克服蘿卜自交不親和性的化學試劑篩選

倪 萌， 王 娟， 王 爽， 梅 燚， 柳李旺， 徐 良， 王 燕

(1.南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室/園藝學院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 鹽城 224002)

蘿卜(RaphanussativusL.)為十字花科重要根菜類作物，營養(yǎng)豐富、藥用價值高[1-2]，屬于典型異花授粉植物，雜種優(yōu)勢明顯，多具有自交不親和性(Self-Incompatibility，SI)，保證了遺傳多樣性[3-4]。利用自交不親和系進行雜交制種是利用雜種優(yōu)勢的重要途徑之一，避免了去雄操作，具有優(yōu)勢強、選育易、周期短等優(yōu)點。然而在實際生產(chǎn)中，蘿卜自交結(jié)籽困難限制了自交不親和系的繁殖與保存，不利于其在優(yōu)勢育種中的廣泛應用。

為提高自交不親和系的繁殖效率，育種工作者對克服SI的物理方法、化學方法、生物方法進行了研究。目前廣泛應用的CO2處理[5]、高溫處理[6]、鋼刷授粉[7]、射線輻射[8]等方法均可在一定程度上提高自交結(jié)實率，但操作困難，且效果不穩(wěn)定，難以實現(xiàn)廣泛應用。近年來，研究人員嘗試利用多種化學方法進行SI的克服，如利用鹽硼溶液(5%的氯化鈉與2%的硼酸的復合溶液)、植物激素處理。結(jié)果表明，化學試劑能夠明顯提高甘藍、白菜等蕓薹屬作物的親和性[9-10]。汪騫等[11]發(fā)現(xiàn)，3%的NaCl溶液能有效提高蘿卜的親和性，可接近人工蕾期授粉效果?；ㄆ趪娛㎞aCl溶液雖然具有價格低廉、節(jié)省人力物力的優(yōu)點，但是效率不高，且在應用上易造成作物鹽脅迫。此外，吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、細胞分裂素(6-BA)、赤霉素(GA3)等植物激素被發(fā)現(xiàn)可有效抑制蕓薹屬植物、百合和矮牽牛等植物的自交不親和性，但不同作物之間差異較大，且在蘿卜屬作物上克服自交不親和性的效果尚未明確。因此，急需尋找一種提高蘿卜自交不親和系親本繁殖效率的方法。

孢子體自交不親和主要表現(xiàn)為花粉水合與花粉管進入柱頭受到阻礙，導致受精過程不能完成。近期研究報道，孢子體SI植物的自交不親和性與柱頭活性氧(ROS)強度呈正相關[12-15]。在大白菜柱頭發(fā)育后期，自花花粉能夠誘導花期柱頭產(chǎn)生過量ROS，從而阻止花粉的萌發(fā)與花粉管的生長[15]。而在親和擬南芥中，自花授粉后ROS在柱頭中含量顯著降低，花粉能夠正常水合。因此，花粉管生長情況與柱頭ROS強度可作為判斷自交不親和性的依據(jù)。

本研究利用不同濃度的槲皮素(Quercetin，QUE)、油菜素內(nèi)酯(Bassinolide，BR)、褪黑素(Melatonin，MT)和激動素(Kinetin，KT)對3份蘿卜高代自交系花期柱頭進行噴施處理，比較不同處理下蘿卜的結(jié)莢率和親和指數(shù)。同時結(jié)合花粉管體外萌發(fā)及柱頭ROS強度變化的差異，篩選克服自交不親和性的最優(yōu)化學方法，以建立克服蘿卜自交不親和性技術體系，進一步提高蘿卜自交不親和材料的繁殖效率，促進蘿卜雜種優(yōu)勢的大面積應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用3個蘿卜高代自交系為試驗材料(表1)。種子消毒后在培養(yǎng)皿中催芽1～2 d，4 ℃春化30 d，2020年8月播種于南京農(nóng)業(yè)大學白馬教學科研基地的溫室大棚?；瘜W處理及授粉試驗于2020年11月至2021年5月進行。

表1 供試蘿卜材料

1.2 試驗方法

1.2.1 化學處理 本試驗設置不同濃度的QUE、BR、MT和KT共10個處理(表2)，其中100 mg/L激動素為本研究室前期篩選，空白對照組為去離子水處理，同時進行花期自交(Flowering pollination，F(xiàn)P)與蕾期自交(Bud pollination，BP)處理。選取各自交系長勢一致的植株，提前套袋，隔離授粉。于盛花期選取當天開的花進行噴施處理，每個處理5次重復，每個重復處理20～30朵花，柱頭干后進行人工自花授粉。其中MT易光解，處理后需要進行遮光處理。授粉5 d后拆袋，30～45 d后，待種子成熟后收獲。

表2 化學試劑及其處理濃度

1.2.2 親和性測定 待種莢成熟后，計算各處理與對照的結(jié)莢率及親和指數(shù)。蘿卜自交不親和性判定參照標準：親和指數(shù)小于0.5為強自交不親和，0.5～2.0為弱自交不親和，大于2.0為自交親和[16]。

1.2.3 花粉萌發(fā)試驗 取各處理及對照自交授粉后4.0 h及48.0 h花柱，固定于FAA固定液(50% 乙醇∶冰乙酸∶甲醛=18∶1∶1，體積比)中，4.0 h后倒掉固定液，用ddH2O清洗干凈并轉(zhuǎn)入10 mol/L NaOH中，42 ℃軟化0.5 h,用去離子水沖洗3次左右，加入適量0.1%苯胺藍染液(苯胺藍溶于1%的K3PO3)染色0.5 h以上[17-18]。樣品置于熒光顯微鏡奧林巴斯 BX53?DAPI通道，觀察花粉萌發(fā)狀態(tài)。每個處理至少取5個柱頭。

1.2.4 柱頭ROS測定 取各處理花柱浸入MES-KCl(各試劑終濃度為:10 mmol/L MES，5 μmol/L KCl，5 μmol/L CaCl2，pH=6.5)緩沖液中，抽真空10 min后，移至新鮮MES-KCl緩沖液中。用50 μmol/L的2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF-DA,購自索萊寶科技有限公司)熒光染料黑暗染色1 h[19]。樣品于奧林巴斯BX53?熒光顯微鏡GFP通道下觀察ROS強度，曝光時間為800～900 ms[17]，每個處理至少取5個柱頭。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計整理采用Image J及Excel軟件，差異顯著性分析采用IBM SPSS Statistics Base V20.0軟件和GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學試劑類型對蘿卜自交結(jié)實性的影響

與對照相比，本試驗所選用的4種化學試劑均能在一定程度上克服蘿卜自交不親和性，可有效提高結(jié)莢率和親和指數(shù)(表3)。其中100 mg/L KT處理后親和指數(shù)可達2.45，接近于BP處理(2.85)，與王琴[20]的試驗結(jié)果一致；QUE試劑不同濃度處理平均親和指數(shù)可達2.10，親和性顯著提高；BR和MT處理后親和指數(shù)分別是1.26和1.73，也提高了自交親和性。結(jié)莢率的平均效應與親和指數(shù)趨勢基本一致，各試劑處理后，結(jié)莢率高于FP處理和CK(表3)。

表3 化學試劑對蘿卜自交親和指數(shù)和結(jié)莢率的平均效應

所選用的化學試劑雖然均能不同程度地提高蘿卜自交親和性，但也受品種基因型的影響。在NAU-YXYB和 NAU-LV791中，KT克服蘿卜自交不親和性的效果最顯著，親和指數(shù)分別提高至2.90與2.58；其次為QUE、MT；BR效果不明顯。而對自交系NAU-WXQ，QUE處理效果較好(圖1)。

FP、BP、CK、QUE、BR、MT、KT見表3注。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 不同化學試劑處理下蘿卜自交親和指數(shù)(A)和結(jié)莢率(B)Fig.1 Self-compatibility index(A)and podding rate(B)of radish under different chemical reagents treatments

2.2 化學試劑濃度對蘿卜結(jié)實性的影響

適宜的試劑濃度對提高蘿卜的親和性至關重要。本研究選用的3個濃度的QUE處理均能在一定程度上提高蘿卜親和性，其中1.5 mmol/L QUE效果最顯著，3個自交系處理后其親和性均大幅提高；不同濃度的MT效果差異較大，100 μmol/L為最優(yōu)處理濃度，可大幅提高不親和自交系的結(jié)莢率和親和指數(shù)，過高或過低的濃度效果不理想。100 mg/L KT在各基因型蘿卜中克服自交不親和性的效果顯著，普適性較好。BR在不同基因型中效果差異較大，廣譜性也未得到證明(表4、圖2)。

表4 不同濃度化學試劑對蘿卜自交親和性的影響

圖2 強自交不親和系NAU-YXYB自花授粉4.0 h(A)及48.0 h(B)后花粉管生長情況Fig.2 Pollen tube growth of the strongly self-incompatible line NAU-YXYB after self-pollination for 4.0 h(A)and 48.0 h(B)

綜上所述，克服蘿卜自交障礙的最優(yōu)化學試劑為1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT，這些化學試劑處理均能有效克服蘿卜自交障礙，提高蘿卜自交親和性。

2.3 化學試劑對蘿卜自花授粉后花粉管生長的影響

采用苯胺藍染色法進一步探究化學試劑對蘿卜自花授粉后花粉管生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自花授粉后，強不親和系NAU-YXYB柱頭上幾乎無萌發(fā)的花粉粒；而蕾期授粉4.0 h后，柱頭上可清楚看到大量花粉粒萌發(fā)，并隨時間的延長花粉管成束穿過柱頭乳突細胞進入花柱組織。說明供試材料花期自交不親和性明顯。

分別用1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT處理新鮮花朵后，柱頭上粘附的花粉粒與未處理相比增多，苯胺藍染色結(jié)果(圖3)顯示，花粉能正常在柱頭上萌發(fā)，授粉48.0 h后能在柱頭下部觀察到延伸的花粉管。以上試劑均能打破柱頭屏障，使花粉粒正常水合、萌發(fā)，且花粉管伸長進入子房，完成受精作用。

2.4 不同化學試劑處理對蘿卜花期柱頭ROS強度的影響

有研究結(jié)果表明，孢子體自交不親和植物的自交不親和性與柱頭活性氧強度呈正相關。Lan等[21]對不同發(fā)育階段柱頭的蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，成熟期柱頭中參與ROS代謝的多個蛋白質(zhì)表達明顯上調(diào)，推測柱頭ROS強度是影響自交不親和的原因之一。利用熒光ROS檢測劑H2DCF-DA對對照蕾期、花期雌蕊及化學試劑處理后的花期雌蕊進行了染色并在熒光顯微鏡下成像記錄圖像，進行ROS差異分析。結(jié)果(圖3)表明，對照蕾期柱頭ROS強度遠低于花期柱頭，約為花期柱頭的36%，而1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT處理后的花期柱頭ROS強度均有所下降，與對照花期柱頭相比，下降幅度均在40%～50%。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 不同化學試劑處理后H2DCFDA ROS探針染色柱頭照片(A)與熒光強度(B)Fig.3 Images of stigma stained with H2DCFDA ROS probe (A) and fluorescence intensity (B) after treatment with different chemical reagents

3 討 論

在雜交育種實踐中，利用自交不親和系配制雜交種是蘿卜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑[22]。但是由于蘿卜本身自交親和性差，結(jié)籽率低，雜交親本繁殖與保存工作存在一定困難。因此，如何克服蘿卜的自交障礙，實現(xiàn)自交不親和系的高效繁殖成為蘿卜F1代雜交種生產(chǎn)實踐中亟待解決的關鍵問題。為了克服自交障礙，育種工作者已嘗試蕾期授粉、高溫處理后授粉[6]、電助授粉[23]等多種物理及生物學方法，但均由于操作復雜、生產(chǎn)成本高等缺點的限制，難以廣泛應用?；ㄆ趪娛}硼溶液、植物激素等方法在甘藍、白菜等蕓薹屬植物中取得了很好的效果，這些方法操作簡單、效率高、成本低，適合應用于大面積田間制種。

本研究對克服蘿卜自交不親和性的最優(yōu)化學方法進行了篩選。通過比較不同化學試劑(QUE、BR、MT、KT)克服蘿卜自交不親和性的效應，發(fā)現(xiàn)1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT 3種試劑處理能夠大幅提高蘿卜的自交親和性，處理后親和指數(shù)均達到2.0以上，可有效替代剝蕾授粉法在雜交親本繁殖中的應用。

孢子體自交不親和細胞學反應涉及花粉與柱頭的相互作用，通過阻止花粉粒的水合與活化或限制花粉管發(fā)育而發(fā)生；反應的信號傳導主要通過同一S單倍型的SRK與SCR/SP11相互識別，并激活下游信號傳導通路而發(fā)生[24-26]。QUE在克服孢子體自交不親和性上已有一定研究。作為一種蛋白激酶抑制劑，QUE可以抑制甘藍柱頭中SRK活性，克服甘藍自交不親和性[27-30]。本研究對QUE克服蘿卜自交不親和性能力及處理濃度進行探究，發(fā)現(xiàn)濃度1.0～2.0 mmol/L的QUE均能提高蘿卜的自交親和性。MT作為新型激素能增加受旱棉花雌蕊中物質(zhì)和能量的供應，促進花粉管伸長和胚珠受精[31]。本研究首次應用MT克服蘿卜自交不親和性，適宜濃度的MT克服蘿卜自交不親和性的效果十分明顯。100 mg/L KT對蘿卜自交不親和性的克服具有顯著效果，這與松原幸子等[32]的研究結(jié)果一致。

近年來，對SI機制的研究聚焦于柱頭ROS積累抑制自身花粉萌發(fā)上，Lan等[21]利用蛋白質(zhì)組學的研究方法研究發(fā)現(xiàn)，ROS代謝相關的蛋白質(zhì)在羽衣甘藍柱頭發(fā)育成熟期明顯富集；Zhang等[15]的研究結(jié)果表明，柱頭活性氧強度與大白菜自交不親和性呈正相關作用，作用分子機制為活性氧合成酶受到上游調(diào)控因子Rac/ROP小G蛋白及細胞表面受體激酶FERONIA的調(diào)控，抑制該信號通路則阻止自花授粉引起的柱頭活性氧強度升高，使柱頭不再抑制自花花粉的萌發(fā)。本研究利用熒光ROS檢測劑H2DCF-DA對未使用化學試劑處理(對照)蕾期、花期及使用化學試劑處理后的花期雌蕊進行ROS差異分析，發(fā)現(xiàn)與未使用化學試劑處理的花期柱頭相比，1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT處理后的花期柱頭ROS強度均有所下降，下降幅度為40%～50%，這與在白菜及羽衣甘藍中的研究結(jié)果一致；同時與花期自交授粉相比，試劑處理后柱頭胼胝質(zhì)的產(chǎn)生明顯被抑制，萌發(fā)的花粉數(shù)及伸長的花粉管顯著增加。推測可能是所選化學試劑處理通過降低花期柱頭ROS強度，打破了柱頭對自花花粉的屏障作用，從而提高了親和性，其具體分子機制有待進一步研究。