奶牛圍產(chǎn)期瘤胃菌群變化及影響因素研究進展

項開合，胡曉宇，李 爽，王 瑩，張云現(xiàn)，張乃生*

(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118000；2.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；3.齊魯動物保健品有限公司，山東濟南 250100)

奶牛圍產(chǎn)期主要指奶牛產(chǎn)前3 周至產(chǎn)后3 周這一時期 ，其特征是動物生理發(fā)生劇烈變化，動物正常營養(yǎng)代謝和能量平衡的維持面臨嚴峻挑戰(zhàn)[1]。不同于單胃動物，奶牛體內(nèi)能量供應(yīng)主要來源于瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的大量揮發(fā)性脂肪酸，而瘤胃微生物在飼料發(fā)酵過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。奶牛的瘤胃中存在豐富多樣的微生物群落，如細菌、原生動物、古細菌和真菌等，它們與宿主具有共生關(guān)系。瘤胃微生物群落是動態(tài)的，往往隨著飲食、宿主、生理狀態(tài)和環(huán)境的變化而變化[3]。生產(chǎn)過程中，為了適應(yīng)產(chǎn)后泌乳需要，圍產(chǎn)期奶牛從干奶期高纖維飲食轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔巷嬍?，這種轉(zhuǎn)變往往導(dǎo)致瘤胃菌群的劇烈變化[4]，并且可能與圍產(chǎn)期疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系。了解圍產(chǎn)期奶牛瘤胃菌群組成、變化及影響因素，對于圍產(chǎn)期奶牛飼養(yǎng)管理及疾病防控具有重要意義。傳統(tǒng)的瘤胃菌群分析主要依賴細菌培養(yǎng)方法，而很多瘤胃內(nèi)含量較低或生長條件苛刻的細菌無法通過體外培養(yǎng)獲得。近年來，隨著微生物組學(xué)與宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)展，使得更加深入細致的研究瘤胃菌群組成、變化、功能預(yù)測與分析成為可能。

1 圍產(chǎn)期瘤胃菌群組成

圍產(chǎn)期瘤胃活躍的菌群由20個細菌門組成，其中豐度最高的幾個細菌門是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、纖維菌門(Fibrobacteres)、軟壁菌門(Tenericutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。在其他分類水平上，豐度比較高的是厚壁菌門的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)，擬桿菌門的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)，變形菌門的琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，纖維菌門的纖維桿菌屬(Fibrobacter)，螺旋體門的密螺旋體屬(Treponema)[5]。Zhu Z等[6]通過對圍產(chǎn)期奶牛瘤胃菌群分析發(fā)現(xiàn)最大優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，其次是擬桿菌門和變形菌門，最大優(yōu)勢菌屬為瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、纖維桿菌屬和丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)。與其他時期瘤胃菌群功能一致，圍產(chǎn)期瘤胃菌群按照功能不同大體可劃分為纖維素與半纖維素降解細菌，淀粉、蛋白及脂肪降解細菌，產(chǎn)甲烷菌、酸利用菌和乳酸產(chǎn)生菌[7]。

2 圍產(chǎn)期瘤胃菌群特點

2.1 菌群豐度與多樣性變化

瘤胃菌群適當(dāng)?shù)呢S度，多樣性和穩(wěn)定性對瘤胃健康與瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。研究表明，圍產(chǎn)期瘤胃菌群豐度往往隨著時間的推移而逐漸降低，并且在泌乳期較低[8]。研究發(fā)現(xiàn)，母牛分娩后瘤胃菌群豐度和多樣性降低[9]。產(chǎn)后早期奶牛瘤胃菌群豐度急劇下降，且這種下降比較短暫[8]。以谷物為基礎(chǔ)的日糧進行飼喂，瘤胃菌群多樣性普遍降低，這種減少可能與發(fā)酵結(jié)構(gòu)碳水化合物的細菌可利用的底物減少以及隨后的較低pH有關(guān)。同時，細菌多樣性的減少與菌群豐度的減少有關(guān)，在以谷物為基礎(chǔ)的日糧飼喂的牛也觀察到了這種情況[10]。多數(shù)研究表明圍產(chǎn)期菌群的這種變化趨勢，即隨著奶牛從干奶期過渡到泌乳期，從高纖維飼料轉(zhuǎn)變到高精料飼喂，瘤胃菌群豐度和多樣性隨之下降。而在采集到的圍產(chǎn)期瘤胃液樣本中，沒有觀察到明顯的菌群豐度和多樣性變化[11]?？傊瑖a(chǎn)期瘤胃菌群變化迅速發(fā)生，表明細菌群落適應(yīng)表現(xiàn)出來所需的時間很短。盡管隨著精料比例的逐漸增加，瘤胃菌群豐度的降低變得不那么明顯，但與產(chǎn)前相比，產(chǎn)后的豐度仍然較低。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)與組成變化

隨著飼料及飼喂模式轉(zhuǎn)變及距離分娩時間不同，奶牛圍產(chǎn)期瘤胃菌群種類及豐度在不同階段會發(fā)生相應(yīng)變化，產(chǎn)前軟壁菌門、綠彎菌門和疣微菌門所占比例較高，產(chǎn)后放線菌門(Actinobacteria)所占比例較高[12]。而作為瘤胃液中豐度最高的2個菌門，厚壁菌門與擬桿菌門細菌豐度及種類在圍產(chǎn)期變化尤為明顯。當(dāng)奶牛從產(chǎn)犢前的飲食過渡到哺乳期的飲食時，最顯著的變化是擬桿菌比例的增加和厚壁菌的減少[4]。與產(chǎn)前相比，產(chǎn)后擬桿菌與厚壁菌的比值幾乎翻了一番(從6∶1到12∶1)。擬桿菌門的優(yōu)勢菌屬普雷沃氏菌和擬桿菌屬與產(chǎn)后瘤胃生態(tài)系統(tǒng)呈正相關(guān)，而厚壁菌門的瘤胃球菌屬，丁酸弧菌屬和克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)則在產(chǎn)前瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中富集[12]。厚壁菌門/擬桿菌門比值(F/B)可以看做腸道菌群代謝潛能的生物標(biāo)志，與某些疾病的發(fā)生、宿主的新陳代謝及生理健康密切相關(guān)[13]。產(chǎn)后瘤胃菌群的另一個值得注意的特征是鏈球菌和乳桿菌屬的過度表達，作為瘤胃內(nèi)重要的淀粉利用者及乳酸產(chǎn)生者，該類細菌隨著產(chǎn)后高精料飼喂逐漸占據(jù)優(yōu)勢[14]。對干奶期及泌乳早期瘤胃菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著精料增加，泌乳早期梭菌豐度較低，擬桿菌豐度較高，纖維桿菌相對豐度降低，相比于產(chǎn)前，氣單胞菌(Aeromonadales)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、醋香腸菌屬(Acetitomaculum)和未分類琥珀酸弧菌科細菌的相對豐度明顯升高[8]。盡管缺乏足夠的直接證據(jù)，但圍產(chǎn)期瘤胃菌群的變化與遷移可能與某些圍產(chǎn)期疾病發(fā)病率升高密切相關(guān)。瘤胃中革蘭氏陽性產(chǎn)乳酸菌，如鏈球菌與乳酸菌大量增殖，可能導(dǎo)致pH降低，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(SARA)[15]。而隨著產(chǎn)后產(chǎn)乳酸菌數(shù)量增加，但丙酸生成菌，包括反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌的數(shù)量顯著減少，瘤胃中生成的過量乳酸不能及時分解，導(dǎo)致生糖先質(zhì)及能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致酮病發(fā)病率升高[16]。

3 影響因素

3.1 品種和胎次

不同品種牛瘤胃菌群存在顯著差異，而奶牛處于不同生理階段也會對瘤胃菌群組成及豐度造成一定影響。調(diào)查產(chǎn)后飲食對處于圍產(chǎn)期3個不同品種頭胎奶牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)娟珊牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌Mbr.thaueri的平均豐度較低(26.9%)，荷斯坦純種(30.7%)和荷斯坦-娟珊牛雜交牛(30.3%)較高[17]。研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期飼喂相同飼料，與低產(chǎn)奶牛相比較，高產(chǎn)奶牛擬桿菌門豐度及擬桿菌門/厚壁菌門比值更高，布氏普雷沃氏菌(Prevotellabryantii)等多種與瘤胃液中丙酸摩爾比例顯著相關(guān)的細菌豐度明顯更高[18]。此外，通過圍產(chǎn)期瘤胃菌群分析發(fā)現(xiàn)，無論在門水平還是屬水平，初產(chǎn)母牛和多胎次母牛均存在顯著差異[4]。其中，初產(chǎn)母牛主要表現(xiàn)為擬桿菌門增多，且普雷沃氏菌更為豐富，多胎次母牛主要表現(xiàn)為軟壁菌門增多。

3.2 日糧

一般來講，腸道菌群組成及功能主要取決于飼料種類及攝入量。高精料日糧常導(dǎo)致瘤胃菌群多樣性下降，相反，高草料日糧常導(dǎo)致瘤胃菌群多樣性升高[19]。對產(chǎn)后3周左右的中國荷斯坦奶牛進行飼喂試驗，發(fā)現(xiàn)飼喂高精日糧奶牛瘤胃菌群豐度及多樣性均低于飼喂低精日糧奶牛[20]。 圍產(chǎn)期奶牛飼喂的主要特點是由干奶期的高草料飼喂轉(zhuǎn)變?yōu)槊谌槠诘母呔巷曃?，以提供更多的能量滿足泌乳需要，為了盡量緩解分娩及泌乳應(yīng)激，同時為瘤胃微生物提供足夠的適應(yīng)時間，通常選擇在圍產(chǎn)前期逐步更換飼料[21]。在奶牛圍產(chǎn)期采用典型兩段式飼喂方式，奶牛干奶期飼喂高粗料，產(chǎn)前21 d開始轉(zhuǎn)換成高能量飼料直到泌乳，分娩后飼喂一般泌乳料[12]。結(jié)果表明，被認為是主要的瘤胃纖維分解菌的瘤胃球菌屬和丁酸弧菌屬在產(chǎn)前瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中明顯增多，產(chǎn)后自主性干物質(zhì)采食量增加，能量代謝途徑富集，主要表現(xiàn)為蛋白水解、淀粉水解和乳酸產(chǎn)生菌，包括普雷沃氏菌、鏈球菌和乳酸桿菌等組成的細菌屬的富集。干奶期高粗飼料含有更高比例的纖維素，因此纖維素降解菌數(shù)量相對較高，而更換高精飼料后，由于飼料中含有大量谷物及其他易發(fā)酵碳水化合物，纖維素含量低，瘤胃發(fā)酵模式改變，纖維降解菌急劇減少，淀粉分解菌、蛋白分解菌數(shù)量快速增加[22]。

3.3 微生態(tài)制劑

在基礎(chǔ)日糧中添加微生物能夠調(diào)節(jié)瘤胃及腸道菌群，提高反芻動物生長性能和飼料利用率，并可能在一定程度上減少圍產(chǎn)期疾病的發(fā)生。以多種酵母組成的復(fù)合微生態(tài)制劑飼喂圍產(chǎn)期奶牛，發(fā)現(xiàn)瘤胃中布氏普雷沃氏菌(Prevotella)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、嗜淀粉瘤胃細菌(Ruminobacteramylophilus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、厭氧弧桿菌(Anaerovibriolipolytica)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、反芻月形單胞菌(Selenomonasruminantium)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)的數(shù)量顯著增加，在一定程度上抑制了乳酸桿菌及牛鏈球菌的生長，表明添加微生態(tài)制劑可以影響瘤胃菌群組成，并可能通過改變瘤胃發(fā)酵模式緩解能量負平衡，預(yù)防圍產(chǎn)期疾病[16]。分析奶牛圍產(chǎn)期飼喂活性酵母添加劑后瘤胃菌群變化情況，分別在產(chǎn)前14 d，產(chǎn)后7 d及21 d采集瘤胃液進行檢測，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，添加活性酵母后在產(chǎn)前14 d增加了擬桿菌、毛螺菌科和Flexilinea的相對豐度，在產(chǎn)后21 d增加了鏈球菌的相對豐度[23]。添加活性酵母對瘤胃菌群的影響作用主要表現(xiàn)在分娩前，不同的采樣時間也會明顯影響瘤胃菌群變化。

3.4 其他飼料添加劑

很多飼料添加劑都可以影響瘤胃發(fā)酵及菌群結(jié)構(gòu)，從而提高發(fā)酵效率，保證瘤胃健康，其中抗微生物生長促進劑應(yīng)用最為廣泛。莫能菌素是一種聚醚類抗生素，能夠選擇性抑制某些微生物生長代謝過程，是最常用的反芻動物促生長抗生素之一。莫能菌素能夠通過調(diào)節(jié)瘤胃菌群組成來影響甲烷、乙酸、丙酸的生成。隨著抗生素的使用受到限制，很多植物性抗菌劑成為研究熱點，顯示出廣闊的應(yīng)用前景，如啤酒花苦味酸，可以抑制產(chǎn)甲烷菌生長，抑制牛鏈球菌等革蘭氏陽性菌的生長，而對革蘭氏陰性菌不敏感，顯示出與莫能菌素類似的作用[24]。在犢牛飼料中添加牛至精油和莫能菌素，發(fā)現(xiàn)兩者對瘤胃菌群都具有調(diào)節(jié)作用，添加牛至精油可使?fàn)倥Ａ鑫傅鞍捉到饩S度升高，產(chǎn)丁酸菌屬豐度降低，更重要的是其可能對莫能菌素所導(dǎo)致的有益菌群的破壞具有一定緩沖作用[25]。此外，瘤胃保護性補充劑的應(yīng)用越來越廣泛，但其對瘤胃菌群影響作用尚未可知。在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加瘤胃保護蛋氨酸，并在產(chǎn)前10 d和產(chǎn)后20 d采集瘤胃液檢測瘤胃菌群，結(jié)果反芻獸月形單胞菌是豐度最高的細菌種類，與產(chǎn)前相比，產(chǎn)后脂解厭氧弧桿菌、瘤胃巨型球菌、布氏普雷沃氏菌， 反芻獸月形單胞菌和牛鏈球菌相對豐度升高，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、溶淀粉琥珀酸單胞菌(Succinimonasamylolytica)和溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)相對豐度下降[26]。

3.5 圍產(chǎn)期疾病

腸道菌群紊亂能夠?qū)е露喾N疾病發(fā)生，很多疾病發(fā)生過程中存在菌群組成及結(jié)構(gòu)變化。在反芻動物，由于瘤胃及瘤胃微生物的重要作用，瘤胃菌群正常與否對于奶牛機體健康尤為重要。奶牛圍產(chǎn)期通常伴隨酮病和低鈣血癥等代謝性疾病發(fā)生，并且往往導(dǎo)致子宮炎、乳腺炎、蹄葉炎、胎衣不下、真胃變位等疾病發(fā)病率升高[27]。瘤胃菌群的多樣性及菌群構(gòu)成會不斷變化，瘤胃pH可能會影響瘤胃細菌群落的組成和多樣性，反之亦然。同時，通過減少瘤胃pH的不利變化，奶牛瘤胃發(fā)酵可以適應(yīng)重復(fù)的SARA挑戰(zhàn)[28]。此外，奶牛酮病與瘤胃菌群組成及瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的不同揮發(fā)性脂肪酸含量及比例密切相關(guān)，奶牛瘤胃菌群與亞臨床酮病發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)，其中相關(guān)性最強的是普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科細菌[29]。人工誘導(dǎo)SARA導(dǎo)致乳腺炎，瘤胃菌群紊亂是導(dǎo)致奶牛乳腺炎發(fā)生的重要內(nèi)在因素，而寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)可能是導(dǎo)致乳腺炎發(fā)生的內(nèi)源性病原菌之一[30],奶牛蹄葉炎也可能與瘤胃菌群紊亂所導(dǎo)致的血中乳酸升高及內(nèi)毒素血癥有關(guān)[31]。

4 展望

在奶牛圍產(chǎn)期，從高纖維飲食轉(zhuǎn)向低纖維飲食導(dǎo)致瘤胃菌群發(fā)生變化，并與多種圍產(chǎn)期疾病的發(fā)生密切相關(guān)，對圍產(chǎn)期瘤胃菌群的分析可以提供有關(guān)瘤胃菌群的群落結(jié)構(gòu)和代謝特性的詳細信息，進而可以用來改善反芻動物飼養(yǎng)策略，預(yù)防或治療疾病。隨著基因組學(xué)、微生物組學(xué)以及代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們得以對瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)、組成與功能進行更加深入細致的研究分析，但由于瘤胃中可以檢測到的大多數(shù)細菌仍然無法通過分離培養(yǎng)方法獲得，導(dǎo)致目前的研究仍然存在一定局限性，因此對圍產(chǎn)期瘤胃菌群研究與分析仍然需要繼續(xù)探索更加多樣的試驗方法，以期對圍產(chǎn)期瘤胃菌群變化的影響因素及其所蘊含的意義有更加清晰的認識，為奶牛生產(chǎn)及圍產(chǎn)期疾病的防治提供更加有價值的線索與幫助。