房水中IL-6、TNF-α和VEGF的變化與糖尿病性黃斑水腫的相關性研究

朱瀾瀾 高自清 戴青

糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)比較多見的表現(xiàn)。DME會使患者的視力下降，最嚴重可導致中心性視力喪失甚至是失明[1]，使其生活質(zhì)量大幅度降低。在DME的發(fā)病機制中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有著十分重要的作用，可導致糖尿病視網(wǎng)膜病變的血管生成和血管通透性增加。因此，針對DME的抗VEGF治療已作為改善DME患者視力的重要手段[2，3]。玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物不僅可以顯著改善DME患者的視力，還能逐漸恢復視網(wǎng)膜生理層的解剖結構。在眾多隨機試驗中，其長期有效性和安全性已得到證實[4-7]。越來越多的證據(jù)表明炎癥也在DR的發(fā)病當中扮演著重要角色[8]。有研究表明，DR患者玻璃體和房水中的白細胞介素(如interleukin-1、IL-6、IL-8)濃度均顯著升高[9-14]。與IL-6和IL-8一樣，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)是一種促炎細胞因子，可以破壞血-視網(wǎng)膜屏障通過損壞視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞的緊密連接，從而參與糖尿病的發(fā)病機制[15]。目前關于房水中IL-6、TNF-α與DME相關性的研究相對不多，本研究主要是分析玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物康柏西普( intravitreal conbercep injection，IVC) 前后DME患者前房水中 IL-6、TNF-α和VEGF濃度的變化，探討IL-6、TNF-α和VEGF與DME發(fā)病的相關性，并研究玻璃體內(nèi)注射康柏西普對血管生成和炎癥細胞因子的影響。

資料與方法

一、研究對象

前瞻性病例研究。本試驗納入蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科2020年7月至2021年7月收治的DME患者40例(40只眼)作為研究對象，所有DME患者均接受0.05ml康柏西普(成都康宏生物科技有限公司)玻璃體腔內(nèi)注藥術，每位患者均符合此次試驗納入標準，在此基礎上充分了解本研究的目的及方法后，均自愿參與本研究并簽署手術知情同意書。其中DME患者男性22例，女性18例，年齡(64.3±10.3)歲，平均病程(11.5±5.3)年，平均血紅蛋白A1c水平(7.9±1.4)%。

納入標準： (1)散瞳后經(jīng)前置鏡查眼底等眼科專項檢查確診為DME，且治療前及隨訪期間眼部檢查資料完整；(2)相干光層析成像術(optical coherence tomography，OCT) 提示黃斑中心凹厚度(central macular thickness，CMT) >250μm；(3)熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA)檢查提示黃斑區(qū)熒光素滲漏；(4)男女不限；(5)有糖尿病史。排除標準：(1)近6個月內(nèi)曾接受過眼科手術，如青光眼手術、視網(wǎng)膜激光光凝術、玻璃體腔內(nèi)注藥術等；(2) 由DR以外的其他眼底疾病如年齡相關性黃斑變性、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、高度近視等引起的黃斑水腫； (3)伴有其他眼部疾病，如青光眼或高眼壓癥以及眼部炎性疾病等； (4)依從性差，不同意進行取樣及房水檢測及隨訪期間眼部檢測資料不全者；(5)全身情況差無法進行手術者。

二、方法

1.術前準備：術前所有DME患者均被告知本研究目的、手術過程中以及可能出現(xiàn)的術后并發(fā)癥等情況，并進行全身及眼部相關檢查，排除惡病質(zhì)及手術禁忌證。術前3 d術眼應用左氧氟沙星滴眼液(參天制藥<中國>有限公司，國藥準字 J20150106，規(guī)格：5 ml∶24.4 mg/支)，4次/d; 術前剪睫毛、沖洗淚道、0.9%氯化鈉注射液15 ml沖洗結膜囊，以預防感染。

2.標本采集及治療方法：在眼科專用無菌手術間手術，患者取仰臥位，用奧布卡因(參天制藥<中國>有限公司，國藥準字J20160094，規(guī)格：20 ml∶80 mg/支)滴眼液點術眼行表面麻醉，消毒，鋪巾，貼膜，放置開瞼器，5%聚維酮碘浸泡結膜囊，予以生理鹽水沖洗結膜囊，將帶有1 ml(0.45×16 mm)注射器針頭于角膜緣內(nèi)1 mm行前房穿刺，采集房水0.1 ml。將房水樣品收集于無菌EP管中，并盡快冷凍，放置在-80 ℃冰箱保存。房水采集后立即抽取康柏西普注射液 0.05 ml( 0.5 mg) ，在顳上方距角膜緣4 mm處，垂直于鞏膜面進針，將藥物緩慢推入玻璃體腔，注射完畢后，濕棉簽按壓30 s，無菌敷料遮蓋患眼。術后予以左氧氟沙星滴眼液滴眼液點眼( 4次/d) 1周局部抗炎治療，預防感染。DME患者一般采用3+PRN 的治療方案，首次行IVC治療，1個月后根據(jù)復查時眼底情況再決定是否治療，若復查時OCT顯示視網(wǎng)膜仍存在黃斑水腫伴 CMT≥250 μm 或視力下降 2 行及以上，則需再行IVC治療，在行IVC之前再次對所有患者的房水進行取樣。本研究納入患者經(jīng)復查后均再次行玻璃體腔藥物注射術。IVC及房水標本的收集均由同一位具有豐富臨床操作經(jīng)驗的高年資醫(yī)生進行。

三、房水因子檢測

應用酶聯(lián)免疫吸附檢測技術，檢測房水樣本中IL-6、VEGF與TNF-α水平，試劑盒及配套試劑均采購自杭州聯(lián)科生物科技公司(MULTI SCIENCES)，所有步驟均嚴格根據(jù)說明書進行操作。

四、眼科檢查

所有DME患者分別于兩次IVC術前進行最佳矯正視力( best corrected visual acuity，BCVA) 和黃斑中心凹厚度(central macular thickness,CMT)檢查。BCVA 采用國際標準視力表檢測，將小數(shù)視力換算為最小分辨角對數(shù)視力( logMAR)形式記錄，以便進行統(tǒng)計分析。CMT采用OCT(科林 OPTOVUE OCT-2000) 測量。隨訪6個月，觀察患者是否發(fā)生并發(fā)癥。

五、統(tǒng)計學分析方法

結 果

一、DME患者IVC術后CMT和BCVA改善情況

首次IVC治療后，DME患者BCVA(0.55±0.34)較術前(0.71±0.30)改善較明顯，平均基線CMT為(479±116)μm，治療后1個月降至(375±84)μm，差異均有統(tǒng)計學意義(t=3.532、4.126，均P<0.05)。

二、DME患者房水因子的變化

DME患者經(jīng)IVC治療后，房水中IL-6和VEGF濃度較均出現(xiàn)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.875、5.614，均P<0.05)。而TNF-α在IVC治療后未見明顯改善，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 40例(40只眼)DME患者治療前后房水細胞因子水平比較

三、術前DME患者房水中IL-6、VEGF濃度與CMT的相關性

術前DME患者房水中 IL-6 和VEGF 濃度均與 CMT 呈正相關(r=0. 652、 0. 847，均P<0. 05)，表明隨著IL-6和VEGF的表達升高，CMT增厚。而術前患者房水中IL-6 與 VEGF濃度亦呈正相關性(r=0.677，P=0.001)。

四、DME患者房水中VEGF與CMT和BCVA的相關性

VEGF水平的降低與第1次IVC治療1個月后CMT的降低和BCVA的改善有關。VEGF水平與CMT呈顯著正相關(r=0.531，P=0.016)。VEGF水平與BCVA無相關性(r=0.208，P=0.197)。CMT水平與BCVA無相關性(r=0.054，P=0.742)。

五、典型病例

患者男性，67歲。診斷為DME，患者BCVA、CMT和VEGF濃度術前分別為1.10、702μm和487.24 pg/ml，術后分別為0.90、384 μm和268.52 pg/ml。見圖1～2。

圖1 首次IVC術前OCT檢查所見

圖2 第2次IVC術前OCT檢查所見

六、患者術后并發(fā)癥情況

隨訪期間，患者術后出現(xiàn)結膜下出血3例(3只眼)，未予以處理，自行吸收，均未出現(xiàn)高眼壓、前房炎癥反應、角膜水腫等并發(fā)癥及全身不適。

討 論

近年來，抗VEGF藥物在世界范圍內(nèi)用于治療DME的研究越來越多，這些藥物已成為DME的一線治療方法[5]。目前有許多抗VEGF藥物，如貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普和康柏西普，而這些藥物在治療DME的能力方面顯示出一些細微的差異?？蛋匚髌帐且环N完全人源化的可溶性VEGF受體(VEGFR)蛋白，其由VEGFR-1的胞外區(qū)-2和VEGFR-2的胞外區(qū)-3和4與人免疫球蛋白G1的Fc部分結合組成。在臨床前試驗中，相比于貝伐單抗、雷珠單抗和阿柏西普，在結合VEGF的能力方面康柏西普更占優(yōu)勢?？蛋匚髌諏IGF的親和力也很高，而PIGF在增加血管通透性、促進新生血管成熟和增強免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用[16]。胎盤生長因子(placenta grouth factor,PlGF)是一種促血管生成因子，也是VEGF家族的成員，它可以作為VEGFR-1的特異性配體來調(diào)節(jié)炎癥反應，通過刺激組織因子的產(chǎn)生和增強單核細胞/巨噬細胞的趨化性[17]。在與VEGFR-1結合后，PlGF還可以通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴性途徑來增強單核細胞的表達從而產(chǎn)生促炎因子[18]，表明它可能對炎癥反應有直接影響?？蛋匚髌胀ㄟ^與PIGF兩側(cè)的緊密結合，阻止它與其他分子相互作用，進而控制眼內(nèi)的炎癥發(fā)展。在本研究發(fā)現(xiàn)，DME患者IVC術后CMT與BCVA較治療前均明顯改善，表明康柏西普可以顯著提高糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視力和減輕黃斑水腫，這與之前的臨床研究一致[6]。

眾多研究表明，DME是由炎癥細胞因子和VEGF介導的，它們的作用是相互關聯(lián)的[19，20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DME患者行首次康柏西普治療后房水中IL-6、和VEGF水平均顯著降低。IL-6是一種功能廣泛的多效性細胞因子，不僅能夠誘導分化B 淋巴細胞、T 淋巴細胞，參與炎癥發(fā)生，還能促進新生血管形成[21]。我們還發(fā)現(xiàn)，IL-6濃度與 CMT 呈正相關，這表明DME患者在視網(wǎng)膜缺血、缺氧的情況下會增強眼內(nèi)液中IL-6 表達，進一步加重黃斑水腫。VEGF是一種特異性很高的促血管內(nèi)皮生長因子，在它的作用下能使血管通透性增加，并與新生血管有關[22，23]。大量的臨床研究表明，抗VEGF治療改善了DME[24-26]。建議使用抗VEGF藥物作為治療DME的一線藥物[27]。我們的結果表明，炎癥因子和VEGF在DME的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，這些結果與以前的研究結果一致[28]。

TNF-α是一種來源于宿主的誘導腫瘤壞死的因子，它是對內(nèi)毒素的反應而產(chǎn)生的，其能調(diào)節(jié)多種生物學功能，紊亂的TNF-α信號與多種疾病有關。雖然TNF-α主要是由激活的巨噬細胞產(chǎn)生的，但它在多種細胞中都有表達[29]。康柏西普與PIGF有較強的親和力，而PIGF在炎癥發(fā)展中能夠發(fā)揮積極作用，因此在我們的預期結果中，在IVC術后TNF-α濃度會發(fā)生一定程度的下降。然而，這次研究發(fā)現(xiàn)，在IVC術后DME患者房水中TNF-α水平基本無明顯改變?；谶@一結果，我們推測一定濃度的康柏西普可以使TNF-α含量降低，在IVC術后1個月期間，藥物濃度在眼內(nèi)逐漸降低后，對TNF-α基本沒有影響。這一發(fā)現(xiàn)表明，雖然IVC治療DME患者有相當大的益處，但康柏西普對炎癥介質(zhì)的影響似乎有限。因此，綜合治療似乎是合理的，以提高治療效果。

我們還發(fā)現(xiàn)DME患者IL-6與VEGF的基線水平成正相關，這與之前的研究一致[9]。然而，我們沒有觀察到DME患者房水中VEGF與TNF-α的基線水平之間的相關性。因此，DME中VEGF水平與炎癥因子的關系有待進一步研究。這些發(fā)現(xiàn)提示進一步研究炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子和細胞因子在DME中的關系具有重要意義，這些因素可能有助于更好地了解和治療DME。這項研究的另一個發(fā)現(xiàn)是，在DME患者接受第一次IVC治療1個月后，VEGF水平的下降與CMT的下降有關。IVC治療后CMT和VEGF水平直接相關的證據(jù)突出了OCT參數(shù)對指導VEGF抑制治療和再治療方案的價值。

綜上所述，IL-6和VEGF濃度的變化與DME的發(fā)生發(fā)展密切相關，玻璃體腔內(nèi)注射康柏西普后可使IL-6和VEGF的表達降低，CMT變薄，黃斑區(qū)水腫減輕，視力得到改善。