基于葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的NADPH高效再生

于 平，楊柳貞，馬 健，張琪立，陳慶偉

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，又稱還原型輔酶II（NADPH），在細(xì)胞合成代謝中作為供氫體提供還原力參與酶促反應(yīng)[1]，然而，目前在工業(yè)生物催化應(yīng)用研究中，通常需人為添加外源輔酶NADPH 以完成催化反應(yīng)。由于NADPH 是一種昂貴、穩(wěn)定性差、難以重復(fù)利用的試劑，通過不斷添加外源輔酶NADPH 會導(dǎo)致成本高昂且效率低，因此構(gòu)建輔酶NADPH 再生系統(tǒng)，對于經(jīng)濟(jì)、高效的生物催化氧化工藝至關(guān)重要。輔酶再生的基本原理是氧化態(tài)的輔酶NADP+通過氧化-還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為還原態(tài)輔酶NADPH，實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH 原位再生[2-3]。經(jīng)過科研工作者們不懈的努力，建立了很多輔酶NADPH 的再生方法，如電化學(xué)法、光化學(xué)法、化學(xué)法原位再生、酶法再生以及構(gòu)建輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)，改造輔酶合成途徑，調(diào)控輔酶再生代謝途徑，尋找輔酶替代物等[4]。生物細(xì)胞胞內(nèi)代謝是酶制備與酶催化最有效的過程[5-6]。生物細(xì)胞內(nèi)含有多種酶和輔酶，其代謝系統(tǒng)具有一定的協(xié)調(diào)性和穩(wěn)定性，利用細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和關(guān)鍵酶實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH 胞內(nèi)再生是一條重要的途徑[7]。通常使用基因工程技術(shù)，將輔酶NADPH 再生關(guān)鍵酶基因?qū)牍こ叹M(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)輔酶胞內(nèi)高效再生[8]。

目前廣泛應(yīng)用的微生物細(xì)胞內(nèi)NADPH 的合成代謝途徑主要包括4 類：戊糖磷酸途徑（PPP 途徑）、糖酵解途徑（EMP 途徑）、酒精發(fā)酵途徑（ED途徑）和三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）等[9]。在這些合成代謝途徑中所涉及的一些酶屬于合成NADPH 的關(guān)鍵酶，將其運(yùn)用于代謝工程中可增加NADPH的利用率并增強(qiáng)生物轉(zhuǎn)化過程。Spaans 等[10]綜述了細(xì)菌和古生菌代謝途徑中輔酶NADPH 再生的關(guān)鍵酶：1）參與中心碳代謝反應(yīng)，包括PPP 途徑和ED 途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH），TCA 循環(huán)的異檸檬酸脫氫酶（IDH）和蘋果酸酶（ME），EMP 途徑的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPN） 和葡萄糖脫氫酶（GDH）；2）參與非中心碳代謝反應(yīng)，包括能量非依賴性可溶性轉(zhuǎn)氫酶（STH），依賴于能量或質(zhì)子轉(zhuǎn)移的膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶（H＋-TH），鐵氧還蛋白-NADP＋氧化-還原酶，胞質(zhì)NADP＋還原氫化酶（SH）以及NAD＋激酶（NADK）。鄭雅楠等[11]構(gòu)建了己糖激酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶共表達(dá)的大腸桿菌，以葡萄糖為底物實(shí)現(xiàn)了輔酶NADPH 的高效再生，并將輔酶再生體系與醇脫氫酶AdhR 聯(lián)合催化，使不對稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力提高至原始值的2.5 倍。Pham 等[12]構(gòu)建重組大腸桿菌P450pyrTM-GDH，可通過輔因子循環(huán)進(jìn)行P450催化的羥化反應(yīng)，并且也將GDH 與多組分P450單加氧酶共表達(dá)以增強(qiáng)氧化作用。將全細(xì)胞作為生物催化劑，可通過NADPH 的細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)提高脂環(huán)族底物在非活化碳原子上的高度區(qū)域和立體選擇性羥基化，提高生產(chǎn)率[13]。Poulsen 等[14]在黑曲霉（Aspergillus niger）內(nèi)過量表達(dá)PPP 中的關(guān)鍵酶G6PDH、6PGDH 和轉(zhuǎn)酮醇酶（TKT），培養(yǎng)野生型和工程菌株。結(jié)果表明，過量表達(dá)6PGDH 使內(nèi)源性NADPH 濃度增加2～9 倍。Lim 等[15]分別將編碼G6PDH 與6PGDH 的基因zwf 和gnd 導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與編碼6PGDH 的基因gnd 相比，編碼G6PDH 的基因zwf 將NADPH 的水平提高了3 倍，使得內(nèi)源性NADPH/NADP+的比例提高了6 倍。

本研究主要利用基因工程技術(shù)，將合成NADPH 的關(guān)鍵酶基因即葡萄糖激酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（glk-zwf）構(gòu)建到大腸桿菌BL21（DE3）中，實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH 高效循環(huán)再生，并探究異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）濃度、誘導(dǎo)溫度、接種量、裝液量對輔酶NADPH 再生的影響；通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，探討重組菌株產(chǎn)輔酶NADPH 的最佳工藝條件，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)輔酶NADPH 提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌K12（Escherichia coli K12）、大腸桿菌DH5α（E.coli DH5α）、大腸桿菌BL21（E.coli BL21）和質(zhì)粒pETDuet-1 均來源于實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.1.2 主要試劑 蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、氨芐青霉素、瓊脂粉、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白電泳上樣緩沖液、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（Glycine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、硼酸、EDTA 二鈉等購自上海生工生物有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、核酸膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、DNA 聚合酶 （PrimeSTAR Max DNA Polymerase）、限制性核酸內(nèi)切酶（NdeI、XhoI）、T4連接酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker 等購自大連Takara 寶生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR 儀，德國EPPENDORF公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD 公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海領(lǐng)儀科技有限公司；SKY-200B 臺式恒溫振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-50SII 高壓滅菌鍋，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TGL-16G 高速冷凍離心機(jī)，廣州盧瑞明儀器有限公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基與試劑配制

1.1.4.1 LB 培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃，滅菌20 min。

1.1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品NADPH 母液 準(zhǔn)確稱取0.0050 g NADPH 到小燒杯中，用超純水定容到10 mL 容量瓶中，即得600 μmol/L NADPH 母液，-20 ℃冰箱保存。

1.1.4.3 考馬斯亮藍(lán)染色液 準(zhǔn)確稱取0.5 g 考馬斯亮藍(lán)R-250 置于1 L 大燒杯中，依次加入225 mL 甲醇、225 mL 蒸餾水和50 mL 冰醋酸，混勻。

1.1.4.4 脫色液 300 mL 甲醇、600 mL 蒸餾水、100 mL 冰醋酸，混勻，常溫放置。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖激酶基因（glk）與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（zwf）的克隆 以大腸桿菌K12 基因組為模板，在50 μL 體系中分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增glk與zwf 目的基因片段。PCR 擴(kuò)增體系：大腸桿菌K12 基因組1 μL，上下游引物各1.5 μL，高保真酶混合液（PrimeSTAR Max Polymerase）25 μL，無菌蒸餾水21 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，退火15 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃進(jìn)一步延伸10 min；4 ℃保存。設(shè)定glk 基因退火溫度為55 ℃，zwf 基因退火溫度為56℃。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。本試驗(yàn)中采用重疊延伸PCR 技術(shù)獲得包含2個(gè)目的基因glk 和zwf 序列的全長PCR 產(chǎn)物（glkzwf）。將割膠回收純化后的glk 和zwf 基因片段各取1 μL 共同作為模板，以glk-F 和zwf-R 各1.5 μL 作為引物，高保真酶混合液25 μL，無菌蒸餾水21 μL。重疊延伸反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，循環(huán)2 次后退火溫度降2 ℃再延伸，以此類推，直到設(shè)定退火溫度為58 ℃；最后72 ℃延伸10 min，4℃保存。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，把目的基因片段（glk-zwf）大小為2 442 bp 的條帶進(jìn)行割膠回收純化。

1.2.2 重組質(zhì)粒pETDuet-1-glk-zwf 的構(gòu)建 將獲得的目的基因片段（glk-zwf）和質(zhì)粒pETDuet-1，分別用NdeI 和XhoI 進(jìn)行雙酶切，酶切溫度為37 ℃，時(shí)間6 h。酶切結(jié)束后進(jìn)行回收純化，雙酶切產(chǎn)物用T4DNA 連接酶連接，連接溫度16 ℃，時(shí)間14 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取氨芐青霉素抗性平板上的單菌落于液體LB 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素）培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒大小驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證以及PCR 驗(yàn)證，再進(jìn)一步送到上海生工測序驗(yàn)證，從而篩選得到重組質(zhì)粒pETDuet-1-glk-zwf。按照TaKara 大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒說明書制備感受態(tài)細(xì)胞，酶切產(chǎn)物純化和質(zhì)粒提取參照Takara 公司的PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒。重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖如下圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒pETDuet-1-glk-zwf 構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart of the construction of recombinant plasmid pETDuet-1-glk-zwf

表1 葡萄糖激酶基因（glk）與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（zwf）克隆所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in the cloning of the genes glk and zwf

1.2.3 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá) 分別將質(zhì)粒pETDuet-1 和重組質(zhì)粒pETDuet-1-glk-zwf 導(dǎo)入到大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株大腸桿菌BL21/pETDuet-1 和重組表達(dá)菌株大腸桿菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf。按1%接種量接種原始菌株大腸桿菌BL21 和構(gòu)建好的重組菌大腸桿菌BL21/pETDuet-1、大腸桿菌BL21/pETDuet-1-glkzwf 于10 mL LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素） 中，37 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)16 h。再按1%接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL/250 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8 時(shí)，向培養(yǎng)基中加入0.1 mmol/L 的IPTG，28 ℃低溫繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h 后收集菌體。

1.2.4 細(xì)胞超聲破碎 取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液，在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，去掉上清液，收集菌體。加入磷酸緩沖液重懸，置于超聲破碎儀器中進(jìn)行細(xì)胞破碎，150 W 工作5 s，停止5 s，重復(fù)90 次。破碎后的菌液在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集上清液和沉淀重懸液進(jìn)行SDSPAGE 分析。蛋白凝膠電泳使用10%分離膠和5%濃縮膠，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液染色，然后用脫色液進(jìn)行脫色，凝膠成像儀觀察電泳情況。

1.2.5 IPTG 濃度對NADPH 再生的影響 設(shè)置IPTG 濃度分別為 0.05，0.15，0.25，0.35，0.45 mmol/L；按1%接種量接種于50 mL/250 mL LB 發(fā)酵培養(yǎng)基，誘導(dǎo)溫度24 ℃，誘導(dǎo)24 h。

1.2.6 誘導(dǎo)溫度對NADPH 再生的影響 設(shè)置誘導(dǎo)溫度分別為16，20，24，28，37 ℃，選取IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.15 mmol/L，按1%接種量接種至50 mL/250 mL LB 發(fā)酵培養(yǎng)基，誘導(dǎo)24 h。

1.2.7 接種量對NADPH 再生的影響 分別設(shè)置1%，2%，3%，4%，5%接種量接種于50 mL/250 mL LB 發(fā)酵培養(yǎng)基，選取IPTG 誘導(dǎo)濃度0.15 mmol/L，誘導(dǎo)溫度24 ℃，誘導(dǎo)24 h。

1.2.8 裝液量對NADPH 再生的影響 在250 mL 的三角錐形瓶中設(shè)置裝液量為25，50，75，100，125 mL LB 發(fā)酵培養(yǎng)基，選取IPTG 誘導(dǎo)濃度0.15 mmol/L，誘導(dǎo)溫度24 ℃，1%接種量，誘導(dǎo)24 h。

1.2.9 正交試驗(yàn)優(yōu)化輔酶NADPH 再生的培養(yǎng)條件 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度、接種量、裝液量的最佳取值范圍，進(jìn)一步采用SPSS 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，以誘導(dǎo)溫度（A）、IPTG 濃度（B）、接種量（C）、裝液量（D）作為正交試驗(yàn)的自變量，以輔酶NADPH 產(chǎn)量作為因變量，以1、2、3 作為4 個(gè)自變量因素水平的編碼，正交試驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.10 誘導(dǎo)時(shí)間對輔酶NADPH 再生的影響 誘導(dǎo)時(shí)間的長短直接關(guān)系到輔酶NADPH 最終合成量的高低?；?.2.9 節(jié)正交試驗(yàn)優(yōu)化好的培養(yǎng)條件，按照1.5%的接種量接種重組大腸桿菌，裝液量為100 mL/250 mL，IPTG 濃度0.25 mmol/L，誘導(dǎo)72 h，每隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣測定NADPH 的產(chǎn)量，探究不同誘導(dǎo)時(shí)間對NADPH 產(chǎn)量的影響。

1.3 輔酶NADPH 產(chǎn)量測定方法

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測細(xì)胞破碎離心后上清液中的輔酶NADPH 產(chǎn)量，檢測條件為：色譜柱：Waters Atlantis T3（3.0 mm×150 mm，3 μm）；流動相：20 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，pH=7.3；進(jìn)樣量：5 μL，柱溫：30 ℃；檢測波長：340 nm；流速：0.4 mL/min，運(yùn)行時(shí)間15 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件，繪圖采用Origin 8.5 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因glk 和zwf 的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的鑒定

以大腸桿菌K12 基因組為模板，進(jìn)行葡萄糖激酶基因（glk）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（zwf）的PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。圖2a 目的基因片段glk 大小為966 bp，圖2b 目的基因片段zwf 大小為1 476 bp，泳道1 和2 中的基因條帶與的基因片段大小符合。以glk 基因和zwf 基因?yàn)槟０?，?jīng)重疊延伸PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖2c 所示，目的基因片段glk-zwf 理論大小為2 442 bp，泳道1 和2 中的基因條帶與目的基因片段大小符合。

圖2 glk 和zwf 基因電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis map of glk and zwf genes

隨機(jī)挑取抗性平板上長出的4 個(gè)單菌落至LB 培養(yǎng)基中 （含100 μg/mL 的氨芐青霉素），37℃、180 r/min 搖床振蕩過夜培養(yǎng)24 h，提取質(zhì)粒并分別命名為P1、P2、P3 和P4。分別以質(zhì)粒P1、P2、P3 和P4 為模板，進(jìn)行重疊延伸PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。重組質(zhì)粒pETDuet-1-glk-zwf 的大小為7 862 bp，可初步判斷質(zhì)粒P1、P2 和P4 為陽性克隆。挑選P1 進(jìn)行測序，通過Blast 比對分析發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒P1 中的外源基因片段與NCBI 數(shù)據(jù)庫公布的glk-zwf 序列比對結(jié)果均為100%，說明重組質(zhì)粒pETDuet-1-glk-zwf 構(gòu)建成功。

圖3 質(zhì)粒大小鑒定（a）、雙酶切鑒定（b）和重疊延伸PCR 鑒定電泳圖（c）Fig.3 Electrophoresis diagram of plasmid size identification （a），double enzyme digestion identification （b）and overlap PCR identification （c）

2.2 重組菌株的SDS-PAGE 分析

重組菌株大腸桿菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖4所示。泳道3 蛋白電泳條帶大小分別接近54.0 ku 和35.0 ku，與理論值一致，可見重組菌株實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。

圖4 SDS-PAGE 蛋白電泳結(jié)果Fig.4 Results of SDS-PAGE protein electrophoresis

2.3 NADPH 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制了不同濃度的NADPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC 法進(jìn)行檢測，將峰面積作為縱坐標(biāo)，NADPH濃度作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。標(biāo)準(zhǔn)溶液NADPH 的線性回歸方程為y = 2.5104x-15.75936，相關(guān)系數(shù)為R2=0.99679，顯示線性擬合良好。

圖5 NADPH 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of NADPH concentration

2.4 HPLC 法測定重組大腸桿菌中輔酶NADPH再生的能力

為了驗(yàn)證所構(gòu)建的重組大腸桿菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf 是否具有輔酶NADPH 再生的能力，對重組菌株進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎，取破碎上清液通過HPLC 法檢測重組菌株中輔酶NADPH 再生的能力。標(biāo)準(zhǔn)品NADPH 的保留時(shí)間為9.220 min （圖6a）；樣品NADPH 的保留時(shí)間為9.220 min（圖6b），與標(biāo)準(zhǔn)品NADPH 的保留時(shí)間一致，由此推斷出重組菌株具有輔酶NADPH 再生的能力。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中NADPH 的HPLC 檢測圖譜Fig.6 High performance liquid chromatogram of NADPH in standard and sample

2.5 IPTG 濃度對輔酶NADPH 再生的影響

由圖7a 可知，IPTG 濃度在0.05～0.15 mmol/L之間，NADPH 產(chǎn)量變化不大，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基體系中所含IPTG 濃度為0.15 mmol/L 時(shí)，輔酶NADPH產(chǎn)量達(dá)到最高，此時(shí)輔酶最高產(chǎn)量為81.05 μmol/L；然而隨著IPTG 濃度的繼續(xù)增大，輔酶產(chǎn)量下降明顯，特別是IPTG 濃度為0.45 mmol/L 時(shí)，重組細(xì)胞遭到IPTG 毒性的影響，菌體生長受到抑制，生長量低，對重組工程菌株合成輔酶NADPH造成了嚴(yán)重的影響，故選擇0.15 mmol/L 作為重組菌株的最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度。

2.6 誘導(dǎo)溫度對輔酶NADPH 再生的影響

由圖7b 可知，不同誘導(dǎo)溫度對輔酶NADPH產(chǎn)量產(chǎn)生了顯著影響，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，輔酶NADPH 產(chǎn)量顯著上升，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為24 ℃時(shí)，輔酶NADPH 產(chǎn)量最高，此時(shí)產(chǎn)量為115.93 μmol/L，然而隨著誘導(dǎo)溫度的繼續(xù)上升，輔酶NADPH 產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢，并且當(dāng)誘導(dǎo)溫度達(dá)到32 ℃時(shí)，HPLC 無法檢測到輔酶NADPH，說明高溫不利于重組工程菌中輔酶NADPH 的合成。綜上，選擇24 ℃作為重組大腸桿菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf最佳誘導(dǎo)溫度。

2.7 接種量對輔酶NADPH 再生的影響

接種量與重組菌株生長量有著密切關(guān)系，進(jìn)而影響到NADPH 的再生。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基體系中添加不同接種量，來探究接種量對輔酶NADPH 再生的影響，結(jié)果如圖7c 所示。不同接種量對輔酶NADPH 產(chǎn)生了顯著影響，輔酶NADPH再生產(chǎn)量隨著接種量的逐漸升高而明顯降低，當(dāng)接種量為1%時(shí)，NADPH 產(chǎn)量達(dá)到最高（118.75 μmol/L），由此推斷可能因?yàn)榻臃N量過高導(dǎo)致初期菌體生長量過高，發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，從而導(dǎo)致輔酶NADPH 產(chǎn)量不高。綜上，選擇1%為最佳接種量。

2.8 裝液量對輔酶NADPH 再生的影響

裝液量與發(fā)酵過程中的溶氧量有關(guān)，通過在同一發(fā)酵瓶中添加不同體積LB 發(fā)酵培養(yǎng)基，探究不同裝液量對輔酶NADPH 再生的影響，結(jié)果如圖7d 所示。不同裝液量對輔酶NADPH 產(chǎn)生了顯著影響，裝液量過低，雖然搖瓶中溶氧量高，但是菌體生長過于旺盛，反而不利于目的產(chǎn)物的合成，此時(shí)輔酶產(chǎn)量只有27.20 μmol/L；當(dāng)裝液量為125 mL/250 mL，產(chǎn)量最高為136.15 μmol/L，而當(dāng)搖瓶中裝液量75 mL/250 mL 輔酶NADPH 產(chǎn)量可達(dá)134.67 μmol/L，兩者輔酶NADPH 產(chǎn)量相差不大，考慮到生產(chǎn)成本，選擇75 mL/250 mL 為最優(yōu)裝液量。

圖7 表達(dá)條件對重組菌株產(chǎn)輔酶NADPH 的影響Fig.7 Effect of the expression condition on the production of coenzyme NADPH by recombinant strains

2.9 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

分別選取了誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度、接種量和裝液量4 個(gè)因素的最佳取值范圍，進(jìn)行了9 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的正交優(yōu)化試驗(yàn)，對正交表L9（34）試驗(yàn)結(jié)果采用直觀（極差）分析方法進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experimental optimization

（續(xù)表3）

因素極差越大，對指標(biāo)影響就越顯著。由表3可以看出，誘導(dǎo)溫度因素極差r 最大，表明誘導(dǎo)溫度作為主要因素，對輔酶NADPH 產(chǎn)量的影響最顯著，因此在重組菌株合成輔酶NADPH 的過程中應(yīng)該合理控制誘導(dǎo)溫度，應(yīng)進(jìn)行低溫誘導(dǎo)。由表4方差分析同樣可以看出，4 個(gè)因素對輔酶產(chǎn)量的影響程度大小為：誘導(dǎo)溫度＞裝液量＞接種量＞IPTG 濃度；以4 個(gè)因素水平作為橫坐標(biāo)，以NADPH 產(chǎn)量作為縱坐標(biāo)，繪制因素與指標(biāo)趨勢圖，如圖8所示。

表4 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)Table 4 Tests of between-subjects effects

從圖8可以直觀地看出，試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A1B3C3D3，即誘導(dǎo)溫度20 ℃、IPTG 濃度0.25 mmol/L、接種量1.5%、裝液量100 mL，對此組合進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下，輔酶NADPH 的產(chǎn)量為139.57 μmol/L。

圖8 4 因素與指標(biāo)趨勢圖Fig.8 Graph of four factors and indicator trends

2.10 誘導(dǎo)時(shí)間對輔酶NADPH 再生的影響

誘導(dǎo)時(shí)間對輔酶NADPH 再生的影響如圖9所示。在誘導(dǎo)時(shí)間0～48 h 范圍內(nèi)，輔酶NADPH 的產(chǎn)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而顯著增加，最高產(chǎn)量為151.79 μmol/L，而在誘導(dǎo)時(shí)間超過48 h 以后，輔酶NADPH 的含量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長呈現(xiàn)出下降趨勢，可能因?yàn)檎T導(dǎo)時(shí)間越長，副產(chǎn)物代謝積累越多，加快營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，不利輔酶NADPH的合成。

圖9 1 L 搖瓶中重組大腸桿菌產(chǎn)輔酶NADPH 的時(shí)間過程Fig.9 Time course of the production of coenzyme NADPH by recombinant E.coli in a 1 L shake flask

3 結(jié)論

本研究克隆了NADPH 再生的2 個(gè)關(guān)鍵酶基因即葡萄糖激酶基因（glk）與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（zwf），并將其導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）中，成功構(gòu)建了重組工程菌大腸桿菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf，葡萄糖激酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶均得到了可溶性表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了輔酶NADPH 的高效再生。同時(shí)研究了IPTG 濃度、誘導(dǎo)溫度、接種量、裝液量對輔酶NADPH 再生的影響，其中誘導(dǎo)溫度因素影響最為顯著，通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，獲得了重組工程菌株產(chǎn)輔酶NADPH 的最佳工藝條件：誘導(dǎo)溫度20 ℃、IPTG 濃度0.25 mmol/L、接種量1.5%、裝液量100 mL/250 mL。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，輔酶NADPH 平均產(chǎn)量為139.57 μmol/L。隨后研究重組菌株在最佳工藝條件下進(jìn)行1 L 發(fā)酵搖瓶發(fā)酵產(chǎn)輔酶NADPH 的時(shí)間過程，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h 后，輔酶NADPH產(chǎn)量高達(dá)151.79 μmol/L。研究結(jié)果為輔酶NADPH循環(huán)再生產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。