黃愛云,董曉博,康淑芳,陳 丹,崔夢迪,徐懷德
(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100)
鮮味作為5 種基本味覺成分之一,影響著消費者對食品的偏好[1]。自1908年,池田博士首次發(fā)現(xiàn)由谷氨酸鈉引起的味道并將其命名為鮮味以來,谷氨酸鈉成為最廣泛使用的食品鮮味增強劑[2]。然而,隨著消費觀念的轉(zhuǎn)變,消費者對于添加“味精”標(biāo)簽的食品已產(chǎn)生消極認(rèn)知[3]。此外,中國成年人平均每天食鹽攝入量超過WHO 推薦的2 倍,且多數(shù)風(fēng)味調(diào)味料都存在食鹽含量過高的問題,這對人體健康構(gòu)成了潛在的威脅[4]。正因如此,天然鮮味物質(zhì)受到廣泛關(guān)注[5-7]。天然鮮味物質(zhì)的存在會增強口腔對咸味的感知,可以達到降低食品中鈉的添加量而不影響食物整體滋味的作用。使用天然存在的鮮味化合物作為風(fēng)味增強劑,有利于提高消費者的接受度并預(yù)防慢性病的發(fā)生[8]。在眾多天然的鮮味物質(zhì)來源中,食用菌因獨特的鮮味而聞名于世。食用菌中含有的鮮味物質(zhì)使其在大多數(shù)食品制劑中具有適口性和適應(yīng)性,適合鮮味增強劑的開發(fā),目前已成功運用到各種食品的提鮮增味中,如酸奶、漢堡、玉米食品等[5-7]。
真姬菇(Hypsizygus marmoreus)因具有濃郁的海鮮蟹味,故被稱為海鮮菇、蟹味菇,這種獨特的風(fēng)味主要是由鮮味氨基酸與鮮味核苷酸引起的[9]。由于新鮮真姬菇子實體中鮮味氨基酸含量高達18.31~35.79 mg/g,鮮味核苷酸含量高達4.56~5.96 mg/g,因此真姬菇是一種良好的天然鮮味物質(zhì)來源[2,10]。鮮味物質(zhì)主要存在于食用菌細胞內(nèi),通過適宜的技術(shù)手段將細胞破碎,使內(nèi)容物充分釋放是鮮味物質(zhì)提取的關(guān)鍵。目前,食用菌中鮮味物質(zhì)的提取方式主要有酸解法、熱水浸提法及超聲輔助提取法等[11-13]。Tsai 等[11]采用酸解法提取3種食用菌氨基酸類風(fēng)味物質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測3種食用菌中總游離氨基酸含量均較低(8.97~14.91 mg/g);Poojary 等[12]采用熱水浸提法提取6種食用菌中的游離氨基酸及呈味核苷酸等鮮味成分,結(jié)果顯示:室溫下提取180 min 時游離氨基酸的提取率最高,70 ℃下提取30 min 時呈味核苷酸的提取率最高;林玲等[13]采用超聲波提取法對真姬菇氨基酸類風(fēng)味物質(zhì)進行提取,結(jié)果表明:最佳工藝條件為溫度80 ℃、時間30 min、料液比1∶16。這些方法雖提取速度快、操作簡便,但能耗高、有污染,且高溫條件易破壞水解產(chǎn)物中的熱敏性成分,使鮮味物質(zhì)的提取率下降。蛋白酶酶解技術(shù)可將蛋白質(zhì)、多肽降解為氨基酸,促進鮮味物質(zhì)的釋放,且條件溫和、副反應(yīng)少,水解過程中無有害副產(chǎn)物的生成[14]。將蛋白酶酶解技術(shù)運用于食用菌風(fēng)味物質(zhì)的提取,是目前的研究熱點[15-16]。Poojary等[15]采用蛋白酶酶解法提取6 種食用菌中的游離氨基酸及呈味核苷酸,結(jié)果顯示酶解法對這兩種物質(zhì)的提取率是酸解法的20 倍;許銳等[16]采用高壓蒸煮法和蛋白酶酶解法提取灰樹花游離氨基酸,發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶酶解處理鮮味氨基酸的含量是高壓蒸煮法的2~3 倍。這些研究表明蛋白酶酶解技術(shù)適用于提取食用菌中的鮮味物質(zhì)。真姬菇雖是一種優(yōu)良的鮮味物質(zhì)來源,但用不同蛋白酶處理對其鮮味物質(zhì)釋放的影響鮮有研究報道。另外,研究表明食用菌菌蓋和菌柄所含鮮味物質(zhì)有顯著差異,研究蛋白酶處理對真姬菇菌蓋和菌柄鮮味物質(zhì)釋放的影響,將促進真姬菇產(chǎn)品的精細化加工[17]。
本研究以熱風(fēng)干燥后真姬菇菌蓋與菌柄粉為原料,通過氨基酸自動分析儀、高效液相色譜儀和電子舌系統(tǒng)評估3 種單酶酶解(風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶)和2 種雙酶酶解(風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)配酶) 對真姬菇菌蓋與菌柄鮮味物質(zhì)釋放的影響。真姬菇作為一種已實現(xiàn)工廠化栽培,風(fēng)味獨特的優(yōu)良食用菌,目前面臨產(chǎn)品種類單一、附加值低等問題。利用蛋白酶酶解技術(shù)充分釋放真姬菇鮮味物質(zhì),可以促進真姬菇在開發(fā)天然少鹽鮮味調(diào)味品方面的應(yīng)用。
新鮮真姬菇,購于楊凌當(dāng)?shù)爻?;木瓜蛋白酶(酶活力?00 000 U/g)、復(fù)合蛋白酶(酶活力為100 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(酶活力30 000 U/g),北京索萊寶科技有限公司;5’-腺苷酸(5’-AMP)、5’-胞苷酸(5’-CMP)、5’-鳥苷酸(5’-GMP)、5’-肌苷酸(5’-IMP)、5’-尿苷酸(5’-UMP)標(biāo)準(zhǔn)品,阿拉丁試劑有限公司;氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma-Aldrich 公司。
水浴恒溫振蕩器,金壇市宏華儀器廠;高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;L-8900 氨基酸自動分析儀,日立公司;LC-2030 PLUS 高效液相色譜儀,日本島津公司;α-ASTREE 電子舌系統(tǒng),法國ALPHA MOS 公司。
1.3.1 材料預(yù)處理 挑選大小一致、無腐敗病變的新鮮真姬菇作為試驗材料。將真姬菇菌蓋與菌柄分離后在60 ℃下進行熱風(fēng)干燥,待水分含量降至12%以下時,粉碎過50 目篩,密封儲存于干燥器中。
1.3.2 蛋白酶酶解試驗設(shè)計 稱取一定量的真姬菇菌蓋與菌柄粉,按料液比1∶15 加蒸餾水,攪勻后分別選用風(fēng)味蛋白酶(風(fēng)味)、復(fù)合蛋白酶(復(fù)合)、木瓜蛋白酶(木瓜)、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配酶(風(fēng)+復(fù))、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)配酶(風(fēng)+木)對真姬菇菌蓋和菌柄進行酶解處理。各酶的水解條件見表1,水浴震蕩,待水解結(jié)束后將酶解液置于90~100 ℃條件下滅酶10 min,并于10 000 r/min 離心10 min,收集上清液待測[9,18]。
表1 不同蛋白酶處理組的酶解條件Table 1 Enzymolysis conditions of different proteases treatment groups
1.3.3 游離氨基酸含量的測定 參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》中的方法測定游離氨基酸的含量[19]。
1.3.4 呈味核苷酸含量的測定 依照Hu 等[20]的方法采用高效液相色譜儀測定呈味核苷酸含量。色譜條件:色譜柱Inertsustain-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流動相為KH2PO4(0.02 mol/L,pH=4.55)-乙腈(99.5∶0.5,體積比);檢測波長254 nm;流速1.0 mL/min;進樣量20 μL。
1.3.5 等效鮮味濃度的計算 等效鮮味濃度(EUC)具體計算公式如下[21]:
式中,ai——呈鮮氨基酸的量【谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)】,g/100 g;aj——呈鮮核苷酸的量(5’-AMP,5’-GMP,5’-IMP),g/100 g;bi——呈鮮氨基酸相對谷氨酸的值 (Glu=1,Asp=0.077);bj——呈味核苷酸相對于5’-肌苷酸的值 (5’-AMP=0.18,5’-GMP=2.3,5’-IMP=1);1218——協(xié)同作用常數(shù)。
1.3.6 電子舌分析 采用法國α-ASTREE 電子舌系統(tǒng),配有ZZ,JE,BB,CA,GA,HA,JB 共7 個傳感器,它們對樣品的鮮、咸、酸、甜和苦味敏感。將真姬菇酶解液稀釋10 倍后利用電子舌系統(tǒng)檢測并分析其味覺特性[22]。
使用Excel、SPSS 進行數(shù)據(jù)整理分析及顯著性檢驗,P<0.05 表示差異顯著,采用Origin 2018軟件繪圖。電子舌測試數(shù)據(jù)采用法國α-ASTREE電子舌系統(tǒng)自帶軟件進行處理,并利用PCA 法對樣品進行辨識分類。每組試驗重復(fù)3 次。
2.1.1 蛋白酶處理對真姬菇菌蓋與菌柄酶解液游離氨基酸組成的影響 鮮味活性成分使食用菌味道鮮美,其中占主導(dǎo)成分的是游離氨基酸[9]。不同蛋白酶處理的真姬菇菌蓋與菌柄酶解液的游離氨基酸含量如表2和表3所示。由表2和表3可知,真姬菇菌蓋中17 種游離氨基酸總量約為菌柄的2.5 倍,達到了90.84 mg/g,其中各游離氨基酸含量均高于菌柄。天冬氨酸在菌柄中并未檢出,而在菌蓋中含量達到了1.83 mg/g,谷氨酸在真姬菇菌蓋中的含量為13.61 mg/g,是菌柄的2.4 倍。Hu 等[20]在研究干燥對大球蓋菇非揮發(fā)性味覺成分的研究中發(fā)現(xiàn)大球蓋菇菌蓋中各游離氨基酸的含量均顯著高于菌柄,這與本試驗結(jié)果一致。與糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)相比(食物中必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量比例為4∶6 最適于人體消化吸收),真姬菇菌蓋與菌柄的必需氨基酸總量均占總游離氨基酸的38%左右,表明其具有良好的營養(yǎng)品質(zhì)[23]。
表2 不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋酶解液游離氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in the pileus hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
表3 不同蛋白酶處理真姬菇菌柄酶解液游離氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acids in the stipe hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
由表2和表3可知,與未處理組相比,除木瓜蛋白酶外其它各酶解處理組的游離氨基酸含量均顯著提升(P<0.05)。經(jīng)蛋白酶酶解后(除木瓜蛋白酶外),菌柄中游離氨基酸的總量從37.78 mg/g 顯著提升至52.29~69.54 mg/g,菌蓋中游離氨基酸的總量從90.84 mg/g 顯著提升至105.80~132.43 mg/g。在單酶酶解處理組中,從最終酶解液的各游離氨基酸含量來看,無論是菌蓋和菌柄,風(fēng)味蛋白酶的酶解效果都是最佳,其次是復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶。從兩種鮮味氨基酸來看,風(fēng)味蛋白酶處理組天冬氨酸和谷氨酸的含量顯著高于其它各單酶處理組(P<0.05),特別是天冬氨酸,其在菌柄對照組、復(fù)合和木瓜處理組中并未檢出,而經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解后含量達到了2.27 mg/g,菌蓋經(jīng)風(fēng)味蛋白酶處理后天冬氨酸的含量相較于對照組顯著提高約120%。在雙酶酶解處理組中,在相同的總酶濃度下,酶解2 h 后,2 種復(fù)配酶處理組的總游離氨基酸含量均相較于復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶有顯著提高(P<0.05),而與風(fēng)味蛋白酶處理組沒有顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明蛋白酶處理對于促進真姬菇菌蓋和菌柄中游離氨基酸的釋放具有顯著效果,與許銳等[16]在研究酶解對灰樹花呈味物質(zhì)釋放影響和常詩潔等[18]研究4 種蛋白酶水解雙孢蘑菇中的結(jié)果一致。Poojary 等[15]分別采用傳統(tǒng)酸提法和酶提法提取了香菇、白色雙孢蘑菇、棕色雙孢蘑菇、平菇、茶樹菇的總游離氨基酸,結(jié)果顯示酶提法使得提取效率提高了20 倍。不同蛋白酶處理的真姬菇菌蓋與菌柄酶解液的游離氨基酸含量不同的原因可能與不同蛋白酶不同的酶切位點有關(guān),風(fēng)味蛋白酶同時具有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性,相較于復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶可以更大程度地將真姬菇的蛋白質(zhì)和多肽降解為游離氨基酸[18,24]。
2.1.2 蛋白酶處理對真姬菇菌蓋與菌柄酶解液游離氨基酸呈味特征影響 17 種游離氨基酸可按其滋味特征分為5 類,包括鮮味、甜味、苦味、甜/苦味和無味,鮮味氨基酸包括天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),甜味氨基酸包括蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala),苦味氨基酸包括纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg),甜/苦味氨基酸包括脯氨酸(Pro)、賴氨酸(Lys),無味氨基酸包括蘇氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)[2]。由圖1可知,對照組真姬菇菌蓋和菌柄中鮮味氨基酸的含量分別為15.44 mg/g 和5.62 mg/g,約占總游離氨基酸的17%和15%。除木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶處理組外,菌蓋與菌柄其余3 組蛋白酶處理組酶解液中鮮味氨基酸含量均較對照組有顯著提升(P<0.05),其含量從高到低分別為風(fēng)+復(fù)(菌蓋含量為20.85 mg/g、菌柄含量為10.60 mg/g)>風(fēng)味(菌蓋含量為19.75 mg/g、菌柄含量為10.36 mg/g)>風(fēng)+木(菌蓋含量為19.09 mg/g、菌柄含量為9.34 mg/g)。Yang 等[25]報道食用菌中鮮味氨基酸的含量可分為3 個范圍:低(<5 mg/g)、中(5~20 mg/g)和高范圍(>20 mg/g),真姬菇菌蓋和菌柄所含鮮味氨基酸均處于中范圍(菌蓋含量為15.44 mg/g,菌柄含量為5.62 mg/g),這表明真姬菇菌蓋和菌柄均具有潛在的鮮味利用價值。對照組中菌蓋與菌柄苦味氨基酸分別占總游離氨基酸的38%和35%左右,經(jīng)2 h 酶解處理后,除木瓜蛋白酶處理組外,其它各處理組中苦味氨基酸均占總游離氨基酸的43%左右,顯著高于對照組(P<0.05)。蛋白酶處理在提高酶解產(chǎn)物中鮮味氨基酸含量的同時不可避免地生成苦味氨基酸,Poojary等[15]和李雪[26]在利用酶法提取食用菌鮮味氨基酸的研究中也發(fā)現(xiàn)苦味氨基酸的生成,這一現(xiàn)象可能是由于蛋白酶處理使某些含有苦味氨基酸的肽的裂解導(dǎo)致的[27]。
圖1 不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋(a)和菌柄(b)酶解液呈味氨基酸含量Fig.1 Contents of delicious amino acids in the pileus (a) and stipe (b) hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
不同蛋白酶處理的真姬菇菌蓋與菌柄酶解液呈味核苷酸的含量見表4。由表4可知,真姬菇菌蓋和菌柄中一共檢測出5 種呈味核苷酸,分別為5’-AMP、5’-UMP、5’-IMP、5’-GMP、5’-CMP。真姬菇菌柄中的5 種5’-核苷酸總量顯著低于菌蓋中的含量(P<0.05),菌蓋中的含量約是菌柄的2.6倍。食用菌中的呈鮮核苷酸包括5’-AMP、5’-IMP、5’-GMP[28],除風(fēng)味蛋白酶菌蓋處理組外,其余真姬菇酶解液處理組中總5’-核苷酸含量與對照組沒有顯著性差異(P>0.05),鮮味核苷酸的含量與對照組存在顯著性差異(P<0.05)。由表4可知,風(fēng)+復(fù)處理組的真姬菇菌蓋與菌柄酶解液擁有最高的鮮味核苷酸含量 (菌蓋含量為8.45 mg/g、菌柄含量為3.88 mg/g),顯著高于對照組和其它蛋白酶處理組(P<0.05)。Chen 等[17]在研究不同生長階段香菇菌蓋和菌柄中5’-核苷酸含量時發(fā)現(xiàn)在各個階段香菇菌蓋中的5’-核苷酸含量均高于菌柄,這與本研究結(jié)果一致。真姬菇菌蓋中呈味核苷酸的含量顯著高于香菇、雙孢蘑菇、平菇等食用菌[1],表明真姬菇菌蓋是潛在的制備食品調(diào)味料或食品風(fēng)味增強劑的優(yōu)質(zhì)原料。除木瓜蛋白酶菌柄處理組外,其它蛋白酶酶解處理均顯著提高了真姬菇菌蓋和菌柄的呈鮮核苷酸含量,主要原因是由于酶解處理顯著提高了酶解液中5’-AMP 的含量。
表4 不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋與菌柄酶解液呈味核苷酸含量Table 4 Contents of nucleotides in the pileus and stipe hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
Yamaguchi 等[21]在1971年已經(jīng)證實鮮味核苷酸和鮮味氨基酸有協(xié)同增鮮作用,后來研究發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同增鮮作用的主要原因是由于少量的5'-核苷酸就可以將低于閾值含量的鮮味氨基酸顯現(xiàn)出鮮味。EUC 值可對鮮味氨基酸與鮮味核苷酸協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強度進行評價,食用菌中的EUC 值可分為4 個等級:1)>1 000 g MSG/100 g;2)100~1 000 g MSG/100 g;3)10~100 g MSG/100 g;4)<10 g MSG/100 g[2]。由圖2可知,對照組真姬菇菌蓋與菌柄的EUC 值均處于第2 等級 (菌蓋為836.90 g MSG/100 g、菌柄為144.01 g MSG/100 g)。與對照組相比,除了復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶處理的菌柄組外,其它各處理組的EUC 值均顯著高于對照組 (P<0.05),雙酶處理組菌蓋酶解液的EUC 值最高 (風(fēng)+復(fù)蛋白酶處理組為1 333.75 g MSG/100 g、風(fēng)+木蛋白酶處理組為1 281.39 g MSG/100 g),這一結(jié)果顯著高于干燥后杏鮑菇和雙孢蘑菇的EUC 值(分別為52.52 g MSG/100 g 和776.00 g MSG/100 g)[28-29],原因可能與蘑菇品種以及加工方式的不同有關(guān)。菌蓋的EUC 值顯著高于菌柄的EUC 值的主要原因是真姬菇菌蓋的呈鮮氨基酸和呈鮮核苷酸含量均高于菌柄,這與Chen等[17]和Hu 等[20]的研究一致。根據(jù)以上結(jié)果,可以確定在相同的總酶濃度和各自最適的酶解條件下,風(fēng)+復(fù)蛋白酶處理相較于其它4 組蛋白酶處理更適于真姬菇菌蓋以及菌柄呈鮮物質(zhì)的釋放。
圖2 不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋與菌柄酶解液等效鮮味濃度值Fig.2 Equivalent umami concentrationin the pileus and stipe hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
采用主成分分析法(PCA)對不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋與菌柄酶解液的滋味進行分析,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,PCA 結(jié)果中第1 主成分占比84.625%,第2 主成分占比9.228%,前2 個主成分總貢獻率占比超過90%,不同蛋白酶酶解產(chǎn)物與對照組分布在不同區(qū)域表明不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋與菌柄酶解液及對照組的滋味特征存在明顯差異。與其它處理組相比,風(fēng)味蛋白酶處理組更接近于對照組,這說明在整體滋味上風(fēng)味蛋白酶處理的真姬菇菌蓋與菌柄酶解液更接近對照組[30]。圖4反應(yīng)了不同處理組真姬菇菌蓋與菌柄酶解產(chǎn)物電子舌傳感器響應(yīng)值的差異。由圖4可知,相較于菌柄,不同處理組的菌蓋酶解產(chǎn)物滋味特征相差更大,這可能與菌蓋的高蛋白含量相關(guān),蛋白質(zhì)經(jīng)過不同蛋白酶酶解后,產(chǎn)生了更加復(fù)雜多樣的滋味物質(zhì),導(dǎo)致其整體滋味物質(zhì)變化大,這與主成分分析結(jié)果一致。
圖3 不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋與菌柄酶解產(chǎn)物電子舌PCA 圖Fig.3 Principal component analysis graph for the electronic tongue in the pileus and stipe hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
圖4 不同蛋白酶處理真姬菇菌蓋(a)與菌柄(b)酶解產(chǎn)物電子舌雷達圖Fig.4 Radar graph for the electronic tonguein the pileus (a) and stipe (b) hydrolysates of Hypsizygus marmoreus treated with different proteases
本研究對不同蛋白酶處理對真姬菇菌蓋與菌柄鮮味物質(zhì)釋放的效果進行分析,得出以下結(jié)論:1)不同蛋白酶處理會引起真姬菇菌蓋與菌柄鮮味物質(zhì)釋放的不同,主要表現(xiàn)在游離氨基酸組成與含量以及呈味核苷酸含量差異顯著,且電子舌系統(tǒng)能夠較好地區(qū)分出不同蛋白酶處理的真姬菇酶解物的滋味差異;2) 在相同的總酶濃度和各自最適的酶解條件下,風(fēng)+復(fù)蛋白酶處理相較于其它4組蛋白酶處理更利于真姬菇菌蓋和菌柄中鮮味物質(zhì)的釋放;3) 真姬菇菌蓋相較于菌柄在開發(fā)鮮味物質(zhì)方面更有潛力。本研究為后續(xù)酶解技術(shù)應(yīng)用于真姬菇天然少鹽鮮味調(diào)味品方面的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù),促進真姬菇產(chǎn)品多樣化。