副豬嗜血桿菌的分離鑒定與滅活疫苗的初步研制

肖 敏，劉 建*，盧 昌，任 華，溫樹樺，曹華斌，王承寶，王 闖

(1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，江西南昌 330096；2.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌 330096；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌 330045；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)的一種革蘭氏陰性菌，體積較小，不具有運(yùn)動(dòng)性，形態(tài)多樣(從單球桿菌到絲狀鏈)[1]，在生長(zhǎng)過(guò)程中需要V因子(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)[2-3]。副豬嗜血桿菌是4周齡～8周齡仔豬上呼吸道的早期寄居菌，母源免疫水平、菌落定居情況及機(jī)體免疫系統(tǒng)的變化可以引起豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[4]，臨床癥包括高熱(41.5℃)、咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫脹伴有跛行以及側(cè)臥、四肢劃動(dòng)和震顫等[5]。在感染豬場(chǎng)內(nèi)，副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率和死亡率存在著很大的變化，一般豬群副豬嗜血桿菌病發(fā)病率可能從5%～10%不等，在陰性豬群中可達(dá)到75%[6]。

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道內(nèi)的寄生菌，鼻腔和氣管的病原菌檢測(cè)并不能對(duì)該病菌進(jìn)行診斷?？梢詮睦w維素滲出物、發(fā)病豬的內(nèi)臟器管實(shí)質(zhì)和肺炎病豬的肺臟病變部位對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行分離鑒定，從而對(duì)該病進(jìn)行診斷[7]。該菌生長(zhǎng)條件十分苛刻，在室溫下僅少量可以存活，對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行抗生素敏感性的測(cè)定和病原菌的分型十分重要[8]。本研究主要從副豬嗜血桿菌感染癥狀比較典型的30日齡～50日齡病豬的肺臟組織、關(guān)節(jié)積液、腹腔積液、胸腔積液進(jìn)行細(xì)菌分離，然后用PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定及血清型分型，為黑龍江、江西和廣東地區(qū)部分豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌的研究提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)。同時(shí)初步研制了副豬嗜血桿菌的單價(jià)滅活疫苗，為副豬嗜血桿菌的多聯(lián)多價(jià)疫苗研制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡～8周齡Balb/c小鼠購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。20日齡～25日齡仔豬購(gòu)自江西某豬場(chǎng)，該豬場(chǎng)未發(fā)生過(guò)豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病，未免疫過(guò)豬鏈球菌疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗，仔豬無(wú)豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病臨床癥狀。試驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理均符合相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；特級(jí)新生牛血清，草原綠野生物工程材料有限公司產(chǎn)品；氧化輔酶Ⅰ(NAD)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；商品化豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，武漢科前生物股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 分光光度計(jì)，上海精科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)核酸提取儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 從黑龍江、江西、廣東3個(gè)省12個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)采集疑似副豬嗜血桿菌病料，發(fā)病豬為30日齡～50日齡，主要臨床癥狀為呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及黏膜發(fā)紺、站立困難甚至癱瘓。病豬停藥后5 d～10 d，剖檢取病豬完整肺部，如有關(guān)節(jié)積液、腹腔積液、胸腔積液等病料，用一次性注射器吸取，4℃保存用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離。

1.2.2 細(xì)菌分離 用無(wú)菌棉簽將肺部病變部位、肺支氣管黏液和其他積液涂布于含有NAD的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，同時(shí)蘸取金黃色葡萄球菌劃線，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后觀察；挑取沿金黃色葡萄球菌“衛(wèi)星生長(zhǎng)”的菌落，再次在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，同時(shí)蘸取金黃色葡萄球菌劃線，37℃培養(yǎng)24 h～48 h。挑取沿金黃色葡萄球菌“衛(wèi)星生長(zhǎng)”的菌落，接種胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h～16 h，用于后續(xù)菌落鑒定。

1.2.3 生化鑒定 無(wú)菌條件下用接菌環(huán)刮取多個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，并分別接種過(guò)氧化氫酶、吲哚、蔗糖、乳糖、七葉苷和甘露醇等微量生化鑒定管中，隨后加入3 μL～5 μL的NAD，并設(shè)置對(duì)照組，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行判定。

1.2.4 PCR鑒定及血清型分型 根據(jù)GenBank公布的豬副豬嗜血桿菌序列，結(jié)合Ologo6.0及Primeer Premier軟件自行設(shè)計(jì)1對(duì)副豬嗜血桿菌16S rRNA引物以及15對(duì)分型引物，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成(表1)。副豬嗜血桿菌基因組DNA模板提取及PCR反應(yīng)參照文獻(xiàn)[3]。

表1 副豬嗜血桿菌血清型引物核苷酸序列

1.2.5 副豬嗜血桿菌的毒力試驗(yàn) 選取25只6周齡～8周齡Balb/c小鼠，隨機(jī)分成5組，每組5只，分別設(shè)置不同活菌濃度組6×109、6×108、6×107、6×106CFU/mL和未攻毒對(duì)照組，皮下注射0.2 mL菌液，未攻毒對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。按照Reed&Muench氏法計(jì)算副豬嗜血桿菌的LD50。

1.2.6 疫苗制備 副豬嗜血桿菌菌種(2型、7型、13型)分別接種含有50 mL/L新生牛血清和10 g/L NAD的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h。培養(yǎng)的菌液6 000 r/min離心5 min，棄上清，用無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液將沉淀重懸至1.2×109CFU/mL。按體積比加入1 mL/L甲醛溶液，37℃靜置滅活24 h～48 h，期間每隔4 h攪拌1次。取滅活后的菌液涂布于大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，進(jìn)行活菌檢驗(yàn)，以確保滅活徹底。然后與水包油包水佐劑充分混勻，使得副豬嗜血桿菌的終濃度為6×109CFU/mL。疫苗適用于4周齡～8周齡仔豬，免疫劑量為每頭份2.0 mL。

1.2.7 疫苗安全性試驗(yàn) 選取20日齡～25日齡仔豬15頭，隨機(jī)分成3組，每組5頭，試驗(yàn)分組分別為試驗(yàn)Ⅰ組(本試驗(yàn)疫苗)、試驗(yàn)Ⅱ組(佐劑組)、試驗(yàn)Ⅲ組(空白組)，試驗(yàn)Ⅰ組頸部肌肉注射2 mL的本試驗(yàn)疫苗，試驗(yàn)Ⅱ組注射2 mL佐劑，試驗(yàn)Ⅲ組注射2 mL無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液。連續(xù)觀察仔豬7 d，對(duì)仔豬體溫、飲食、精神狀況、死亡情況進(jìn)行記錄，評(píng)價(jià)疫苗的安全性。

1.2.8 疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn) 選取20日齡～25日齡仔豬40頭，隨機(jī)分成4組，每組10頭，試驗(yàn)分組分別為試驗(yàn)Ⅰ組(本試驗(yàn)疫苗)、試驗(yàn)Ⅱ組(商品疫苗組)、試驗(yàn)Ⅲ組(不免疫組)、試驗(yàn)Ⅳ組(未免疫不攻毒組)。免疫組仔豬頸部肌肉免疫2次，首免后35 d進(jìn)行二免，每次免疫劑量為1 mL/頭。二免后2周，所有免疫組和攻毒對(duì)照組口服4 mL(5×109CFU/mL)的副豬嗜血桿菌活菌。在免疫前、攻毒前和攻毒后7 d分別采集仔豬血清和鼻腔拭子。

2 結(jié)果

2.1 菌落和細(xì)菌形態(tài)

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，離金黃色葡萄球菌菌苔越近長(zhǎng)勢(shì)越好，越遠(yuǎn)菌落較小甚至未出現(xiàn)菌落(圖1A)。陰性對(duì)照組在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h～48 h后，可以觀察到金黃色葡萄球菌附近無(wú)“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”(圖1B)。

圖1 副豬嗜血桿菌的衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～10.樣品；+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照

2.2 菌株生化鑒定結(jié)果

取副豬嗜血桿菌疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下可以觀察到革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同形態(tài)，從單個(gè)球桿菌到長(zhǎng)的、細(xì)長(zhǎng)的、甚至絲狀的菌體。將疑似菌落接種于過(guò)氧化氫生化鑒定管中，肉眼可見鑒定管中產(chǎn)生明顯的氣泡，而陰性對(duì)照組無(wú)氣泡產(chǎn)生；接種于蔗糖、乳糖、七葉苷、吲哚和甘露糖微量生化鑒定管中，蔗糖生化鑒定管由淡色變?yōu)辄S色，乳糖、七葉苷、吲哚和甘露糖生化鑒定管顏色沒(méi)有變化。

2.3 副豬嗜血桿菌PCR鑒定和分型鑒定結(jié)果

根據(jù)NCBI公布的副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)上述分離獲得的副豬嗜血桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出，PCR擴(kuò)增的目的片段位于750 bp～1 000 bp，與預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段814 bp大小一致(圖2)。利用15對(duì)副豬嗜血桿菌分型引物對(duì)上述細(xì)菌進(jìn)行分型鑒定，部分副豬嗜血桿菌分型瓊脂糖電泳結(jié)果(圖3)，黑龍江H豬場(chǎng)和I豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌利用12型引物擴(kuò)增出508 bp大小的片段，黑龍江G豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌利用13型引物擴(kuò)增出800 bp大小的片段。13個(gè)豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌的血清型分型情況(表2)。

A.副豬嗜血桿菌12型檢測(cè)結(jié)果，M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照；1.黑龍江F豬場(chǎng)Hps；2.黑龍江G豬場(chǎng)；3.黑龍江H豬場(chǎng)

表2 各豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌血清型分型情況

2.4 副豬嗜血桿菌的小鼠毒力試驗(yàn)

Balb/c小鼠皮下接種6×109、6×108、6×107、6×106CFU/mL副豬嗜血桿菌后，均出現(xiàn)精神不振，試驗(yàn)組小鼠于48 h內(nèi)都出現(xiàn)死亡(圖4)。用Reed &Muench氏法計(jì)算副豬嗜血桿菌的50%感染致死量(LD50)，不同血清型副豬嗜血桿菌的50%感染致死濃度為5.0×107CFU/mL～1.0×108CFU/mL。

圖4 小鼠感染副豬嗜血桿菌后的存活情況

2.5 副豬嗜血桿菌滅活疫苗對(duì)仔豬免疫保護(hù)結(jié)果

副豬嗜血桿菌2型、7型、13型單價(jià)滅活疫苗分別經(jīng)頸背部肌肉免疫2 mL(6×109CFU/mL)，隨后逐日觀察仔豬的精神狀態(tài)及死亡情況。副豬嗜血桿菌滅活疫苗免疫組、佐劑免疫組和空白對(duì)照組仔豬體溫均正常、精神狀態(tài)良好，沒(méi)有死亡情況。副豬嗜血桿菌單價(jià)滅活疫苗免疫組利用同源菌株攻毒后沒(méi)有出現(xiàn)仔豬死亡情況，鼻腔拭子未檢測(cè)出Hsp核酸；而未免疫攻毒組出現(xiàn)仔豬死亡情況，且鼻腔拭子的Hsp核酸為陽(yáng)性。用副豬嗜血桿菌間接血凝診斷試劑盒對(duì)仔豬免疫前和二免后14 d的血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，二免后14 d疫苗免疫組仔豬抗體水平較免疫前明顯升高，且副豬嗜血桿菌單價(jià)滅活疫苗的抗體水平與商品苗的抗體水平差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 二免后14 d仔豬免疫后抗體水平

3 討論

近年來(lái)隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；i場(chǎng)豬群受豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等病毒感染后，可以繼發(fā)副豬嗜血桿菌病[9-13]。副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道寄生細(xì)菌，在健康豬群中該細(xì)菌的分離率為0～51.6%，其中仔豬群的分離率高達(dá)22.6%[14]。副豬嗜血桿菌有15個(gè)血清型，不同血清型的致病力也不相同，其中1型、2型、3型、4型、5型、8型、10型、12型、13型、14型和15型的致病力較強(qiáng)，而6型、7型、9型和11型沒(méi)有致病力[15]。副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)豬群中主要的流行血清型為4型、5型、12型、13型和14型[16]。本研究對(duì)我國(guó)黑龍江、江西和廣東地區(qū)部分豬場(chǎng)的副豬嗜血桿菌疑似病豬進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離，從發(fā)病豬中分離得到19株副豬嗜血桿菌，其中2型2株、4型7株、5型1株、10型1株、12型3株、13型2株、15型1株及低毒力株7型2株。這為黑龍江、江西和廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌的防控提供了流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

疫苗接種和抗生素是用于副豬嗜血桿菌感染的預(yù)防和控制手段，但是抗生素的長(zhǎng)期使用使副豬嗜血桿菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，疫苗接種成為該病防治最為有效的措施[17]。我國(guó)商品化副豬嗜血桿菌以滅活疫苗為主，主要包含血清型1型、4型、5型、12型和13型。副豬嗜血桿菌不同菌株和不同血清型之間僅有部分交叉保護(hù)或無(wú)交叉保護(hù)，這使得目前商品化的滅活疫苗保護(hù)效果較差，不能有效的控制豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌的流行[18]。

本研究從黑龍江、江西、廣東3個(gè)省12個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)分離得到19株副豬嗜血桿菌，包括2型2株、4型7株、5型1株、7型2株、10型1株、12型3株、13型2株、15型1株，由于廣東、黑龍江、江西副豬嗜血桿菌均有多種血清型流行，且我國(guó)的商品化副豬嗜血桿菌滅活疫苗以1、4、5、12、13型為主，故初步研究了副豬嗜血桿菌2、7、13型單價(jià)滅活疫苗。本次研制的副豬嗜血桿菌單價(jià)滅活疫苗免疫仔豬14 d后，血清中副豬嗜血桿菌抗體濃度達(dá)到700 ng/mL，對(duì)同血清型的副豬嗜血桿菌的免疫保護(hù)率達(dá)到100%。副豬嗜血桿菌單價(jià)滅活疫苗產(chǎn)生的抗體水平與商品苗的抗體水平之間沒(méi)有顯著差別，為副豬嗜血桿菌多聯(lián)多價(jià)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。