阿魏酸衍生物的合成及其抗膽堿酯酶活性

關 麗，宋旭超，王小庫，趙 寧，李偉澤*，汪 洋

（1西安醫(yī)學院藥學院，西安 710021；2西安醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，西安 710021；3西安市病原微生物與腫瘤免疫重點實驗室，西安 710021）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）作為最常見的老年癡呆類型，目前還沒有特效藥。盡管關于AD 發(fā)病機制有多種學說，但其治療藥物仍以乙酰膽堿酯酶抑制劑（ACEI）為主，但是，由于ACEI 類藥物對肝臟具有毒性，對心血管和胃腸道不良反應，因此，從天然產(chǎn)物中尋找抗AD 新藥是近年來藥學研究的熱點。

在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的膽堿酯酶，即乙酰膽堿酯酶（AChE）和丁酰膽堿酯酶（BuChE）。在相同條件下，AChE的乙酰膽堿水解活性比BuChE 高1 × 1013倍［1］。有數(shù)據(jù)表明，增加對腦BuChE的抑制可能成為AD 治療的重要治療策略。據(jù)報道，BuChE 有一個關鍵作用，它可以部分補償AChE的作用。此外，研究表明平衡抑制AChE 和BuChE 可能有益于治療認知缺陷［2］。

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是一種含酚羥基的苯丙素類天然產(chǎn)物，藥理活性廣泛，具有抗炎、抗氧化、抑制Aβ 聚集等功能［3-5］。利斯的明（rivastigmine）是美國FDA 批準的用于治療AD的藥物，它是N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，其結構中的N-乙基-N-甲基氨基甲酸酯基團為活性官能團區(qū)域［6］。Chen 等［7］在2017 年報道了3 個阿魏酸-利斯的明骨架衍生物，它們表現(xiàn)出了不同程度的抗氧化活性和膽堿酯酶抑制活性。Lan 等［8］在2019 年報道了一個阿魏酸氨基甲酸酯衍生物，靶向膽堿酯酶的同時也可以起到神經(jīng)保護和抗氧化功能，是一種多功能的抗AD化合物。

Figure 1 Structure of ferulic acid(FA)and ristigmine

FA 由于其血腦屏障（BBB）滲透性差和生物利用度低，在治療AD 方面受到了限制。Puris 等［9］應用L 型氨基酸轉運蛋白（LAT1）介導的前藥方法，將FA 遞送到小鼠大腦中，并合成了3 種新穎的利用LAT1 的FA 前藥。結果證明，具有芳香環(huán)的酰胺基前藥可有效結合至LAT1，利用轉運蛋白進行體外細胞攝取，并在小鼠體內進行原位灌注后穿過BBB。

針對AD的藥物在開發(fā)上的主要障礙是幾乎所有的大分子藥物和98%以上的小分子藥物不能穿過BBB［10］。因此，增加脂溶性被認為是提高其血腦屏障通透性的最有效方法。對于化合物的設計考慮增加脂溶性可能有望成為治療AD的潛在藥物。

本課題以FA 為底物，其結構中具有酚羥基和羧基兩個活潑位點，針對這兩個位點進行結構改造設計了一系列阿魏酸衍生物，將氨基甲酸酯基團拼接在FA 酚羥基端，各類苯胺基團拼接在羧基端，這類化合物可能解決了FA 血腦屏障滲透性差和生物利用度低的缺點，并可能提高抗膽堿酯酶活性。

1 合成路線

FA 衍生物的制備如路線1 所示。首先將FA羧基甲酯化以保護羧基，然后將不同的氨基甲酸基團接合在酚羥基端，隨后水解暴露羧基，最終羧基與苯胺縮合形成15個新化合物5a~5o。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

NMR Avance-300MHz核磁共振儀（德國Bruker公司）；ESI-MS 質譜儀（美國Angilent 公司）；RT-6000 全自動酶標儀（深圳雷杜醫(yī)療器械有限公司）。

乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（Bu-ChE）、5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化乙酰膽堿（ATCI）、碘化硫代丁酰膽堿（BTCI）以及陽性藥多奈哌齊（Donepezil）均購自美國Sigma-Aldrich 公司；DMSO（國藥集團化學試劑有限公司）；硅膠GF254薄層預制板（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（上海譜振生物科技有限公司）。其余所有試劑均為市售化學或分析純，一般均不經(jīng)純化處理直接使用。

Scheme 1 Synthesis of FA derivatives

緩沖液A：Tris-HCl 緩沖液；緩沖液B：PBS 緩沖液；現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 化學合成

2.2.1 阿魏酸甲酯的合成[11]（E）-3-（4-羥基-3-乙氧基苯基）丙烯酸甲酯（2）在100 mL 茄形瓶中加入FA 3 g（15.5 mmol），用甲醇30 mL 溶解，緩慢加入濃硫酸1.2 mL（22.5 mmol），加畢，體系升溫至70 ℃反應3 h。反應完畢，減壓濃縮后用10% NaOH 調節(jié)pH 至7，加入乙酸乙酯萃取，用水洗滌，有機相用無水Na2SO4干燥后減壓濃縮得到黃色油狀物3.1 g，產(chǎn)率97%；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.64（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.08（1H，d，J= 8.2 Hz，H-5），7.04（1H，s，H-3），6.93（1H，d，J= 8.0 Hz，H-6），6.31（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），6.07（1H，br.s，OH），3.93（3H，s，OCH3），3.82（3H，s，OCH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：166.5，149.1，147.9，143.5，127.6，122.9，116.8，115.1，111.9，56.1，52.0；ESI-MSm/z：208.21［M+H］+。

2.2.2 阿魏酸甲酯氨基甲酸酯(3a ~ 3c)的合成[12]化合物2（1 g，4.8 mmol）加入適量丙酮溶解后加入相應酰氯和K2CO3，反應體系升溫至60 ℃，攪拌回流7 h，冷卻至室溫后過濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌.濾液減壓濃縮至干后加入乙酸乙酯溶解，用水洗滌，合并有機相，無水Na2SO4干燥后減壓濃縮得到化合物。

（E）-3-（4-（（二甲基氨基甲?；┭趸?3-甲氧基苯基）丙烯酸甲酯（3a） 黃色晶體；產(chǎn)率64.9%；mp：127 ~ 129 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.65（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.26（1H，s，H-3），7.10（1H，d，J= 8.0 Hz，H-5），7.08（1H，d，J= 8.0 Hz，H-6），6.37（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.86（3H，s，OCH3），3.81（3H，s，OCH3），3.12（3H，s，-CH3），3.01（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：166.4，154.4，151.1，143.6，136.5，131.8，124.4，121.9，115.1，111.7，55.8，52.0，37.6；ESI-MSm/z：280.1［M+H］+。

（E）-3-（4-（（乙基（甲基）氨基甲?；┭趸?3-甲氧基苯基）丙烯酸甲酯（3b） 白色固體；產(chǎn)率62.3%；mp：83 ~ 85 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.65（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.11，7.08（3H，m，H-3，5，6），6.38（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.86（3H，s，OCH3），3.81（3H，s，OCH3），3.05（5H，m，-CH2CH3），1.20（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：166.6，154.3，151.5，143.6，136.5，131.8，124.4，121.9，115.1，110.9，55.8，52.0，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：294.1［M+H］+。

（E）-3-（4-（（二乙基氨基甲?；┭趸?3-甲氧基苯基）丙烯酸甲酯（3c） 黃色晶體；產(chǎn)率63.4%；mp：59 ~ 61 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.65（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.11，7.08（3H，d，J= 12 Hz，H-3，5，6），6.37（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.86（3H，s，OCH3），3.81（3H，s，OCH3），3.45（4H，q，-CH2），1.24（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：166.5，154.8，151.5，143.6，136.5，131.8，124.4，121.9，115.1，110.9，55.8，52.1，45.0，12.7；ESI-MSm/z：308.1［M+H］+。

2.2.3 阿魏酸氨基甲酸酯(4a ~ 4c)的合成[13]在THF-MeOH-H2O（15∶5∶5）25 mL的混合溶液中，加入化合物（3a ~ 3c）以及3 倍當量LiOH·H2O，室溫攪拌24 h，減壓去除溶劑后，用水30 mL 稀釋殘渣，再用10%的HCl 調節(jié)pH 至4，用乙酸乙酯萃?。? × 15 mL），將有機層合并，用無水Na2SO4干燥，減壓濃縮得到相應的產(chǎn)物（4a~4c）。

（E）-3-（4-（（二甲基氨基甲?；┭趸?3-甲氧基苯基）丙烯酸（4a） 白色粉末；產(chǎn)率75.5%；mp：201 ~ 202 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.39（1H，s，COOH），7.60（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.46（1H，s，H-3），7.25（1H，d，J= 8.0 Hz，H-5），7.11（1H，d，J= 8.0 Hz，H-6），6.58（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.83（3H，s，OCH3），3.05（3H，s，-CH3），2.91（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：171.5，154.4，151.5，144.9，136.5，131.8，124.4，121.9，116.5，110.9，55.8，37.6；ESI-MSm/z：266.1［M+H］+。

（E）-3-（4-（（乙基（甲基）氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸（4b） 白色固體；產(chǎn)率78%；mp：126 ~ 128 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.41（1H，s，COOH），7.59（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.47（1H，s，H-3），7.25（1H，d，J= 8.0 Hz，H-5），7.11（1H，d，J= 8.0 Hz，H-6），6.59（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.83（3H，s，OCH3），3.01（5H，m，-CH2，CH3），1.19（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：171.5，154.1，151.5，144.9，136.5，131.8，124.4，121.9，116.5，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：280.1［M+H］+。

（E）-3-（4-（（二乙基氨基甲?；┭趸?3-甲氧基苯基）丙烯酸（4c） 白色固體；產(chǎn)率76%；mp：126 ~ 127 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.72（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.13，7.10（3H，d，J=12 Hz，H-3，5，6），6.36（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.87（3H，s，OCH3），3.40（4H，dd，-CH2），1.24（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：171.5，154.8，151.5，144.9，136.5，131.8，124.4，121.9，116.5，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MSm/z：294.1［M+H］+。

2.2.4 阿魏酸氨基甲酸酯苯胺衍生物的合成(5a~5o) 在50 mL茄型瓶中加入化合物（4a~4c）0.2 mol、2-（7-氮雜苯并三氮唑）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（1.2 eq）和N，N-二異丙基乙胺（DIEPA）（2 eq），攪拌15 min 后加入相應苯胺（0.2 mol），室溫下反應2 h，點板檢測反應完畢后，用石油醚-丙酮（105∶30）進行柱色譜分離純化。

（E）-2-甲氧基-4-（3-氧代-3-（苯基氨基）-1-丙烯基）苯基二甲基氨基甲酸酯（5a） 白色固體；產(chǎn)率46.2%；mp：178 ~ 180 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.34（1H，s，H-9），7.65（2H，d，J= 8.0 Hz，H-11，15），7.47（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.32（2H，t，H-12，14），7.09（1H，t，H-13），7.04（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），6.96（1H，d，J= 8.0 Hz，H-3），6.89（1H，s，H-6），6.00（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.66（3H，s，OCH3），3.19（3H，s，-CH3），3.10（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.4，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，128.9，128.0，124.4，121.9，121.6，116.5，110.9，55.8，37.6；ESI-MSm/z：341.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（4-氯苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二甲基氨基甲酸酯（5b） 白色固體；產(chǎn)率60.7%；mp：164 ~ 166 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.52（1H，s，H-9），7.62（2H，d，J=8.0 Hz，H-11，15），7.42（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.28（2H，d，H-12，14），7.04（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），6.93（1H，d，J= 8.0 Hz，H-3），6.84（1H，s，H-6），5.82（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.62（3H，s，OCH3），3.20（3H，s，-CH3），3.11（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.4，151.5，141.7，136.5，135.7，135.3，133.3，129.0，124.4，121.9，121.7，118.8，110.9，55.8，37.6；ESI-MSm/z：375.0［M+H］+。

（E）-2-甲氧基-4-（3-（（（4-硝基苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）苯基二甲基氨基甲酸（5c） 黃色粉末；產(chǎn)率44.8%；mp：168 ~ 169 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.74（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.22（1H，d，J= 8.0 Hz，H-11），8.04（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.83（2H，d，J=8.0 Hz，H-15），7.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-11），7.24（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-4）7.19（1H，s，H-6），7.18（2H，d，J=8.0 Hz，H-3），6.72（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH3），3.15（3H，s，-CH3），3.04（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.4，151.5，143.7，143.5，141.7，136.5，135.3，124.4，124.1，121.9，119.9，118.8，110.9，55.8，37.6；ESI-MSm/z：386.0［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-溴苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二甲基氨基甲酸酯（5d） 白色粉末；產(chǎn)率37.5%；mp：175 ~ 176 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.75（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.04（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），7.25（1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-4）7.19（1H，s，H-6），7.18（2H，d，J= 8.0 Hz，H-3），6.72（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH3），3.14（3H，s，-CH3），3.03（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，154.4，151.5，141.7，136.5，136.0，135.3，131.8，127.9，125.6，124.4，121.9，118.8，117.5，110.9，55.8，37.6；ESI-MSm/z：420.9［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-氟苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二甲基氨基甲酸酯（5e） 白色粉末；產(chǎn)率74.1%；mp：174 ~ 175 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.45（1H，t，H-9），7.97（1H，s，H-11），7.59（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.16（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.12（1H，d，J= 8.0 Hz，H-14），7.07（1H，d，J= 8.0 Hz，H-13），7.05（2H，s，H-3，6），6.99（1H，s，H-4），6.40（1H，d，J=16 Hz，H-8），3.80（3H，s，OCH3），3.15（3H，s，-CH3），3.04（3H，s，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，158.3，154.4，151.5，144.4，141.7，136.5，135.3，129.0，124.4，123.2，121.9，118.8，115.7，110.9，55.8，37.6；ESI-MSm/z：359.1［M+H］+。

（E）-2-甲氧基-4-（3-氧代-3-（苯基氨基）-1-丙烯基）苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5f） 白色油狀；產(chǎn)率64%；1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：8.48（1H，s，H-9），7.65（2H，d，J= 8.0 Hz，H-11，15），7.44（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.32（2H，t，H-12，14），7.08（1H，d，J= 8.0 Hz，H-13），7.04（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），6.94（1H，d，J= 8.0 Hz，H-3），6.85（1H，s，H-6），5.93（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.62（3H，s，OCH3），3.55（2H，q，-CH2），3.12（3H，d，-CH3），1.29（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.1，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，128.9，128.0，124.4，121.9，121.6，118.8，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：355.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-氟苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5g）白色油狀；產(chǎn)率55.6%；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.43（1H，s，H-9），7.92（1H，d，H-11），7.60（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.16（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），7.12（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.07（3H，d，J= 8.0 Hz，H-3，6，14），7.00（1H，d，H-13），6.40（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.80（3H，s，OCH3），3.55（2H，q，-CH2），3.12（3H，d，-CH3），1.25（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，158.3，154.1，151.5，144.4，141.7，136.5，135.3，129.9，129.0，124.4，123.2，121.9，118.8，115.7，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：373.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-溴苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5h）白色粉末；產(chǎn)率77.4%；mp：141 ~ 142 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.75（1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.05（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），7.26（1H，s，H-6，），7.19（2H，s，H-3），6.72（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH3），3.46（2H，q，-CH2），3.15（3H，d，-CH3），1.25（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，154.1，151.5，141.7，136.5，136.0，135.3，131.8，127.9，125.6，124.4，121.9，118.8，117.5，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：434.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-氯苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5i）白色油狀；產(chǎn)率64.2%；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.75（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-14），7.72（1H，d，J=16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），7.26（1H，s，H-4，），7.19（1H，s，H-6），6.53（1H，d，J=16 Hz，H-8），3.89（3H，s，OCH3），3.45（2H，dd，-CH2），3.05（3H，d，-CH3），1.24（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，154.1，151.5，141.7，136.5，135.3，134.7，131.0，130.1，129.0，125.3，124.4，124.2，118.8，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：389.1［M+H］+。

（E）-2-甲氧基-4-（3-（（（4-硝基苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5j）黃色粉末；產(chǎn)率57.1%；mp：77 ~ 79 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.90（1H，s，H-9），8.22（2H，d，J=9.2 Hz，H-12，14），8.04（1H，d，J=16 Hz，H-7），7.84（2H，d，J=9.2 Hz，H-11，15），7.19（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），7.09（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-6），6.97（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-3），6.73（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.90（3H，s，OCH3），3.45（2H，q，-CH2），3.12（3H，t，-CH3），1.28（3H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.1，151.5，143.7，143.5，141.7，136.5，135.3，124.4，124.1，121.9，119.9，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MSm/z：398.1［M+H］+。

（E）-2-甲氧基-4-（3-氧代-3-（苯基氨基）-1-丙烯基）苯基二乙基氨基甲酸酯（5k） 淡黃色固體；產(chǎn)率88%；mp：140 ~ 142 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.41（1H，s，H-9），7.65（2H，d，J=8.0 Hz，H-11，15），7.45（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.32（2H，t，H-12，14），7.08（1H，d，J= 8.0 Hz，H-13），7.05（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），6.97（1H，d，J= 8.0 Hz，H-3），6.86（1H，s，H-6），5.92（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.63（3H，s，OCH3），3.50（4H，q，2 × -CH2），1.30（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.8，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，128.9，128.0，124.4，121.9，121.6，118.8，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MSm/z：369.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-氯苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二乙基氨基甲酸酯（5l） 白色粉末；產(chǎn)率51.9%；mp：124 ~ 125 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.74（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.05（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），7.23（1H，d，J =12.0 Hz，H-4），7.19（1H，s，H-6），6.72（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH3），3.43（4H，q，2 × -CH2），1.24（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，154.8，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，134.7，131.0，129.0，125.3，124.4，124.2，121.9，118.8，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MSm/z：403.1［M+H］+。

（E）-2-甲氧基-4-（3-（（4-硝基苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）苯基二乙基氨基甲酸酯（5m） 黃色粉末；產(chǎn)率42.9%；mp：125 ~ 126 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.74（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.05（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.46（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），7.22（1H，d，J=12 Hz，H-3），7.19（1H，s，H-6），6.72（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH3），3.43（4H，q，2 × -CH2），1.24（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.5，154.8，151.5，143.7，143.5，141.7，136.5，135.3，124.4，124.1，121.9，119.9，118.8，110.9，55.8，45.0，12.7；ESIMSm/z：412.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-溴苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二乙基氨基甲酸酯（5n） 白色固體；產(chǎn)率58.1%；mp：100 ~ 102 ℃；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.75（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.04（1H，d，J= 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-12），7.25（1H，d，H-6，），7.20（2H，d，H-4，13），7.09（1H，d，H-3），6.72（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.90（3H，s，OCH3），3.43（4H，q，2 × -CH2），1.25（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，154.8，151.5，141.7，136.5，136.0，135.3，131.8，127.9，125.6，124.4，118.8，117.5，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MSm/z：448.1［M+H］+。

（E）-4-（3-（（（2-氟苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二乙基氨基甲酸酯（5o） 白色油狀；產(chǎn)率50%；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.43（1H，s，H-9），7.93（1H，s，H-11），7.60（1H，d，J=16 Hz，H-7），7.15（1H，d，J= 8.0 Hz，H-6），7.09（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.07（2H，d，J=8.0 Hz，H-3，14），7.01（1H，s，H-13），6.40（1H，d，J= 16 Hz，H-8），3.81（3H，s，OCH3），3.45（4H，q，2 × -CH2），1.23（6H，t，-CH3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.0，158.3，154.8，151.5，144.4，141.7，136.5，135.3，129.9，129.0，124.4，118.8，115.7，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MSm/z：387.1［M+H］+。

2.3 抗膽堿酯酶活性測試

采用Ellman 法對化合物進行乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶活性測試，基本原理如下：AChE 催化人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿水解生成含巰基的化合物，含巰基化合物可與5-5′-二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反應，導致其二硫鍵斷裂而使無色DTNB 轉變成黃色的5-硫基-2-硝基苯甲酸（TNB）。TNB 在波長412 nm 左右最大吸收，而DTNB 在此處無吸收，因此可通過測定TNB 在412 nm 處的吸收度來計算巰基化合物的量，其含量與AChE的活力在一定范圍內成正比。因此，測定酶反應后于412 nm 處即可測定酶的活力。丁酰膽堿酯酶原理同乙酰膽堿酯酶，底物由碘化硫代乙酰膽堿替換為碘化硫代丁酰膽堿。

乙酰膽堿酯酶抑制活性測試方法如下：將化合物溶解于DMSO 中，配制成初濃度為10 mmol/L的母液，用緩沖液B 稀釋至所需濃度，控制所配制溶液中DMSO 含量低于1%。依次在96 孔板中加入：PBS 120 μL，AChE（0.1 U/mL，緩沖液A 配制）20 μL 和不同濃度的化合物20 μL；37 ℃下孵育6 min，快速加入DTNB 20 μL 和ATCI（緩沖液B 配制）20 μL，37 ℃下孵育30 min。在412 nm 下測定吸收度。

丁酰膽堿酯酶測試方法類似于乙酰膽堿酯酶，依次在96 孔板中加入：PBS 120 μL，BuChE（0.1 U/mL）20 μL 和不同濃度的化合物20 μL；37 ℃下孵育6 min，快速加入DTNB 20 μL 和BTCI（緩沖液B 配制）20 μL，37 ℃下孵育30 min。在412 nm下測定吸收度。

Table 1 Inhibition of FA derivatives 5a-5o on AChE and BuChE inhibitory activity

3 結果與討論

本研究以FA 為原料，先通過甲酯化對羧基進行保護，在酚羥基一側引入3種不同的氨基甲酸酯基團后，水解掉甲基，再在FA的酚羥基處引入脂溶性的苯胺，共設計合成15個FA衍生物5a~5o。

對這15個化合物進行乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶活性測試，5a ~ 5o 表現(xiàn)出不同程度的膽堿酯酶抑制作用。通過表1 可以看出化合物5c、5f、5g、5j、5m 5 個化合物表現(xiàn)出了對乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構效關系研究表明，3 個對硝基取代苯胺化合物5c、5j、5m均表現(xiàn)出較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，化合物5f的苯胺端未被任何雜原子取代，而化合物5g 是對氟取代的苯胺。此外從表1中還可以看出，除化合物5k、5l、5m、5n、5o 以外幾乎所有化合物均表現(xiàn)出對丁酰膽堿酯酶很好的抑制作用，且化合物5c、5d、5e、5f 表現(xiàn)出了遠高于陽性藥多奈哌齊的抑制率，100 μmol/L濃度下抑制率均高于90%。構效關系研究顯示，化合物5k、5l、5m、5n、5o 均為N，N-二乙基取代的FA 衍生物，而其他有活性的化合物均為N，N-二甲基或N-甲基-N-乙基取代的化合物，進一步說明N，N-二乙基取代的FA 衍生物沒有丁酰膽堿酯酶抑制活性。綜上所述，化合物5c、5f、5j、5g 可以作為潛在的乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制劑。

本研究為FA 衍生物的合成提供了理論基礎，有關活性化合物的抗AD機制研究正在進行中。