溶血標(biāo)本在應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HIV抗體時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

馬偉剛

(濮陽(yáng)縣人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河南 濮陽(yáng) 457100)

艾滋病作為臨床較常見(jiàn)的傳染性疾病，患病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，主要通過(guò)性交、血液、靜脈吸毒等途徑傳播，可直接破壞機(jī)體的免疫能力，并造成反復(fù)感染，無(wú)法治愈，給患者身心健康造成極大危害。目前，臨床尚無(wú)治療艾滋病的確切療法，所以加強(qiáng)艾滋病篩查、切斷感染源至關(guān)重要。既往，臨床多通過(guò)測(cè)定血清內(nèi)人類免疫缺陷病毒(HIV)的方式診斷艾滋病，但其中檢查方式較多，例如化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附法等，不同檢查方式的結(jié)果可能存在較大差別，引起臨床重視，盡早選擇合適的診斷方式成為關(guān)鍵。其中酶聯(lián)免疫吸附法被廣泛運(yùn)用于臨床，但有研究指出化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CIA)的靈敏度及特異度較高，且自動(dòng)化程度較好，可成為代替酶聯(lián)免疫吸附法的主要檢測(cè)方式。選擇濮陽(yáng)縣人民醫(yī)院2019年12月至2021年12月納入的86例健康體檢者，深究溶血標(biāo)本通過(guò)CIA檢測(cè)HIV抗體檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2019年12月至2021年12月納入的86例健康體檢者，其中男性48例，女性38例；年齡25～73歲，平均年齡(43.58±2.69)歲；體質(zhì)指數(shù)19～25 kg/m，平均體質(zhì)指數(shù)(22.41±1.03)kg/m。所有健康體檢者均在相同的條件下收集外周靜脈血標(biāo)本，將其劃分成四份，即正常標(biāo)本(A組)、經(jīng)人工溶血使游離血紅蛋白不足60 mmol/L(B組)、60～110 mmol/L(C組)、超 出110 mmol/L(D組)，各組標(biāo)本的基礎(chǔ)信息相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)健康體檢者與親屬均知情，并簽署同意書；(2)無(wú)HIV感染；(3)意識(shí)清楚，自愿參與本次試驗(yàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不全者；(2)合并精神疾病、免疫系統(tǒng)疾病、重要臟器功能異常、先天性疾病、意識(shí)障礙、其他傳染疾病者；(3)中途退出試驗(yàn)者。

1.2 方法

酶聯(lián)免疫吸附法的儀器是酶標(biāo)儀(鄭州安圖，PHOMO)、洗板機(jī)(鄭州安圖，iwo-960)以及配套的HIV抗體試劑盒；而CIA選擇發(fā)光儀(鄭州安圖，A2000 plus)及配套的HIV抗體試劑盒。

收集健康體檢者肘正中靜脈血(10 mL)，放在離心管內(nèi)，分成四份，其中一份為正常標(biāo)本(A組)，等待血液凝固，以3 000 r/min速度開展離心操作，10 min后取上層清液。另三份通過(guò)物理振蕩、反復(fù)凍融的物理方式實(shí)施人工溶血操作，分離血清，通過(guò)鄰聯(lián)甲苯胺法檢測(cè)游離血紅蛋白，明確標(biāo)本的溶血程度，分別是游離血紅蛋白不足60 mmol/L(B組)、60～110 mmol/L(C組)、超出110 mmol/L(D組)。最后嚴(yán)格遵照酶聯(lián)免疫吸附法、CIA及說(shuō)明書要求檢測(cè)HIV抗體。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)比較各組之間的吸光度A值、化學(xué)發(fā)光值(RLU)，其數(shù)值大于等于臨界值即為陽(yáng)性。(2)對(duì)比各組不同檢查方式的陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組的檢測(cè)結(jié)果比較

各組之間的吸光度A值比較差別明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)，但RLU值無(wú)顯著差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組的檢測(cè)結(jié)果比較(± s )

2.2 各組的陽(yáng)性率比較

各組的酶聯(lián)免疫吸附法的陽(yáng)性率存在顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)，但CIA陽(yáng)性率無(wú)明顯差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組的陽(yáng)性率比較[n(%)]

3 討 論

據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，艾滋病作為全球范圍流行的傳染病，每年因艾滋病死亡的人數(shù)約2 500萬(wàn)。最早于1981年，美國(guó)發(fā)現(xiàn)了第一例艾滋病患者，隨后艾滋病在各地區(qū)傳播擴(kuò)散，尤其是在人口流動(dòng)性較強(qiáng)、毒品交易泛濫、性解放環(huán)境之下，HIV從高風(fēng)險(xiǎn)人群逐漸向普通人群擴(kuò)散，并呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。加上艾滋病的潛伏時(shí)間較長(zhǎng)，短時(shí)間之內(nèi)患者并不會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀，從而容易被人忽視，隨后再經(jīng)血液透析、靜脈吸毒、性接觸等途徑傳播。而國(guó)內(nèi)關(guān)于艾滋病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，其發(fā)生率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，并表現(xiàn)為西高東低、南高北低趨勢(shì)，特別是西南地區(qū)、新疆成為該病的高發(fā)地區(qū)。針對(duì)此，臨床尚無(wú)特效治療方式，早期采取HIV抗體檢查、盡快確診艾滋病在切斷傳播途徑、控制傳播上具有重要意義。

目前，臨床針對(duì)HIV的檢查方式較多，其中以HIV抗體檢測(cè)較常見(jiàn)，但不同檢測(cè)方式可能導(dǎo)致不同結(jié)果，甚至造成假陽(yáng)性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附法較多見(jiàn)，檢查過(guò)程中病毒抗體能夠和固相載體上的抗原以及抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，隨后引起典型的氧化還原反應(yīng)，經(jīng)肉眼、顯微鏡即可清楚地觀察，同時(shí)利用酶標(biāo)儀，針對(duì)檢查結(jié)果作出準(zhǔn)確的判斷，由此可見(jiàn)，該檢查方法的特異性較高。但其操作較為復(fù)雜，通常需要2 h左右才可得到結(jié)果，耗時(shí)較長(zhǎng)，且檢測(cè)期間需要重復(fù)洗板、加氧操作，極易使結(jié)果出現(xiàn)偏差，并引起假陽(yáng)性情況，特別是在艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄情況下，可能出現(xiàn)誤診。針對(duì)HIV濃度較低的標(biāo)本，使用該方式檢測(cè)的靈敏度較低，這直接增加假陰性的發(fā)生率。

在檢查期間，還需要采取一些輔助設(shè)備，其設(shè)備的操作使用對(duì)檢查人員的能力存在較高的要求，一旦出現(xiàn)操作上的失誤，可直接降低患者檢查結(jié)果的準(zhǔn)確度。此外在檢查中，檢查試劑可受到較多因素的影響，進(jìn)而導(dǎo)致檢查工作出現(xiàn)較多不確定性，并延長(zhǎng)檢測(cè)消耗的時(shí)間，導(dǎo)致檢查結(jié)果需要較長(zhǎng)時(shí)間才可顯現(xiàn)，從而影響檢查的效率，甚至耽誤患者最佳治療時(shí)機(jī)。有研究指出，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)溶血標(biāo)本的結(jié)果偏差較大，可能是由于游離血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性較高，并與辣根過(guò)氧化物酶的療效相當(dāng)，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢查后催化了底物顯色，從而引起假陽(yáng)性。最早于20世紀(jì)90年代，臨床將CIA運(yùn)用在HIV抗體的檢查上，這主要融合了化學(xué)發(fā)光體系與免疫反應(yīng)，屬于新型標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)。臨床經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)CIA的作用機(jī)制與酶免疫、放射免疫較為相近，不同的是該檢測(cè)方式主要利用發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定，以此得到的光量子數(shù)與待測(cè)樣本上的抗原/抗體濃度存在密切關(guān)系，最終導(dǎo)致該方式被廣泛運(yùn)用在定量、定性以及半定量檢測(cè)中，并受到廣泛認(rèn)可。隨著臨床不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)與酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行對(duì)比，CIA并不會(huì)受到游離血紅蛋白上類過(guò)氧化物酶活性的干擾，對(duì)此可避免因顏色反應(yīng)而影響檢查結(jié)果。通常情況下，CIA選擇抗體以及抗原上標(biāo)記酶、發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記展開檢查工作，在結(jié)束檢查后，于試劑內(nèi)添加氧化劑來(lái)介導(dǎo)其標(biāo)志物發(fā)光，隨后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線開展發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定，最后檢測(cè)發(fā)光物的含量。在臨床檢查中的靈敏度較高，且無(wú)污染，加上標(biāo)記物的保存時(shí)間較長(zhǎng)，線性范圍相對(duì)較寬，存在一定自動(dòng)化，可顯著提升檢查效率。同時(shí)該技術(shù)中包含電化學(xué)反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光過(guò)程，具體檢測(cè)期間標(biāo)記抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，開啟電發(fā)光過(guò)程，此過(guò)程能夠循環(huán)，進(jìn)而提升靈敏度。且整個(gè)檢查過(guò)程僅需20 min即可完成，有效縮短了檢查時(shí)間，較酶聯(lián)免疫吸附法更早檢出HIV，從而減少診斷窗口期。除此之外，CIA作為異相免疫分析方式，抗原抗體結(jié)合效果較好，靈敏度較高，且線性范圍較寬，發(fā)光強(qiáng)度可分成4～6個(gè)量級(jí)，與檢測(cè)樣本的物質(zhì)濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系。加上該方式的操作簡(jiǎn)便，檢查期間僅需要一種試劑即可完成檢查，也無(wú)需光源照射，有效規(guī)避了光散射、光源穩(wěn)定性的干擾，且自動(dòng)化程度較高，耗時(shí)較短，可被廣泛運(yùn)用在急診快速檢查中。有研究指出，溶血標(biāo)本對(duì)多種檢查方式的結(jié)果存在較大影響，極易引起假陽(yáng)性，從而耽誤后續(xù)治療。

本研究結(jié)果表示：各組之間的吸光度A值比較差異明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)，但化學(xué)發(fā)光值(RLU)值無(wú)顯著差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)；各組的酶聯(lián)免疫吸附法的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)，但CIA陽(yáng)性率無(wú)明顯差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)，上述結(jié)果提示酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定溶血標(biāo)本的結(jié)果偏差較大，但對(duì)CIA，從而證實(shí)CIA可成為HIV抗體檢查的重要方式。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附法中，隨著標(biāo)本上溶血程度的不斷增加，吸光度A值隨之升高，且假陽(yáng)性較高，可能是因?yàn)闄z測(cè)期間，溶血標(biāo)本上游離血紅蛋白增多，接受溫育操作后，游離的血紅蛋白極易被吸附至反應(yīng)孔內(nèi)，加上血紅蛋白通常包含亞鐵血紅素，其具備過(guò)氧化物酶相同的作用，通過(guò)氧化劑影響之下顯色，從而導(dǎo)致游離血紅蛋白中加入了化學(xué)發(fā)光底物液，并產(chǎn)生一定反應(yīng)，呈現(xiàn)異常結(jié)果，引起假陽(yáng)性，使得檢查結(jié)果出現(xiàn)偏差。另外血紅素上紅色對(duì)比色結(jié)果的干擾較大，既往多選擇標(biāo)本空白清除去比色結(jié)果的影響，但該檢查期間加入了光吸收，從而干擾波長(zhǎng)相似的比色實(shí)驗(yàn)，最終影響檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。而CIA的特異度較高，并不會(huì)受到各方面因素的影響，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)鑒于該操作通常于封閉的流動(dòng)系統(tǒng)內(nèi)完成，故而其可有效規(guī)避交叉感染的發(fā)生，同時(shí)可保證試劑的穩(wěn)定性，最終提升檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。由此發(fā)現(xiàn)，溶血標(biāo)本對(duì)各項(xiàng)檢查均可產(chǎn)生一定影響，但對(duì)CIA的影響較小，其可成為HIV抗體檢查的主要方式，值得應(yīng)用。

值得注意的是，臨床數(shù)據(jù)顯示血液標(biāo)本產(chǎn)生溶血的幾率較高，通常與標(biāo)本采集操作不當(dāng)、標(biāo)本送檢延遲等因素存在密切關(guān)系，需引起重點(diǎn)關(guān)注。一旦發(fā)現(xiàn)溶血標(biāo)本，檢驗(yàn)科應(yīng)立即與送檢科室取得聯(lián)系，結(jié)合科室具體情況以及檢查項(xiàng)目對(duì)其溶血原因進(jìn)行分析，對(duì)于溶血影響較大的情況，可通知相關(guān)科室重新收集標(biāo)本，以此保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。除此之外，醫(yī)院還應(yīng)加強(qiáng)收集標(biāo)本人員的操作能力，定期開展相關(guān)知識(shí)培訓(xùn)，使其完全掌握血液標(biāo)本的正確的收集方法，最大限度地避免溶血標(biāo)本出現(xiàn)。但本次試驗(yàn)中仍存在較多缺陷，比如試驗(yàn)前雖然擬定了嚴(yán)格的入組與剔除標(biāo)準(zhǔn)，但最后納入的觀察對(duì)象是否合理還需要商榷；除此之外此次試驗(yàn)中的觀察對(duì)象樣本數(shù)量較少，針對(duì)此，臨床還可選擇更多觀察對(duì)象，從而保證其樣本的多樣性，進(jìn)一步提升試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及精確性。

綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定溶血標(biāo)本的結(jié)果偏差較大，但對(duì)CIA的影響較小，可成為HIV抗體檢查的主要方式，但應(yīng)注意隨著溶血程度的增加，其也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，對(duì)此，要求臨床加強(qiáng)檢測(cè)前的質(zhì)量控制，保證標(biāo)本合格，規(guī)避假陽(yáng)性出現(xiàn)。