2 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

    2.3 造模后,新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平變化

    造模后6 h,HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白表達(dá)水平低于假手術(shù)組(P<0.05);造模后24 h,HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白表達(dá)水平低于造模后6 h(P<0.05);造模后72 h、7 d,HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白表達(dá)水平高于造模后24 h(P<0.05);造模后各時間點,HIBD 組GPX4蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組(均P<0.05),見圖3、表1。造模后24 h,siRNA 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白、Trx-1 蛋白表達(dá)水平高于HIBD 組,但低于假手術(shù)組(均P<0.05);HIBD組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白、Trx-1 蛋白表達(dá)水平低于假手術(shù)組;HIBD 組、siRNA 組損傷側(cè)海馬組織TXNIP 蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組,且siRNA組TXNIP蛋白表達(dá)水平低于HIBD組(均P<0.05)。見圖4、表2。

    圖3 各組新生大鼠造模后不同時間點損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)條帶圖

    表1 新生大鼠造模后不同時間點損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平比較 (± s,n=3)

    表1 新生大鼠造模后不同時間點損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平比較 (± s,n=3)

    注:a示與同組造模后6 h相比,P<0.05;b示與同組造模后24 h相比,P<0.05;c示與同組造模后72 h相比,P<0.05。[HIBD]缺氧缺血性腦損傷;[GPX4]谷胱甘肽過氧化物酶4。

    組別假手術(shù)組HIBD組t值P值造模后6 h 1.016±0.025 0.716±0.011 19.219<0.001造模后24 h 1.016±0.018 0.650±0.017a 25.595<0.001造模后72 h 1.011±0.025 0.813±0.046b 6.625 0.003造模后7 d 1.105±0.021a,b,c 0.858±0.032b 11.155<0.001 F值12.478 30.021 P值0.002<0.001

    表2 造模后24 h,3組新生大鼠損傷側(cè)海馬組織GPX4、TXNIP、Trx-1蛋白表達(dá)水平比較 (± s,n=4)

    表2 造模后24 h,3組新生大鼠損傷側(cè)海馬組織GPX4、TXNIP、Trx-1蛋白表達(dá)水平比較 (± s,n=4)

    注:a 示與假手術(shù)組相比,P<0.05;b 示與HIBD 組相比,P<0.05。[HIBD] 缺氧缺血性腦損傷;[siRNA] 小干擾RNA;[TXNIP]硫氧還原蛋白互作蛋白;[Trx-1]硫氧還原蛋白-1;[GPX4]谷胱甘肽過氧化物酶4。

    組別假手術(shù)組HIBD組siRNA組F值P值TXNIP 0.494±0.037 0.802±0.022a 0.619±0.019a,b 126.911<0.001 Trx-1 1.317±0.056 0.801±0.030a 1.167±0.058a,b 113.510<0.001 GPX4 1.001±0.018 0.850±0.022a 0.932±0.034a,b 35.256<0.001

    2.4 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平變化

    NeuN 是神經(jīng)元標(biāo)志物,GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。造模后24 h,HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1區(qū)NeuN+GPX4+/NeuN+低于假手術(shù)組(P<0.05);假手術(shù)組、HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)均幾乎未見GFAP+GPX4+細(xì)胞。HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)TXNIP+細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組(P<0.05);HIBD組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)Trx-1+細(xì)胞數(shù)低于假手術(shù)組(P<0.05)。見圖5~8,表3。

    表3 造模后24 h,損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平比較 (± s,n=6)

    表3 造模后24 h,損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平比較 (± s,n=6)

    注:[NeuN]神經(jīng)元核抗原;[GPX4]谷胱甘肽過氧化物酶4;[TXNIP]硫氧還原蛋白互作蛋白;[Trx-1]硫氧還原蛋白-1;[DAPI]4',6-二脒基-2-苯基吲哚;[HIBD]缺氧缺血性腦損傷。

    組別假手術(shù)組HIBD組t值P值NeuN+GPX4+/NeuN+0.157±0.008 0.046±0.006 27.081<0.001 TXNIP+DAPI+(個/mm2)99.2±13.2 265.0±33.6 12.141<0.001 Trx-1+DAPI+(個/mm2)206.1±28.0 102.3±10.6 9.174<0.001

    圖5 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中鐵死亡的變化

    2.5 3 組新生大鼠血清及損傷側(cè)海馬組織鐵含量變化

    造模后24 h,HIBD 組與siRNA 組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均高于假手術(shù)組;siRNA組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均低于HIBD組(均P<0.05)。見表4。

    表4 3組血清鐵及損傷側(cè)海馬組織鐵含量比較(± s,n=4)

    表4 3組血清鐵及損傷側(cè)海馬組織鐵含量比較(± s,n=4)

    注:a 示與假手術(shù)組相比,P<0.05;b 示與HIBD 組相比,P<0.05。[HIBD]缺氧缺血性腦損傷;[siRNA]小干擾RNA。

    組別假手術(shù)組HIBD組siRNA組F值P值血清鐵(mg/L)3.103±0.092 4.529±0.216a 4.245±0.186a,b 75.811<0.001組織鐵(μg/g)1.663±0.134 2.183±0.096a 1.845±0.037a,b 29.062<0.001

    2.6 3 組新生大鼠海馬組織TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA表達(dá)水平變化

    造模后24 h,HIBD 組與siRNA 組損傷側(cè)海馬組織TXNIP mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組;siRNA組TXNIP mRNA 表達(dá)水平低于HIBD 組(均P<0.05)。HIBD 組損傷側(cè)海馬組織Trx-1、GPX4 mRNA表達(dá)水平低于假手術(shù)組,siRNA組損傷側(cè)海馬組織Trx-1、GPX4 mRNA 表達(dá)水平高于HIBD 組(均P<0.05)。見表5。

    表5 造模后24 h,3組損傷側(cè)海馬組織各mRNA表達(dá)水平比較 (±s,n=4)

    表5 造模后24 h,3組損傷側(cè)海馬組織各mRNA表達(dá)水平比較 (±s,n=4)

    注:a 示與假手術(shù)組相比,P<0.05;b 示與HIBD 組相比,P<0.05。[HIBD] 缺氧缺血性腦損傷;[siRNA] 小干擾RNA;[GPX4] 谷胱甘肽過氧化物酶4;[Trx-1] 硫氧還原蛋白-1;[TXNIP]硫氧還原蛋白互作蛋白。

    組別假手術(shù)組HIBD組siRNA組F值P值GPX4 mRNA 0.032±0.002 0.014±0.002a 0.018±0.002a,b 67.677<0.001 Trx-1 mRNA 0.314±0.035 0.199±0.005a 0.246±0.013a,b 27.699<0.001 TXNIP mRNA 0.005±0.001 0.011±0.001a 0.008±0.001a,b 39.289<0.001

    圖6 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中鐵死亡的變化

    圖7 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP 蛋白表達(dá)的變化

    圖8 造模后24 h,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中Trx-1蛋白表達(dá)的變化

    3 討論

    最新研究表明,鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡,與HIBD密切相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)造模后24 h,激光散斑成像結(jié)果顯示HIBD 組新生大鼠損傷側(cè)腦血流量低于假手術(shù)組,提示HIBD新生大鼠模型損傷側(cè)頸總動脈血流已阻斷;HE 染色結(jié)果顯示,新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則,均提示HIBD模型建立成功。

    本研究還發(fā)現(xiàn)HIBD組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均高于假手術(shù)組,提示HI 后新生大鼠血液及組織中鐵含量超載可能導(dǎo)致鐵死亡。

    GPX4是鐵死亡關(guān)鍵蛋白[13]。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模后各時間點HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組,造模后24 h,HIBD組損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平較低,且低于造模后其他時間點,提示HI后可致GPX4蛋白表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致鐵死亡,這與文獻(xiàn)[14]報道一致,但HI 后海馬CA1 區(qū)鐵死亡的細(xì)胞定位尚不清楚。本研究采用NeuN/GPX4、GFAP/GPX4 免疫熒光雙標(biāo)染色,結(jié)果顯示造模后24 h,HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)NeuN+GPX4+/NeuN+低于假手術(shù)組,假手術(shù)組和HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)幾乎未見GFAP+GPX4+細(xì)胞,提示HI后,鐵死亡主要發(fā)生在海馬神經(jīng)元。

    TXNIP 是Trx-1 的抑制劑,可與其結(jié)合并抑制Trx-1 的抗氧化功能,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,但TXNIP/Trx-1通路是否與HI后海馬神經(jīng)元鐵死亡相關(guān)尚不清 楚[15-16]。本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 造 模 后24 h,qPCR 與Western blot 結(jié)果提示HIBD 組損傷側(cè)海馬組織TXNIP mRNA 與蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組,Trx-1、GPX4 mRNA與蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組,提示HI 可上調(diào)信號分子TXNIP 的表達(dá),進(jìn)而抑制Trx-1、GPX4蛋白表達(dá),導(dǎo)致鐵死亡。免疫熒光染色結(jié)果亦發(fā)現(xiàn),HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)TXNIP+細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組增多,Trx-1+細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組減少,進(jìn)一步說明HI 可通過TXNIP/Trx-1/GPX4通路調(diào)控鐵死亡。

    為驗證HI 能否通過激活TXNIP/Trx-1/GPX4 通路導(dǎo)致新生大鼠鐵死亡,本研究采用損傷側(cè)側(cè)腦室注射TXNIP siRNA法干擾TXNIP基因表達(dá),造模后24 h,siRNA組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均低于HIBD 組,表明沉默TXNIP基因可抑制HIBD 新生大鼠血液中鐵超載及損傷側(cè)海馬組織鐵死亡。qPCR 和Western blot 檢測結(jié)果顯示,siRNA組損傷側(cè)海馬組織TXNIP mRNA 及蛋白表達(dá)水平低于HIBD 組,Trx-1、GPX4 mRNA 及蛋白表達(dá)水平高于HIBD 組,說明沉默TXNIP基因可調(diào)控HIBD 新生大鼠TXNIP 下游因子Trx-1、GPX4基因及其蛋白表達(dá)變化,引起鐵死亡,導(dǎo)致HIBD。

    綜上,新生大鼠HI 通過激活TXNIP/Trx-1/GPX4通路,誘發(fā)新生大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡,進(jìn)而導(dǎo)致HIBD。

    利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

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