tRNA衍生片段的鑒定及對(duì)靶分子的調(diào)節(jié)機(jī)制

黃炯杰， 陳樂(lè)意， 廖 奇

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系, 浙江省病理生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江，寧波 315211)

tRNA是一類(lèi)具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸功能的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，成熟的tRNA具有三環(huán)四莖的結(jié)構(gòu)：D環(huán)、反密碼子環(huán)和TψC環(huán)，D莖、反密碼子莖、TψC莖和接受氨基酸莖[1]。近年來(lái)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)：在氧化、饑餓和應(yīng)激等特殊條件下，細(xì)胞或組織中特定的核酸酶例如Dicer、Rnase A超家族中的血管生成素(angiopoietin，ANG)、核糖核酸酶5等會(huì)在前體或成熟tRNA的環(huán)上進(jìn)行切割，產(chǎn)生特定的小片段RNA，這些RNA被稱(chēng)為tRNA衍生小分子(tRNA-derived small RNA，tsRNAs)[2-4]。

tsRNAs根據(jù)切割位點(diǎn)的不同可分為tiRNA(tRNA-derived stress-induced RNA，tiRNA)和tRF(tRNA-derived fragment，tRF)[5,6]。tiRNA是在應(yīng)激條件下由血管生成素在tRNA反密碼子環(huán)內(nèi)或環(huán)附近切割而產(chǎn)生的一類(lèi)RNA[7]，可分為5′tiRNA(約30～35nt)和3′tiRNA(約40～50 nt)。前者來(lái)源于成熟tRNA的5′端至反密碼子環(huán)，后者來(lái)源于反密碼子環(huán)末端至成熟tRNA的3′端。tiRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，但在人的血液循環(huán)系統(tǒng)中也可被檢測(cè)到，因此，tiRNA可以作為疾病的生物標(biāo)志物。

tRF是由特異性核酸酶例如Dicer、血管生成素等在D環(huán)、TψC環(huán)等或環(huán)附近切割產(chǎn)生，也可通過(guò)自身消化裂解產(chǎn)生，長(zhǎng)度通常為14～32 nt。tRF根據(jù)切割位點(diǎn)的不同可分為1-tRF、3-tRF、5-tRF和i-tRF(尚未明確切割位點(diǎn))。1-tRF來(lái)源于前體tRNA的3′末端序列，其3′端具有多聚尿苷酸(ploy-U)。3-tRF由Dicer、血管生成素等核酸酶在成熟tRNA的TψC環(huán)或環(huán)附近切割產(chǎn)生，長(zhǎng)度約為13～22 nt，通常包括1個(gè)CCA的末端序列。3-tRF根據(jù)切割位點(diǎn)的不同又可分為tRF-3a(3′端至TψC環(huán)前)和tRF-3b(TψC環(huán)內(nèi)裂解)[8]。5-tRF在D環(huán)或環(huán)附近裂解產(chǎn)生，長(zhǎng)度約為14～30 nt，以腺嘌呤(A)作為尾巴。5-tRF根據(jù)切割位點(diǎn)的不同，同樣也可以分為tRF-5a(5′端至D環(huán)前；14～16 nt)、tRF-5b(D環(huán)后剪切；22～24 nt)和tRF-5c(反密碼子前剪切；28～30 nt)[8,9]。而i-tRF是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新的tRF，來(lái)源于成熟tRNA內(nèi)部區(qū)域，因此不能根據(jù)以上方法進(jìn)行劃分[10,11]，其中2-tRF是一種只包含反密碼子環(huán)的亞型，一般在缺氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生。除2-tRF以外，還有一種源自前體tRNA的新tRF。據(jù)報(bào)道，它是由于tRNA剪接缺陷產(chǎn)生的，可能與神經(jīng)元的丟失有關(guān)[12]。在以上4種tRF中，5-tRF存在于細(xì)胞核，1-tRF和3-tRF存在于細(xì)胞質(zhì)，i-tRF尚不明確，然而這些tRF的定位仍然存在爭(zhēng)議。Table 1列出了各類(lèi)tsRNAs的特點(diǎn)。

Table 1 Classification and structural characteristics of tsRNA

目前，通過(guò)RNA高通量測(cè)序分析和定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)可對(duì)外周血的tRF進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證。隨著高通量測(cè)序和芯片等技術(shù)的發(fā)展，相應(yīng)的鑒定手段和工具也不斷涌現(xiàn)，為tRF的深入研究提供了一定的技術(shù)支持，讓越來(lái)越多的tRF被發(fā)現(xiàn)并深入研究。據(jù)報(bào)道，tRF具有多種生物學(xué)功能例如調(diào)節(jié)翻譯水平、調(diào)控基因表達(dá)和抑制細(xì)胞凋亡等，并可作為腫瘤等疾病的生物標(biāo)志物[13,14]。若對(duì)tRF的鑒定方法和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)作進(jìn)一步整理和歸納，將有利于日后開(kāi)展對(duì)tRF的相關(guān)檢測(cè)與研究，因此本文就關(guān)于tRF的鑒定方法、數(shù)據(jù)庫(kù)、對(duì)靶分子的調(diào)節(jié)機(jī)制及其與人類(lèi)疾病的關(guān)系作一綜述。

1 tRNA衍生片段的鑒定

為了滿足對(duì)tRF深入研究的要求，相關(guān)的鑒定方法和tRF數(shù)據(jù)庫(kù)是必要的，他們也可以為開(kāi)發(fā)鑒定tRF的軟件提供一定的理論基礎(chǔ)。目前，tRF的大規(guī)模鑒定主要基于已有的tRNA數(shù)據(jù)庫(kù)和小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，即將所測(cè)的小RNA測(cè)序序列與已知tRF的序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定tRF的方法[15]。該方法準(zhǔn)確性雖有待提高，但為tRF的研究提供了重要的線索。

由于tRF和miRNA的長(zhǎng)度相當(dāng)，研究人員早期主要采用類(lèi)似鑒定miRNA的方法，即利用小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)tRNA進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，通過(guò)序列比對(duì)鑒定可能的tRF。早在2015年就出現(xiàn)2種基于測(cè)序序列和tRNA序列鑒定tRF的方法。1種是由Telonis等人提出的“完全匹配模式”，即將測(cè)序所得read序列(3′末端的3個(gè)核苷酸置換為CCA)與已知tRNA序列以完全匹配的方式進(jìn)行比對(duì)，目的是為了避免由于同一反密碼子tRNA的各個(gè)拷貝之間的序列相似性和不同密碼子翻譯相同氨基酸所造成的tRF來(lái)源的錯(cuò)誤，以減少假陽(yáng)性。他們以此確定了除5-tRF、3-tRF、1-tRF以外的第四類(lèi)tRF：i-tRF[16]。另一種是由Selitsky和Sethupathy開(kāi)發(fā)的tDRmapper，將篩選后的測(cè)序所得read序列(Phred+33質(zhì)量分?jǐn)?shù)在28以上；長(zhǎng)度在14～40 nt；能在FASTQ文件中出現(xiàn)至少100次)與前體或成熟tRNA進(jìn)行比對(duì)、鑒定[16,17]。此外，他們采用“錯(cuò)誤型”層次比對(duì)方案來(lái)控制由化學(xué)修飾導(dǎo)致的錯(cuò)配[17]。每一步，tDRmapper都將上一步未匹配的序列作為輸入，將其與前體或成熟tRNA進(jìn)行比對(duì)(依次為1個(gè)堿基錯(cuò)配、1個(gè)堿基刪除、2個(gè)堿基錯(cuò)配、2個(gè)堿基刪除和3個(gè)堿基刪除)，然后每一步所發(fā)現(xiàn)的可以匹配到tRNA的序列將被收集、注釋為候選的tRF。

這兩者鑒定方法最大的區(qū)別在于：是否以“完全匹配”作為標(biāo)準(zhǔn)，將測(cè)序所得的read序列在參考基因組中進(jìn)行比對(duì)。tDRmapper考慮到基因組中tRNA基因標(biāo)注的不完整性和計(jì)算能力不足等問(wèn)題，將完全匹配區(qū)域以外或非tRNA來(lái)源的序列也當(dāng)作tRF或tiRNA，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性率較高；而Telonis等人由于采取完全匹配的模式，盡管假陽(yáng)性率較低，但可能會(huì)漏掉一些潛在的tRF[16,17]。因此，tDRmapper是以增加假陽(yáng)性為代價(jià)識(shí)別更多潛在的tRF；而Telonis等人的方法則以完全匹配的方式來(lái)確保tRF鑒定的準(zhǔn)確性。

總結(jié)以上兩種方法，目前出現(xiàn)1種基于“Telonis”和“tDRmapper”的鑒定方法——tRF2Cancer，一個(gè)基于小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定tRF，并評(píng)估其在癌癥中表達(dá)水平的網(wǎng)上服務(wù)[18]。tRF2Cancer由tRFfinder(基于小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)的tRF鑒定工具)、tRFinCancer(提供tRF在不同癌癥類(lèi)型中的表達(dá)水平)和tRFBrowser(tRF的起源和化學(xué)修飾情況)組成。其鑒定tRF的流程如下：(1)提取前體tRNA基因中的tRNA基因和tRNA基因3′端上、下游100 bp的序列；(2)去除成熟tRNA序列的內(nèi)含子，并在3′末端添加CCA序列；(3)利用bowtie比對(duì)工具將測(cè)序所得的read序列與人類(lèi)基因組進(jìn)行比對(duì)，去除未匹配的序列；(4)將上一步留下的序列與已知人類(lèi)轉(zhuǎn)錄本序列例如mRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、microRNA和重復(fù)序列進(jìn)行比對(duì)，去除完全匹配的序列；(5)繼續(xù)將上一步剩下未匹配的序列與(1)和(2)獲得的前體tRNA和成熟tRNA序列進(jìn)行比對(duì)，只有與前體tRNA轉(zhuǎn)錄本同源的序列才被認(rèn)為是tRF；(6)最后，利用tRFfinder工具根據(jù)位點(diǎn)、長(zhǎng)度和表達(dá)豐度進(jìn)一步鑒定可能的tRF。tRFfinder能較為準(zhǔn)確地識(shí)別tRF和區(qū)分降解片段，在完全匹配和完全否定之間取得了較好的平衡。但是對(duì)于某些發(fā)生了化學(xué)修飾的tRNA，tRFfinder也無(wú)法檢測(cè)，這也是它的一個(gè)局限。

另外，SPORTS1.0是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的另一種注釋和分析tRF的生物信息學(xué)工具[19]。主要包括4個(gè)步驟：預(yù)處理，序列比對(duì)，注釋輸出和注釋匯總。即(1)預(yù)處理小RNA測(cè)序序列：去除接頭序列，丟棄長(zhǎng)度超過(guò)定義范圍和那些不帶ATUCG堿基的序列。(2)利用Bowtie比對(duì)工具將過(guò)濾所得的read序列與參考基因組和已知數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase、rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、GtRNAdb、piRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、Ensembl、Rfam等)的RNA序列進(jìn)行比對(duì)。(3)根據(jù)比對(duì)結(jié)果獲得與miRNA、rRNA、piRNA和tRF等相匹配的序列，并基于自編的程序識(shí)別tsRNAs的位置(5′末端、3′末端或3′CCA端)和計(jì)算表達(dá)水平。(4)對(duì)識(shí)別的tsRNAs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，例如長(zhǎng)度分布和錯(cuò)配情況等。SPORTS 1.0可以分析68個(gè)物種的sRNA-seq數(shù)據(jù)，提供了一個(gè)較全面的sRNA圖譜，還可以顯示tsRNA和sRNA的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，為研究奠定了很好的基礎(chǔ)。此外，還有Pagès[20]等人開(kāi)發(fā)的SeRPeNT[20]，盡管是為小非編碼RNA而設(shè)計(jì)的鑒定流程，但也同樣適用于tiRNA和tRF的鑒定。Table 2主要展示了不同tRF鑒定工具的異同點(diǎn)。

Table 2 The features of tDRmapper, tRF2Cancer, SeRPeNT, SPORTS1.0 and tRFdb

Table 3 The databases of tiRNA & tRF

目前的tRF鑒定工具主要是將測(cè)序序列與已知tRNA序列進(jìn)行比對(duì)。此外，在全基因組范圍內(nèi)從頭鑒定tRF的方法也已證明具有一定的潛力，未來(lái)可能需要結(jié)合序列、結(jié)構(gòu)和功能等多方面特征，建立新的tRF鑒定策略和方法，以提高tRF鑒定的準(zhǔn)確度。這些被鑒定的tRF將被整合到一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，用來(lái)分析其內(nèi)在的調(diào)節(jié)機(jī)制和與人類(lèi)疾病的關(guān)系。這些數(shù)據(jù)庫(kù)的出現(xiàn)也方便了研究人員查詢(xún)相關(guān)tRF。

2 tRNA衍生片段數(shù)據(jù)庫(kù)

隨著鑒定水平的提升和被鑒定的tRF量的增加，整合了tRF序列信息、表達(dá)水平和疾病關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)越來(lái)越多。目前常用的tRF數(shù)據(jù)庫(kù)有(1)由美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院研發(fā)的tRFdb[21]：包含8個(gè)物種的tRF信息；(2)由印度國(guó)家植物基因組研究所開(kāi)發(fā)的PtRFdb[22]：收錄植物中tRF的相關(guān)信息；(3)由意大利卡塔尼亞大學(xué)建立的tRFexplorer[23]：收錄NCI-60數(shù)據(jù)庫(kù)中每種細(xì)胞系以及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中每種癌癥類(lèi)型鑒定的tRF及其表達(dá)譜；(4)由美國(guó)杰斐遜大學(xué)維護(hù)的MINTbase[24]：收錄細(xì)胞核、線粒體中的tRF及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中每種癌癥類(lèi)型的tRF信息，；(5)由中國(guó)中山大學(xué)研發(fā)的tRF2Cancer[18]：包括TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中已識(shí)別的tRF及其在癌癥的表達(dá)信息。另外還有一些tRF數(shù)據(jù)庫(kù)也較為常用，例如tRF在癌癥中異常表達(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù)OncotRF[25]；前列腺癌tRF數(shù)據(jù)庫(kù)Olvedy[26]；tRF靶標(biāo)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)tRFtarget[27]等。下面主要介紹tRFdb、MINTbase、tRF2Cancer、OncotRF和tRFtarget這五種數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.1 tRFdb

tRFdb是第一個(gè)總結(jié)有關(guān)tRF和其他相關(guān)tRNA片段的數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.bioch.virginia.edu/trfdb/)[21]。該數(shù)據(jù)庫(kù)記錄了從細(xì)菌到人類(lèi)8個(gè)物種的tRF信息，并且是第一個(gè)對(duì)tRF進(jìn)行統(tǒng)一命名和賦予ID的數(shù)據(jù)庫(kù)，展示了每個(gè)tRNA序列上所測(cè)得的read分布情況，方便研究人員對(duì)tRF進(jìn)行鑒定。這些物種分別為渾球紅細(xì)菌(R.sphaeroides)，裂殖酵母(S.pombe)，果蠅(D.melanogaster)，秀麗線蟲(chóng)(C.elegans)，非洲爪蟾(Xenopus)，斑馬魚(yú)(zebrafish)，鼠(mouse)和人類(lèi)(human)。但是該數(shù)據(jù)庫(kù)只包含了5-tRF、3-tRF和1-tRF這3種tRF類(lèi)型，不包含最近發(fā)現(xiàn)的i-tRF或其他tRNA衍生片段信息，并且由于該數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)都是基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，因此有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 tRF2Cancer

tRF2Cancer由tRFfinder、tRFinCancer和tRFBrowser三個(gè)部分組成(http://rna.sysu.edu.cn/tRFfinder/)[18]。tRFfinder是基于癌癥小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)tRF進(jìn)行鑒定和表達(dá)分析的網(wǎng)上服務(wù)；tRFinCancer主要記錄癌癥tRF相關(guān)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)；而tRFBrowser則是用于顯示tRF來(lái)源和化學(xué)修飾位點(diǎn)的工具。

tRF2Cancer數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了基于32種人類(lèi)癌癥的小RNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)而鑒定的tRF信息，包括5-tRF、3-tRF、1-tRF和tRF-novel。研究人員可以使用tRFfinder來(lái)識(shí)別tRF，檢測(cè)其在癌癥中的表達(dá)水平，借此來(lái)鑒定癌癥相關(guān)的tRF，以發(fā)現(xiàn)癌癥新的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

2.3 MINTbase

MINTbase是一個(gè)收錄了來(lái)源于人體組織細(xì)胞中線粒體和細(xì)胞核來(lái)源的tRF數(shù)據(jù)庫(kù)(http://highcharts.com)[24,28]。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含3種類(lèi)型的tRF(5-tRF、3-tRF、i-tRF)和2種類(lèi)型的tiRNA(5′-tiRNA、3′-tiRNA)，相比于tRFdb和tRF2Cancer，MINTbase數(shù)據(jù)量更多，在算法方面有更好的敏感性和特異性，目前已更新到2.0版本。

在MINTbase數(shù)據(jù)庫(kù)中，用戶(hù)可以采用多種方法檢索tRF，例如輸入tRF類(lèi)型、名稱(chēng)、序列等，較為靈活、方便。MINTbase數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)于tRF信息主要有以下幾方面：(1)基本信息：tRF序列、tRF可能的基因組來(lái)源及其來(lái)源tRNA的相關(guān)特征，例如tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)密碼子等；(2)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及比對(duì)情況：tRF在tRNA結(jié)構(gòu)上的分布情況、與成熟tRNA的比對(duì)信息；(3)tRF在不同組織和疾病等的表達(dá)情況。同時(shí)MINTbase還可以接受研究人員上傳tRF信息，實(shí)時(shí)更新，是一個(gè)“活”的數(shù)據(jù)庫(kù)。但與tRFdb一樣，所有的記錄都來(lái)源于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，數(shù)據(jù)可信度有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4 OncotRF

OncotRF是近年來(lái)構(gòu)建的關(guān)于tRF的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.zju.edu.cn/OncotRF)[25]。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含4種tRF類(lèi)型(3-tRF、5-tRF、i-tRF、3′U-tRFs)和2種tiRNA(5′-tRNA、3′-tiRNA)。以往的數(shù)據(jù)庫(kù)不是側(cè)重于從小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別tRF，就是只包含tRF在不同癌癥類(lèi)型中的表達(dá)情況，而OncotRF數(shù)據(jù)庫(kù)包含了tRF的異常表達(dá)、潛在功能、與基因的共表達(dá)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、與癌癥臨床特征的關(guān)聯(lián)性等信息，是較為實(shí)用的數(shù)據(jù)庫(kù)。OncotRF數(shù)據(jù)庫(kù)分析了11 211個(gè)小RNA測(cè)序樣本，8 776個(gè)RNA測(cè)序樣本，以及TCGA的臨床病理注釋數(shù)據(jù)，得到6 966個(gè)來(lái)自核和線粒體tRNAs的tRF，包括992個(gè)5-tRF、799個(gè)3-tRF、271個(gè)3′U-tRF和4 933個(gè)i-tRF。在OncotRF數(shù)據(jù)庫(kù)中，用戶(hù)可以輸入想要查詢(xún)的tRF ID、類(lèi)型、序列等進(jìn)行檢索，從而獲得tRF的相關(guān)信息，例如ID、tRF類(lèi)型、來(lái)源tRNAs、基因組位點(diǎn)、tRF長(zhǎng)度、序列及在癌癥中的表達(dá)情況等。

2.5 tRFtarget

tRFtarget是第一個(gè)關(guān)于tRF靶標(biāo)預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)(http://trftarget.net)[29]。該數(shù)據(jù)庫(kù)記錄了8個(gè)物種的tRF，這些物種包括人類(lèi)(human),鼠(mouse),果蠅(Drosophila)，秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)，非洲爪蟾(Xenopustropicalis)和斑馬魚(yú)(Zebrafish)，并用2個(gè)最新的預(yù)測(cè)工具RNAhybrid和IntaRNA來(lái)預(yù)測(cè)tRF與mRNA轉(zhuǎn)錄本之間的相互作用，以及tRF在靶RNA上的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合區(qū)域和結(jié)合穩(wěn)定性等信息。該數(shù)據(jù)庫(kù)為研究tRF的分子功能和調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步提供了有力的線索。

2.6 各數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)比以上幾種數(shù)據(jù)庫(kù)，tRFdb和MINTbase數(shù)據(jù)庫(kù)幾乎包含了所有已知的tRF記錄，而MINTbase在tRF數(shù)據(jù)方面會(huì)更加全面具體，并且是一個(gè)“活”的數(shù)據(jù)庫(kù)，但這2種數(shù)據(jù)庫(kù)在腫瘤tRF方面的信息相對(duì)較少。在疾病譜方面，tRF2Cancer提供了不同腫瘤類(lèi)型中tRF的表達(dá)水平，而OncotRF則包含tRF在癌癥中的異常表達(dá)情況，更加偏向于臨床應(yīng)用。另外，tRFtarget是一個(gè)偏向于基礎(chǔ)學(xué)術(shù)研究的數(shù)據(jù)庫(kù)，主要為研究人員對(duì)tRF的生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)作用機(jī)制研究提供可能的線索或依據(jù)，因此這幾種數(shù)據(jù)庫(kù)都各有優(yōu)缺點(diǎn)?；谟?jì)算機(jī)預(yù)測(cè)算法在全基因組范圍內(nèi)鑒定tRF需要更加完美的數(shù)據(jù)庫(kù)支持，而數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)量大小及準(zhǔn)確性將會(huì)影響tRF鑒定的速度及精度。因此，我們迫切需要對(duì)tRF數(shù)據(jù)庫(kù)作進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和完善，以更好地研究tRF。Table 3展示了目前 tiRNA&tRF主要數(shù)據(jù)庫(kù)的重要特征。

3 tRNA衍生片段和tRNA應(yīng)激誘導(dǎo)RNA對(duì)靶分子的調(diào)節(jié)機(jī)制

有了上述tRF鑒定方法和數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)之后，研究人員系統(tǒng)地開(kāi)展了對(duì)tRF的研究，對(duì)tRF與RNA、DNA及蛋白質(zhì)等相關(guān)靶分子的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了深入挖掘，意在揭示其內(nèi)在的生物學(xué)功能。根據(jù)目前的研究顯示，tRF具有調(diào)節(jié)RNA穩(wěn)定性和基因表達(dá)，參與眾多生物過(guò)程，例如細(xì)胞周期與凋亡等功能，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。下面主要介紹tRF對(duì)相關(guān)靶分子的調(diào)節(jié)機(jī)制。

3.1 與mRNA的相互作用

有研究提到tRF與Ago蛋白可形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，結(jié)合到mRNA上，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性從而影響翻譯水平[30]。事實(shí)上，tiRNA與tRF似乎可以不依賴(lài)Ago蛋白，直接或間接與mRNA相互作用來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能。有研究表明，tRNA-Ala和tRNA-Cys來(lái)源的5′-tiRNA可以組裝成分子間RNAG四聯(lián)體(RG4)，取代mRNA帽上的翻譯起始復(fù)合物eIF4G/eIF4A，從而抑制mRNA的翻譯(Fig.1A)[31,32]。但是這類(lèi)特定的5′-tiRNA都有末端寡G序列(TOG)，對(duì)于無(wú)該序列的5-tiRNA是否具有這樣的功能仍有待研究。而特異性的5-tRF也會(huì)和5′-tiRNA一樣，組裝成RG4結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合真核起始因子4 G(eIF4G)和4A(eIF4A)，直接影響蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程[33,34]。

與上述調(diào)節(jié)方式不同，tRF可以與靶mRNA的編碼區(qū)和非編碼3′UTR區(qū)結(jié)合，通過(guò)改變tRF的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)翻譯速率(Fig.1B)。根據(jù)Kim等人的報(bào)道，來(lái)源于Leu-CAGtRNA的3-tRF可以與核糖體蛋白PRS28和RPS15對(duì)應(yīng)的mRNA結(jié)合[35]，通過(guò)改變RPS28的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)其翻譯速率[36]。但是，tRF是否可以和一般的mRNA結(jié)合以增強(qiáng)翻譯速率仍有待進(jìn)一步研究。此外，一種名為5′-tiRNA-Glu的tiRNA可以作為向?qū)NA，誘導(dǎo)tRNaseZL來(lái)裂解靶mRNA，例如PPM1F mRNA[37,38]，從而抑制相關(guān)細(xì)胞的凋亡。

在卵巢癌和乳腺癌中，Zhou等人發(fā)現(xiàn)，tRF-5-Glu可以直接靶向影響乳腺癌抗雌激素3(BCAR3)的mRNA，干擾其在卵巢癌中的表達(dá)水平，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[39]。而Mo等人發(fā)現(xiàn)，5′-tiRNA-Val過(guò)表達(dá)可以靶向影響FZD3基因，從而抑制FZD3/Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷徙[40]。

3.2 與ncRNA的相互作用

研究表明，在特定壓力條件下產(chǎn)生的tRF可以和siRNA、前體dsRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Dicer和Ago2蛋白，但不形成新的RISC，從而減弱siRNA對(duì)各類(lèi)mRNA的抑制作用(Fig.1C)[41,42]。此外，Rando等人發(fā)現(xiàn)來(lái)自tRNA-Gly-GCC的tRF-GG可以通過(guò)調(diào)控ncRNA——U7snRNA水平來(lái)影響MERVL靶基因的轉(zhuǎn)錄[43]，這也間接說(shuō)明了tRF可以與U7 snRNA相互作用[44]。

Fig.1 Regulation mechanisms of tRF on mRNA, ncRNA and DNA (A)TRF inhibits mRNA translation by forming RG4 to replace eIF4G/eIF4a on the mRNA cap.(B)TRF binds to the 3′ UTR of the target mRNA to enhance the translation rate by altering the secondary structure.(C)TRF competes with siRNA or precursor dsRNA for Ago and Dicer to weaken the inhibitory effect of siRNA on mRNA.(D)TRF and HIV RNA form double-stranded RNA, which is transcribed into cDNA by reverse transcriptase to form complementary DNA primers, thus promoting the proliferation of the virus

由于tRF一開(kāi)始被認(rèn)為是miRNA的一種[45]，因此后續(xù)研究的開(kāi)展也主要著重于檢驗(yàn)其是否以miRNA的方式發(fā)揮作用，而對(duì)tRF與其他ncRNA相互作用的研究相對(duì)較少。以上例子說(shuō)明，tRF能直接或間接與少數(shù)特定的ncRNA相互作用，但tRF是否能和更多的ncRNA相互作用發(fā)揮調(diào)控作用，以及具體的作用途徑仍有待深入研究。

3.3 與DNA的相互作用

tRF可以和DNA結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，被HIV-1病毒感染的細(xì)胞富集了來(lái)自tRNALys的tRF-3006，而HIV RNA可以和tRNALys的3′端雜交形成雙鏈RNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為cDNA，合成互補(bǔ)DNA的引物(Fig.1D)。這說(shuō)明tRF-3006和tRNALys的56～67 nt能形成引物結(jié)合位點(diǎn)(primer binding site，PBS)，促進(jìn)病毒增殖[46]。類(lèi)似的機(jī)制在人T細(xì)胞白血病病毒I型(HtLV-1)細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。即宿主細(xì)胞中的3-tRF(tRF-3019)可以作為引物與HtLV-1的PBS結(jié)合，促進(jìn)病毒的翻譯水平并加快病毒的增殖[47]。

3.4 與特異性蛋白質(zhì)相互作用

3.4.1 與Ago蛋白家族的結(jié)合 由于tRF的大小與miRNA和siRNA相似，因此大量研究人員參考miRNA的分析方法來(lái)預(yù)測(cè)tRF的功能，認(rèn)為tRF可以與Argonautes(Ago)蛋白家族結(jié)合，形成RISC，并作用于mRNA，從而影響翻譯水平[48](Fig.2A)。研究表明，1-tRF、3-tRF和5-tRF確實(shí)可以與Ago1、Ago3、Ago4蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮基因沉默的功能。例如Haussecker等人發(fā)現(xiàn)，來(lái)自前體tRNA-Ser-TGA的1-tRF-Ser-TGA可以和Ago3、Ago4蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮基因沉默的作用[49]；Kumar等人也通過(guò)測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，3-tRF和5-tRF可以與Ago1、Ago3、Ago4相互作用，影響靶mRNA的翻譯水平[8]。其具體的作用機(jī)制如下：首先，tRF可以像miRNA一樣與Ago蛋白結(jié)合形成tRF-Ago蛋白復(fù)合體。該復(fù)合體tRF的5′端上有7～8個(gè)堿基大小的種子序列，可以與靶mRNA結(jié)合。由于在該復(fù)合體上還存在GW182蛋白(翻譯抑制和mRNA降解的效應(yīng)蛋白[50])，可以通過(guò)RNA誘導(dǎo)的RISC來(lái)降解mRNA或通過(guò)序列互補(bǔ)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮基因沉默功能。此外，Green等人發(fā)現(xiàn)，由tRNA-CysGCA裂解產(chǎn)生的3-tRF(tRF-3003a)可以與Ago2蛋白形成tRF-Ago復(fù)合物，抑制骨性關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中JAK3mRNA的表達(dá)，這種抑制效果可能與Ago2或GW182蛋白有關(guān)，如果復(fù)合物中Ago2或GW182蛋白缺失，這種抑制效果也隨之消失[51]。以上結(jié)果表明，Ago蛋白與GW182蛋白對(duì)tRF發(fā)揮基因沉默功能都缺一不可。tRF-Ago蛋白復(fù)合體除了通過(guò)GW182效應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)揮基因沉默功能外，還可以讓大量的mRNA降解酶進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)加工體，造成靶mRNA的降解[5]。這點(diǎn)在結(jié)核分枝桿菌(Mtb)的相關(guān)研究中得到了驗(yàn)證，即來(lái)自線粒體的tRF可以與Ago蛋白結(jié)合并降解靶mRNA[52]。

tRF與Ago蛋白結(jié)合的破壞將導(dǎo)致一系列生物過(guò)程發(fā)生紊亂。例如在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系中，tRF-3027b的下調(diào)將導(dǎo)致RPA1蛋白的上調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[2]。通常情況下，tRF-1001與Ago3、Ago4蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[49]，但敲除tRF-1001后，細(xì)胞將被阻滯在G2期并抑制DNA的生物合成，從而干擾細(xì)胞的正常增殖[53]。從以上結(jié)果可知，部分特定的tRF可以與Ago蛋白家族結(jié)合，通過(guò)類(lèi)miRNA-RISC途徑或召集mRNA降解酶，直接或間接調(diào)控mRNA的翻譯水平，但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制與作用靶點(diǎn)仍然有待進(jìn)一步研究。此外，有些tRF被認(rèn)為和Ago蛋白無(wú)關(guān)系，例如Kumar等人就認(rèn)為，tRF-1不與任何Ago蛋白結(jié)合[8]。

3.4.2 與RNA結(jié)合蛋白的相互作用 RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins, RBPs)是一類(lèi)同RNA結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。RBPs可以結(jié)合和調(diào)節(jié)ncRNA的表達(dá)及功能，例如ncRNA的合成和降解[54,55]等，同時(shí)RBPs也是許多疾病的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，例如癌癥、心血管疾病、遺傳疾病、發(fā)育障礙和神經(jīng)退行性疾病等[56]。研究表明，tRF也可以和RBPs結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，例如抑制細(xì)胞增殖、抑制翻譯水平等。因此，tRF-RBP相互作用是影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，是導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和疾病的重要原因之一。

YBX-1(Y-box binding protein，YB-1)是一種具有多個(gè)相互作用配體的RBP，在多條信號(hào)通路中發(fā)揮作用，并在多種癌癥類(lèi)型中高度過(guò)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在特定的條件下，2-tRF可以與腫瘤促癌基因的mRNA 3′UTR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合YBX-1蛋白，從而阻斷YBX-1蛋白與這些mRNA的相互作用(Fig.2B)，導(dǎo)致其不穩(wěn)定，抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)。類(lèi)似的機(jī)制在乳腺癌細(xì)胞的相關(guān)研究中也得到了證實(shí)[4,10,57,58]。此外，tRF還會(huì)誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒(SGs)的形成。SGs在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生組裝，導(dǎo)致細(xì)胞中的mRNA暫時(shí)沉默，使細(xì)胞暫時(shí)進(jìn)入一種“冬眠狀態(tài)”，從而提高細(xì)胞在不利條件下的生存能力。

最近Falconi等人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自tRNAGlu的tRF3E以一種不同于上述2-tRF調(diào)節(jié)機(jī)制的方式，特異性地與RBP相互作用[59]。NCL是一種在乳腺癌過(guò)表達(dá)的RBP，能夠抑制p53 mRNA的翻譯水平，NCL和tRF3E可以形成NCL-tRF3E復(fù)合物，使得p53 mRNA的表達(dá)水平提高(Fig.2C)，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，tRF在抑制腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制中也發(fā)揮重要的作用。

3.4.3 與其他蛋白的相互作用 除了對(duì)蛋白家族進(jìn)行系統(tǒng)的研究外，蛋白家族的分支蛋白質(zhì)和一些散在的蛋白質(zhì)也有被研究。細(xì)胞色素C是在一種在氧化還原過(guò)程中發(fā)揮重要作用的電子傳遞蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)。一些tRF和tiRNA可以與細(xì)胞色素C結(jié)合，抑制其與Apaf-1的結(jié)合，阻止胱天蛋白酶9(caspase-9)的活化(Fig.2D)，從而抑制凋亡小體的生成，提高細(xì)胞的生存率[60,61]。

Piwi蛋白是Ago蛋白家族的一個(gè)亞分支，可以與3-tRF和5-tRF相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[62]。研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞發(fā)展為樹(shù)突狀細(xì)胞的過(guò)程中，來(lái)源于tRNAGlu的5-tRF可以和Piwil1形成復(fù)合物，募集SETDB1、SUV39H1和HP1β等蛋白質(zhì)，使得啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生組蛋白H3K9甲基化修飾，進(jìn)而抑制CD1A的表達(dá)(Fig.2E)[63]。Pekarsky等人發(fā)現(xiàn)ts-3676和ts-4521可以與PIWIL2蛋白結(jié)合，對(duì)造血系統(tǒng)的惡性腫瘤和實(shí)體瘤發(fā)揮抑制作用[64]。此外，嗜熱四膜蟲(chóng)中的3-tRF可以特異性地結(jié)合Twi12蛋白，募集Tan1蛋白和核酸外切酶Xrn2，形成前體rRNA剪切復(fù)合體TXT(Twi12/Xrn2/Tan1 complex)，并通過(guò)剪切、加工前體rRNA來(lái)增強(qiáng)rRNA的合成(Fig.2F)[65]，調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾。

Fig.2 The regulatory mechanism of tRF on proteins (A)TRF forms a complex with the AGO-gw182 protein, which binds to the target mRNA to degrade mRNA or inhibit its expression.(B)TRF and YBX-1 competed for the 3′UTR of target mRNA and blocked the binding of YBX-1 to mRNA, thereby inhibiting cell proliferation.(C)TRF and NCL form a complex to bind to P53 mRNA and inhibit the expression level of this mRNA.(D)TRF binds to cytochrome C, inhibits the binding of cytochrome C to Apaf-1, and inhibits the formation of apoptotic bodies.(E)TRF and PIWIL1 form a complex that recruits proteins such as SETDB1, SUV39H1 and HP1β, resulting in histone H3K9 methylation in the promoter region, thereby inhibiting the expression of CD1A.(F)TRF binds to the TBI12 protein to recruit TAN1 and XRN2 to form TXT, which can enhance rRNA synthesis

tRF還可以與一些特殊酶相互作用而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能。Gebetsberger等人發(fā)現(xiàn)在特定的應(yīng)激條件下，沃氏嗜鹽富饒菌可以從tRNA-Val的5′端產(chǎn)生5-tRF。而5-tRF可以抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而抑制翻譯水平[44]。Guzzi等人在胚胎干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，假尿苷酸合酶7(pseudouridylate synthase 7，PUS7)可以介導(dǎo)tRF-5的假尿苷化，抑制干細(xì)胞中部分RNA的翻譯，如果PUS7失活，抑制作用則減弱，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的增加和一些胚胎特異性缺陷的出現(xiàn)[66]。Elbarbary等研究人員發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)tRNA 3′端成熟的內(nèi)切酶tRNaseZ(L)可以與tRF相互作用[37,67]，直接裂解匹配到RNA的序列，例如5′-tiRNA(來(lái)自tRNAGlu)可以與PPM1F mRNA在體內(nèi)和體外相互作用，促進(jìn)mRNA靶蛋白的降解。

在病毒方面，Wang等人對(duì)感染了呼吸道合胞病毒(RSV)的細(xì)胞進(jìn)行深度測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)有大量的5′-tiRNA存在，這種源自tRNAGlu-CTC的tiRNA可以與載脂蛋白E受體2(APOER2)結(jié)合并抑制其表達(dá)。而APOER2是一種抗RSV蛋白，該蛋白質(zhì)的表達(dá)被抑制后會(huì)促進(jìn)RSV病毒的增殖[68,69]。

以上關(guān)于tRF作用機(jī)制的總結(jié)主要從RNA、DNA和蛋白質(zhì)三個(gè)方面進(jìn)行闡述，其中具體的調(diào)節(jié)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有些調(diào)節(jié)關(guān)系仍然不是很明確。例如，5-tRF可以抑制靶基因的表達(dá)，但卻不需要與靶mRNA的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，其具體機(jī)制不清楚[70]等。此外，目前文獻(xiàn)報(bào)道的tRF調(diào)節(jié)機(jī)制僅是冰山一角，tRF是否存在其它的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn)。但是基于目前已有的研究，tRF可以對(duì)相關(guān)靶分子的表達(dá)水平進(jìn)行影響，調(diào)節(jié)人體內(nèi)某一疾病的危害程度，例如癌細(xì)胞的分裂和浸潤(rùn)程度。整合這些tRF與疾病的關(guān)系，將加深我們對(duì)tRF的理解。

4 tRNA衍生片段與疾病的關(guān)系

在大量tRF對(duì)靶分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中提示，tRF是眾多癌癥包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等的理想生物標(biāo)志物。在乳腺癌中，2-tRF可以與YBX-1相互作用，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用[4,10,57,58]；5′-tiRNA也可以通過(guò)FZD3/Wnt/β-Catenin信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷徙[40]。在前列腺癌中，Lee等人發(fā)現(xiàn)tRF-1001表達(dá)水平升高，促進(jìn)癌細(xì)胞從細(xì)胞周期的G2期過(guò)渡到M期，影響癌細(xì)胞的增殖速度[13]；在結(jié)直腸癌中，tRF/miR-1280可以通過(guò)3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)直接調(diào)控JAG2蛋白的表達(dá)水平，抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而阻止結(jié)直腸癌細(xì)胞的擴(kuò)增[71,72]。

除癌癥外，tRF與其他疾病也存在關(guān)聯(lián)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，由ANG生成的tRF可以形成RG4，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的恢復(fù)，從而揭示了肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)的潛在機(jī)制[73]；在遺傳病中，精子的tRF水平與雄性后代抗焦慮行為表現(xiàn)有關(guān)[74]；在病毒方面，Wang等人對(duì)感染了呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的細(xì)胞進(jìn)行深度測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，有大量源自tRNAGlu-CTC的5′-tiRNA產(chǎn)生，且可以與載脂蛋白E受體2(apolipoprotein E receptor 2，ApoER2)結(jié)合并抑制其表達(dá)。而APOER2是一種抗RSV蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)表達(dá)水平的抑制會(huì)促進(jìn)RSV病毒的增殖[68,69]；此外，在病毒感染時(shí)，3-tRF tRF-3006和tRF-3019可以作為PBS，促進(jìn)HIV-1病毒和HtLV-1病毒的增殖[46,47]。

上述例子都說(shuō)明，tRF在多種疾病中具有作為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力，但實(shí)現(xiàn)上述想法仍有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和論證，而實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展又需要更加完善的鑒定方法和工具，因此這些方面都有待提升。Table 4列出了部分目前已發(fā)現(xiàn)的在疾病中發(fā)生的tRF調(diào)節(jié)關(guān)系。

Table 4 tRF and related diseases

5 問(wèn)題與展望

tRF是近年來(lái)研究較熱的調(diào)節(jié)性非編碼RNA。本文依次從tRF鑒定方法，相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及對(duì)靶分子的調(diào)節(jié)機(jī)制這幾個(gè)方面展開(kāi)說(shuō)明。首先介紹了鑒定tRF的兩大基本策略，他們相互補(bǔ)充，為tRF鑒定方法的改進(jìn)打下了基礎(chǔ)和提供了思路。而日后發(fā)展的幾個(gè)tRF鑒定方法主要是進(jìn)一步完善了tRF的序列比對(duì)方法，例如tRF2Cancer，SeRPeNT和SPORTS1.0。其次介紹了有關(guān)tRF的5種數(shù)據(jù)庫(kù)，包括tRFdb，tRF2Cancer，MINTbase，OncotRF和tRFtarget，他們各有特點(diǎn)及作用，為后續(xù)計(jì)算機(jī)大規(guī)模識(shí)別鑒定tRF提供了數(shù)據(jù)資源。這兩者相輔相成，為tRF對(duì)相關(guān)靶分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供了更為有效的工具。然后從tRF與RNA，DNA及蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制角度進(jìn)行總結(jié)，列舉了幾種目前研究較為熱門(mén)的靶分子對(duì)象。從這些研究中也提示了tRF與疾病的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)tRF表達(dá)水平的高低，可以探索其作為疾病生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。目前在癌癥等多種疾病中已發(fā)現(xiàn)一些差異表達(dá)的tRF，但其在臨床上的應(yīng)用和轉(zhuǎn)化仍有待進(jìn)一步探討。

目前有關(guān)tRF和tiRNA的研究層出不窮，但我們只看到了冰山一角，仍有更多的未知等待探索。其次，更多關(guān)于tRF和tiRNA的產(chǎn)生機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)掘，其命名也有待進(jìn)一步統(tǒng)一。同時(shí)，tRF的鑒定方法和工具也稂莠不齊，但都主要以序列比對(duì)為主要依據(jù)，對(duì)其預(yù)測(cè)的可信度仍無(wú)進(jìn)一步把控。未來(lái)可從空間結(jié)構(gòu)，表達(dá)情況，功能分析，調(diào)節(jié)關(guān)系等更多角度綜合考慮，以更加準(zhǔn)確地鑒定tRF，減少假陽(yáng)性。此外，目前已有的數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏相互整合，也迫切需要進(jìn)一步完善和綜合，有必要建立一個(gè)集tRFdb，tRF2Cancer，MINTbase等各種數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容在內(nèi)的綜合性tRF數(shù)據(jù)庫(kù)，以方便研究人員查詢(xún)和分析、實(shí)時(shí)上傳數(shù)據(jù)，分享潛在的tRF類(lèi)型等。至于有關(guān)tRF對(duì)靶分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，目前主要關(guān)注蛋白質(zhì)方面，對(duì)于tRF與RNA和DNA調(diào)節(jié)機(jī)制的報(bào)道仍然較少，并且這些都來(lái)自于少數(shù)特定的tRF或tiRNA，缺乏更多組織樣本的數(shù)據(jù)結(jié)果，未來(lái)可進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)與生物實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)和驗(yàn)證tRF更多可能的靶基因和功能，使我們進(jìn)一步了解tRF。