以畜禽皰疹病毒為載體的重組基因工程疫苗研究進(jìn)展

張 璐，何慧芬，秦愛(ài)建,2，錢 琨,2,3*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院，江蘇揚(yáng)州 225009)

接種疫苗是預(yù)防和控制畜禽疫病發(fā)生與傳播的最具成本效益的干預(yù)措施，也是獸醫(yī)學(xué)中使用最廣泛的工具。自人類歷史上的第一代疫苗的發(fā)明到今天，疫苗的研發(fā)已經(jīng)歷了數(shù)百年時(shí)間，經(jīng)過(guò)不斷地研發(fā)和改進(jìn)，目前研發(fā)成功的疫苗主要有以下幾種類型[1-2]：①傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗：主要為滅活或減毒病原體或利用清除病原體的亞基如毒素、多糖或蛋白質(zhì)等制成的一類疫苗；②基因工程疫苗：是利用基因工程技術(shù)或化學(xué)技術(shù)合成的一類疫苗，主要包括亞單位疫苗、合成肽疫苗、病毒或細(xì)菌活載體疫苗等；③核酸疫苗：是利用基因工程技術(shù)將編碼某種抗原的外源基因直接導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一類疫苗。隨著對(duì)各種病原微生物的深入了解及生物技術(shù)的高速發(fā)展，基因工程疫苗的開(kāi)發(fā)是新型疫苗的主要方向，其中重組活載體疫苗成為研究的熱點(diǎn)。

1 畜禽皰疹病毒活載體疫苗概述

自1984年將痘病毒開(kāi)發(fā)為疫苗載體以來(lái)，已經(jīng)探索了多種病毒在活載體疫苗中的應(yīng)用。目前全球市場(chǎng)中可見(jiàn)的至少有12種病毒載體疫苗已獲準(zhǔn)用于獸醫(yī)領(lǐng)域[3]，如新城疫病毒(La Sota株)、禽痘病毒、火雞皰疹病毒等。皰疹病毒是一類有囊膜的雙鏈DNA病毒，基因組中普遍存在病毒復(fù)制非必需的基因，這為外源基因的插入提供了得天獨(dú)厚的位點(diǎn)，可以攜帶多個(gè)相同或不同病原的抗原基因，用于制備多價(jià)苗或者多聯(lián)苗。皰疹病毒還具有感染廣泛宿主細(xì)胞和誘導(dǎo)或分散免疫反應(yīng)的潛力，利用皰疹病毒構(gòu)建的活載體疫苗可誘導(dǎo)特異性黏膜免疫，在神經(jīng)細(xì)胞中建立潛伏感染，達(dá)到一次接種，終生免疫的效果。但也存在一定的缺陷，比如在病毒載體上只能插入引起完全保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原，且外源基因在病毒載體中表達(dá)還可能改變其組織嗜性。目前已有多種皰疹病毒用于活載體疫苗的研發(fā)，如偽狂犬病毒、家禽皰疹病毒、牛皰疹病毒等。其中梅里亞公司生產(chǎn)的明星產(chǎn)品威力克(HVT-VP2)疫苗是一種將傳染性法氏囊病病毒中的VP2基因插入到火雞皰疹病毒中構(gòu)建而成的活載體疫苗，能有效保護(hù)傳染性法氏囊病毒和馬立克氏病病毒的攻擊[4]，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。

2 畜禽皰疹病毒活載體疫苗構(gòu)建的主要技術(shù)方法

2.1 同源重組

同源重組是普遍存在于自然界中的生物學(xué)現(xiàn)象，可以雙向交換DNA分子，也可以單向轉(zhuǎn)移DNA分子。研究者們根據(jù)同源重組原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主DNA的缺失、插入和置換突變。利用同源重組法構(gòu)建重組疫苗的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單,可以省去很多的時(shí)間和精力，是目前使用最多的方法。如用偽狂犬病病毒同源重組豬細(xì)小病毒VP2基因[5]。但同源重組效率低,不容易篩選。為了解決這一難題，科學(xué)家們做了多方面嘗試。①選擇合適的病毒活載體。即在插入外源基因后不影響親本病毒的復(fù)制增殖，其次是要具有一些復(fù)制非必需區(qū)或基因間隔序列為外源基因的插入提供靶點(diǎn)；②同源臂的長(zhǎng)度。研究表明，同源臂過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)影響外源基因的重組效率，一般大于1 kb；③外源基因表達(dá)盒的長(zhǎng)度。表達(dá)盒過(guò)長(zhǎng)不容易整合到病毒載體中；④選擇恰當(dāng)?shù)闹亟M病毒篩選方法，可一定程度上相對(duì)提高重組效率。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，研究者們?cè)趥鹘y(tǒng)同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上建立了更加簡(jiǎn)單、快速、高效同源重組技術(shù)，即Red/ET、Cre/loxp和FLP/FRT重組技術(shù)。這些重組系統(tǒng)高效簡(jiǎn)單，不需要任何其他分子的參與，通常與細(xì)菌人工染色體、 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)等聯(lián)合使用。

2.2 細(xì)菌人工染色體

細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)是一種以F質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的細(xì)菌染色體克隆載體。由于BAC的復(fù)制速度特別慢，對(duì)于皰疹病毒而言，構(gòu)建BAC重組毒相對(duì)容易和準(zhǔn)確，在適宜條件下能快速產(chǎn)生新病毒，并且能夠穩(wěn)定遺傳。有研究把鼠巨細(xì)胞病毒(Mouse cytomegalovirus, MCMV)整個(gè)基因組克隆為感染性BAC,這一技術(shù)在多種皰疹病毒中獲得成功[6]。但是BAC的構(gòu)建過(guò)程較復(fù)雜、周期長(zhǎng)，當(dāng)克隆較大基因組時(shí)，基因組易在操作中發(fā)生斷裂而影響病毒拯救，并且可能在病毒基因組中殘留一些細(xì)菌基因組序列，不符合疫苗生產(chǎn)的生物安全要求，因此在利用BAC系統(tǒng)研發(fā)重組疫苗時(shí)，還需進(jìn)一步考慮敲除殘留序列。

2.3 黏粒

黏粒是指一類含有λ噬菌體的cos序列的質(zhì)粒載體，已有大量不同的黏粒載體用于克隆病毒以及細(xì)菌的基因組。該方法操作簡(jiǎn)便、構(gòu)建周期短并易于進(jìn)行改造。但黏粒系統(tǒng)的容量有限，對(duì)于一些較大的基因簇需要分段克隆，兩個(gè)黏粒之間如果存在同源序列會(huì)發(fā)生重組，導(dǎo)致DNA序列的重排或丟失，且含不同重組DNA的菌落生長(zhǎng)速度不一，會(huì)出現(xiàn)外源DNA的比例失調(diào)，包裝效率不穩(wěn)定等現(xiàn)象。針對(duì)此問(wèn)題有人開(kāi)發(fā)了一種新型黏粒即Fosmid，該載體系統(tǒng)穩(wěn)定性好、無(wú)偏向性、拷貝數(shù)可誘導(dǎo)、構(gòu)建周期短以及操作簡(jiǎn)便，最近幾年被廣泛用于基因文庫(kù)構(gòu)建[7]。

2.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，能高效地介導(dǎo)基因定點(diǎn)敲入或敲除,同時(shí)沉默任意數(shù)量基因[8]。CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)主要分為兩個(gè)過(guò)程。首先，Cas9蛋白特異性切割目標(biāo)DNA序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂；其次，在DNA修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)DNA序列的改變。根據(jù)這一原理人工設(shè)計(jì)sgRNA(guide RNA)來(lái)識(shí)別目的基因組序列，并引導(dǎo)Cas9蛋白酶進(jìn)行有效切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂，人工提供修復(fù)模板后可達(dá)到將外源基因敲入病毒基因組的目的。CRISPR/Cas9相比其他方法具有構(gòu)建方便、簡(jiǎn)單快捷及性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)[9]。但同時(shí)也存在諸多問(wèn)題，首先是存在較高的脫靶概率，其次是導(dǎo)入目的基因后存在Cas9酶的殘留，目前還沒(méi)有有效的手段在Cas9-sgRNA奏效后去除Cas9。除此之外，CRISPR修飾位點(diǎn)受到PAM序列和sgRNA的限制，近期還有研究表明應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯還可能會(huì)導(dǎo)致基因突變。

3 畜禽皰疹病毒重組基因工程疫苗的研發(fā)

3.1 偽狂犬病病毒載體

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因組約143 kb,各基因的功能基本確定。研究表明，PRV部分基因的缺失或替換不影響病毒的復(fù)制與傳播，用豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的囊膜糖蛋白E1來(lái)取代PRV基因組中非必需糖蛋白gX，構(gòu)建1株有效的PRV減毒活疫苗。此后大量的PRV基因缺失苗被成功研制，其中Bartha K61和PRV SA215已被商業(yè)化使用。由于這些疫苗安全有效，可用做重組疫苗的載體，目前已經(jīng)確定了PRV基因組中幾個(gè)常用的基因插入位點(diǎn)，如TK、gI、gE、PK和gG 基因等。常見(jiàn)的重組外源病毒包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬流感病毒、日本腦炎病毒、口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒及非洲豬瘟病毒等。此外，還有某些寄生蟲如弓形蟲、血吸蟲等保護(hù)性抗原在PRV中也有所表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，在PRV基因組中不同位點(diǎn)插入相同抗原構(gòu)建的重組病毒的免疫保護(hù)效力有所不同。如在gI/gE、gG/gD位點(diǎn)插入豬瘟病毒(CSFV)E2蛋白，高滴度免疫可使豬完全免受CFSV的攻擊[10]，而在US9位置插入CSFV E2蛋白，未能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)E2蛋白的抗體[11]。此外，在PRV基因組中相同位點(diǎn)插入不同抗原構(gòu)建的重組病毒其免疫保護(hù)效果也有所不同。如在gG位置插入豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)PCV2的中和抗體，而插入Cap蛋白，卻未能檢測(cè)到針對(duì)Cap的抗體。由此可以得出，重組病毒的免疫保護(hù)效果或許與外源基因和插入位點(diǎn)有關(guān)。此外，還有研究表明共表達(dá)細(xì)胞因子和保護(hù)性抗原能增強(qiáng)重組病毒的免疫保護(hù)效果[12]。除了在常見(jiàn)位點(diǎn)TK、gI、gE、PK和gG等插入外源基因能夠產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果外，在UL40/41的非編碼區(qū)插入豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S基因構(gòu)建的重組PRV，免疫斷奶仔豬也能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的抗體[13]。這為PRV活載體疫苗的構(gòu)建提供了新的技術(shù)支持。目前，大多數(shù)表達(dá)外源基因的重組PRV都是同源重組的方式構(gòu)建，這可能與同源重組技術(shù)構(gòu)建簡(jiǎn)單方便且技術(shù)成熟等因素有關(guān)。相反，CRISPR/Cas9這種新興的能高效介導(dǎo)基因定點(diǎn)敲入的方法應(yīng)用較少，直到2018年非洲豬瘟迅速席卷全國(guó)，急需研制有效疫苗預(yù)防和控制該病的發(fā)生與傳播，用CRISPR/Cas9構(gòu)建表達(dá)ASFV CD2v蛋白的重組PRV，免疫后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗CD2v特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，100%保護(hù)小鼠免受毒株P(guān)RV-Fa的攻擊[14]。這為CRISPR/Cas9技術(shù)在PRV重組病毒中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為非洲豬瘟的防控提供了技術(shù)支持，在今后的研究中用CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)插入多個(gè)外源基因可能會(huì)成為PRV重組病毒研究的主要趨勢(shì)。

近年來(lái)大多重組PRV都能誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體或細(xì)胞免疫反應(yīng)，甚至部分重組病毒對(duì)強(qiáng)毒的攻擊有完全保護(hù)作用，但這些重組病毒未得到商業(yè)化應(yīng)用。分析原因可能包括以下幾個(gè)方面[15]：①需優(yōu)化病毒感染和復(fù)制，以生產(chǎn)高效、安全的疫苗，此項(xiàng)工作復(fù)雜繁瑣。②需要對(duì)重組PRV構(gòu)建中摻入的一些非必要基因進(jìn)行敲除，從而使其更適合臨床應(yīng)用。③將現(xiàn)有疫苗轉(zhuǎn)換為重組疫苗的周期較長(zhǎng)，需制定長(zhǎng)期計(jì)劃。④由于臨床試驗(yàn)成本過(guò)高，導(dǎo)致許多對(duì)于重組PRV 的研究尚未推進(jìn)到自然宿主豬中，無(wú)法預(yù)測(cè)評(píng)估一些實(shí)際問(wèn)題。

3.2 馬立克氏病病毒載體

馬立克氏病是由馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的家禽免疫抑制及腫瘤性疫病。目前MDV也是唯一能用疫苗預(yù)防的腫瘤性疾病。其中MDV-1型中的CVI988/Rispens 株和火雞皰疹病毒(Herpes turkey virus,HVT)是目前應(yīng)用最廣泛的疫苗株。由于MDV是細(xì)胞結(jié)合型病毒，主要在細(xì)胞間傳播，能很好的抗母源抗體的干擾，故自1988年起研究人員便開(kāi)始研發(fā)重組MDV疫苗。近年大部分禽類的常見(jiàn)病原體的保護(hù)性抗原在HVT中均有表達(dá)[16]，成功構(gòu)建了HVT二價(jià)苗,此外還有同時(shí)插入兩個(gè)不同外源基因的三價(jià)HVT也被成功構(gòu)建，具有一定的免疫保護(hù)效果[17]。

目前，在HVT中外源基因的插入位點(diǎn)多集中在UL45/46,例如在此位點(diǎn)構(gòu)建多種表達(dá)不同亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA基因的重組疫苗，包括H7N1、H9N2，其免疫保護(hù)效果不盡相同。而在US2位點(diǎn)構(gòu)建的AIV(H5)-重組HVT具有針對(duì)抗原漂移的H5Nx病毒提供交叉保護(hù)和阻止排毒的潛力[18]。以HVT為載體表達(dá)新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因的重組病毒在1992年被首次構(gòu)建，對(duì)于NDV的攻擊具有部分保護(hù)作用。在之后研究中，將NDV F或HN基因插入HVT的不同位點(diǎn)構(gòu)建的重組病毒均有完全保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)Ⅰ型NDV F及Ⅵ型NDV F和HN的重組HVT可提供針對(duì)Ⅶ[19]型和Ⅳ型交叉臨床保護(hù)[20]。表達(dá)傳染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus,IBDV) VP2蛋白的重組HVT，即威力克疫苗，能對(duì)致命IBDV攻擊提供完整持久的保護(hù)，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。此外，同時(shí)表達(dá)IBDV VP2和NDV F的重組HVT被成功構(gòu)建，也得到了商品化應(yīng)用[21]。而在相同位點(diǎn)表達(dá)其他病原的雙價(jià)或多價(jià)重組HVT雖有較好的保護(hù)效果，但未得到商品化應(yīng)用，這可能與表達(dá)的外源基因不同有關(guān)。

隨著MDV強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，HVT的保護(hù)效果受到了限制，相繼的以MDV-1型CVI988/Rispens株、814株以及一些Meq缺失株為載體的重組MDV被成功構(gòu)建[22]。與HVT不同的是，MDV-1型毒株中外源基因的插入位點(diǎn)和構(gòu)建方法較為單一，CVI988/Rispens株插入位點(diǎn)主要集中于IRS-US連接區(qū)和sorf1/sorf2，均由同源重組方法構(gòu)建；814株中的插入位點(diǎn)主要集中在US2位點(diǎn)，主要通過(guò)Fosmid構(gòu)建；Meq缺失株的插入位點(diǎn)幾乎都在Meq區(qū)，主要通過(guò)BAC構(gòu)建。對(duì)這些重組疫苗的免疫保護(hù)效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示大部分重組病毒有一定的保護(hù)作用。

3.3 傳染性喉氣管炎病毒載體

傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)中的gG、gJ、gM 和 gN是病毒的復(fù)制非必需基因，許多基因缺失的重組ILTV被成功構(gòu)建，如缺失UL47、gC、ORF C、TK、UL10和UL49.5、UL50以及UL0，免疫雞后都提供了一定的保護(hù)作用。近年來(lái)構(gòu)建了多種表達(dá)高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同亞型的HA和NA基因的ILTV重組病毒。H5的HA/N1基因插入U(xiǎn)L50基因位點(diǎn),H7亞型的HA基因插入U(xiǎn)L0位點(diǎn)。這些重組ILTV對(duì)ILTV和AIV均有一定的保護(hù)作用，其中ILTV-DeltaUL50IH5V能夠保護(hù)雞免受 H5亞型的不同 HPAIV分離株的侵害[23]。以同源重組或CRISPR/Cas9等方法分別構(gòu)建了3種表達(dá)基因Ⅶ型 NDV F蛋白的重組病毒[24-25]。3種重組病毒保護(hù)效果較好，有望成為二價(jià)疫苗候選株。

3.4 鴨腸炎病毒載體

鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV) 的TK、US1、US10和US2等區(qū)域?yàn)镈EV復(fù)制非必需區(qū)[26]。目前可供插入的位點(diǎn)主要有TK、UL27/26、UL44、US7/8、gE等。已有研究報(bào)道了表達(dá)禽流感病毒、小鵝瘟病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、鴨肝炎病毒及鴨坦布蘇病毒等病毒保護(hù)性抗原的重組DEV被成功構(gòu)建，大部分重組病毒免疫動(dòng)物后有一定的免疫保護(hù)效果，少數(shù)重組病毒未進(jìn)行免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)。在DEV基因組不同位點(diǎn)表達(dá)AIV不同亞型HA基因的重組病毒，均有較好的免疫保護(hù)效果。例如，在DEV疫苗株的US7和US8基因之間插入禽流感病毒H5N1 AIV的HA基因得到的重組毒，能快速且穩(wěn)定的的產(chǎn)生針對(duì)于H5N1 AIV的保護(hù)作用，并且在之后的研究中還發(fā)現(xiàn)rDEV-us78HA對(duì)異源 H5N6和 H5N8 AIV也有保護(hù)作用[27]。在gI、gE、US2位點(diǎn)表達(dá)鵝源H5N1 AIV HA的重組DEV免疫鴨后產(chǎn)生抗 DEV和AIV特異性抗體，能抵抗 DEV病毒的感染[28]。然而在US7-US8基因之間表達(dá)的NDV La Sota 株F蛋白和HN蛋白，只有rDEV-F對(duì)NDV F48E9株感染有100% 的保護(hù)作用，而rDEV-HN無(wú)免疫保護(hù)作用。這表明重組疫苗的免疫保護(hù)效力可能與插入的外源基因有關(guān)。

3.5 牛皰疹病毒1型載體

以牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)為載體的重組病毒研究主要集中在口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)和偽狂犬病病毒(PRV)。目前已有多篇報(bào)道利用牛皰疹病毒1型(BHV-1)表達(dá)FMDV VP1基因[29]。此外，一些報(bào)道指出FMDV的P1-2A/3C的表達(dá)能夠誘導(dǎo)針對(duì)FMDV的保護(hù)性免疫[30]，將P1-2A/3C表達(dá)盒整合到BHV-1基因組中，發(fā)現(xiàn)FMDV 3C蛋白酶的表達(dá)會(huì)干擾BHV-1 的復(fù)制。將PRV糖蛋白gC基因插入到BHV-1的TK基因中，隨后構(gòu)建了表達(dá)PRV的gB、gC、gD、gE基因的rBHV-I。但在該重組體中，gB基因和gD基因不能同時(shí)表達(dá)，因此又構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)PRV糖蛋白gB、gC、gD、gE 和 gI的重組病毒BHV-1/TF17-1，對(duì)PRV攻擊有良好的免疫保護(hù)效果。2002年研究證實(shí)了表達(dá)PRV gB和gC基因的重組BHV-1/TF7-6在小鼠中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)于親本病毒。此外，還有少量以在BHV-1為載體表達(dá)其他病原的重組病毒被成功構(gòu)建。例如，在gE啟動(dòng)子后面表達(dá)牛呼吸道合胞病毒G蛋白的重組體能防止牛呼吸道合胞病毒的感染。在BHV-1 TK啟動(dòng)子控制下表達(dá)牛病毒性腹瀉病毒囊膜蛋白的重組體可作為候選疫苗。將在CAG啟動(dòng)子控制下的隱孢子蟲的p23基因整合到BHV-1的gG基因中，得到的重組毒在兔體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了中和抗體。最新的研究結(jié)果表明大角羊肺炎的病原體的毒力基因插入BHV-1的gC位點(diǎn)構(gòu)建的重組疫苗未能提供免疫保護(hù)作用[31]，但為其他肺炎病原體基因的插入提供了技術(shù)支持。除此之外，國(guó)內(nèi)的學(xué)者還構(gòu)建了表達(dá)兔出血癥病毒、牛副流感病毒3型及牛流行熱病毒抗原基因的重組BHV-1，但均未進(jìn)行免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)。

4 展望

近年來(lái)畜牧業(yè)臨床中密集的疫苗接種，導(dǎo)致病原體變異加速，部分傳統(tǒng)的疫苗已經(jīng)無(wú)法為動(dòng)物提供良好的保護(hù)作用，免疫減負(fù)成為了需要關(guān)注的問(wèn)題。病毒活載體疫苗雖然可以解決部分問(wèn)題，但目前大部分的重組疫苗未得到商業(yè)化應(yīng)用。主要的原因包括外源基因的插入影響載體病毒的復(fù)制和毒力，并且多個(gè)外源基因之間也可能存在相互影響，病毒基因組中殘留一些非必要的序列，影響重組疫苗的安全性，與其他疫苗共免疫時(shí)，不同疫苗之間產(chǎn)生不良的相互作用等。

為了進(jìn)一步提高重組疫苗質(zhì)量，在構(gòu)建病毒活載體重組基因工程疫苗過(guò)程中，幾點(diǎn)影響重組疫苗質(zhì)量的因素必須考慮：①了解載體與免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系有助于病毒載體的開(kāi)發(fā)；②外源基因密碼子的優(yōu)化可提高表達(dá)量；③啟動(dòng)子的選擇影響外源基因的表達(dá)；④與某些細(xì)胞因子共表達(dá)可提高外源基因的免疫效果；⑤不同插入位點(diǎn)影響不同外源基因的表達(dá)量及穩(wěn)定性；⑥聯(lián)合免疫佐劑可增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)?；谶@些現(xiàn)有的結(jié)論，在未來(lái)皰疹病毒載體疫苗或其他病毒載體疫苗的研發(fā)中有望進(jìn)一步優(yōu)化重組疫苗的研發(fā)，從而能更加有效地控制畜禽疫病，提高經(jīng)濟(jì)效益，保護(hù)人和動(dòng)物的健康。