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    一種快速提取組織外泌體的分離富集方法

    2022-09-07 05:48:22王建立張子怡秦偉偉王程程
    關鍵詞:鹽溶液消化酶外泌體

    王建立, 張子怡, 秦偉偉, 王程程, 楊 瑞*

    (1)農業(yè)應用新技術北京市重點實驗室,北京農學院植物科學技術學院, 北京 102206;2)北京恩澤康泰生物科技有限公司, 北京 102206)

    胞外囊泡是由不同細胞釋放的脂質雙層膜包被的顆粒,主要包括外泌體、微囊泡和凋亡小體[1,2]。外泌體大小30~150 nm,它們可以包裹和傳遞RNA和蛋白質等分子[3,4],作為細胞間通信的信使參與多種生理和病理途徑[5]。目前,外泌體已成功地從血液[6,7]、尿液[8]、唾液[9]、卵泡液[10]和精液[11]等體液中分離,并已有較標準的鑒定方法,但是從組織細胞間隙中分離到外泌體的相關研究較少[12,13]。組織間隙的外泌體提取分離關鍵環(huán)節(jié)是剪切和酶解獲得細胞懸液。這個過程會造成一定程度細胞結構的破壞,破裂的細胞會釋放大量的脂質體、蛋白質復合體、DNA、RNA、細胞器或細胞碎片等,與體液相比極大地增加了外泌體純化難度,而常規(guī)的體液外泌體分離方法,例如標準的超離很難得到高純度的外泌體。

    目前,采用的分離組織外泌體技術,例如免疫捕獲法利用特異性抗體識別并分離外泌體,特異性高,但其價格昂貴,容易丟失抗原表達偏低的囊泡,且不適合處理大體積樣本;蔗糖密度梯度離心法在消除細胞污染物方面非常有效,但該方法相對冗余耗時,需要技術人員熟練掌握密度梯度離心操作過程,不同批次或不同操作人員間提取富集的外泌體存在差異,造成提取的外泌體質量不穩(wěn)定[14]。國內也有少量關于組織外泌體的研究。李冬等[15]公開了一種組織來源外泌體的提取方法,基于酶裂解組織后直接進行外泌體提取,但需要使用聚乙二醇過夜沉降,提取外泌體最少需要1.5 d,耗時較長,而且提取的外泌體中可能存在大量蛋白質雜質;喬鞠等[16]公開了一種軟組織胞外囊泡的提取方法,軟組織需要另外培養(yǎng)1~96 h后再進行胞外囊泡的提取,過程繁瑣且耗時長。因此,亟需建立一種快速提取組織胞外囊泡的分離富集方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗材料包括小鼠心、肝、腎組織、人結腸癌組織、人乳腺癌組織和動脈粥樣硬化組織。

    所用試劑包括木瓜蛋白酶(Worthington-biochemical,LK003178),Earle’s平衡鹽溶液(EBSS緩沖液),Hibernate E培養(yǎng)基,膠原蛋白酶D(上海羅氏制藥有限公司,貨號為11088858001),DNase I(上海羅氏制藥有限公司,貨號為4536282001),消化酶H、消化酶R和消化酶A的混合酶(天旎生物技術有限公司,貨號為130-095-929),蛋白酶和磷酸酶抑制劑(賽默飛生物科技有限公司),PBS緩沖液,排阻色譜柱(北京恩澤康泰生物科技有限公司),Pierce BCA 蛋白質定量分析試劑盒(賽默飛生物科技有限公司,貨號為23-225)。

    1.2 組織解離方法的比較分析

    分別使用木瓜蛋白酶,膠原蛋白酶+DNase I以及組織消化酶進行小鼠心組織的解離。通過檢測外泌體粒度和鈣連蛋白(calnexin)含量,評價外泌體提取質量。鈣連蛋白是內質網膜上的一種蛋白質,其功能主要作為分子伴侶參與蛋白質新生肽鏈的折疊和加工等。使用其作為外泌體Western印跡分析的陰性蛋白質標志物,可用來鑒定細胞來源蛋白質污染程度。鈣連蛋白含量越少說明細胞來源蛋白質污染程度越小。

    1.2.1 木瓜蛋白酶解離實驗 將木瓜蛋白酶用Earle’s平衡鹽溶液(EBSS緩沖液)溶解,用量為15~30 U,再添加Hibernate E 培養(yǎng)基獲得。其中,Earle’s平衡鹽溶液與Hibernate E培養(yǎng)基的體積比為1∶3,木瓜蛋白酶溶液的用量為3 mL。

    1.2.2 膠原蛋白酶D和DNase I解離實驗 膠原蛋白酶D和DNase I用Earle’s平衡鹽溶液(EBSS緩沖液)溶解,再添加Hibernate E培養(yǎng)基,Earle’s平衡鹽溶液與Hibernate E培養(yǎng)基的體積比為1∶3,膠原蛋白酶D終濃度為24 mg/mL,用量為0.5 mL,DNase I 終濃度為2 000 U/mL,用量為0.2 mL。

    1.2.3 組織消化酶解離實驗 組織消化酶是消化酶H、消化酶R和消化酶A的混合酶。將消化酶H、消化酶R和消化酶A分別按照說明書中的方法用DMEM平衡鹽溶液溶解,再將消化酶H、R和A的DMEM平衡鹽溶液按體積4∶2∶1體積比混合。

    1.3 不同組織外泌體富集方法

    本文對小鼠心、肝和腎組織,人結腸癌組織、乳腺癌組織和動脈粥樣硬化組織外泌體的富集方法進行研究。因不同組織結構特性的差異,其步驟差異如Table 1。

    Table 1 Comparison of various tissue samples

    本研究構建的外泌體富集提取法主要步驟包括:將低溫冷凍(-80 ℃)的組織,用刀片切成1~2 mm3大小的組織切片,并轉移到含有1.5~4 mL(優(yōu)選2~3 mL)組織消化酶解離液的離心管中。其中,組織消化酶的配制同1.2.3;將上述混合物放入37 ℃水浴,每隔5 min混合1次,解離時間為30 min。再用70 μm濾膜過濾上述組織解離液到新的離心管中,獲得組織細胞懸液,繼而添加20~40 μL蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。于4 ℃,300~600 g離心10 min,收集上清液,并將其轉移到新的離心管中。4 ℃,2 000~3 000 g離心10 min。收集上清液,繼續(xù)將其轉移到新的離心管中。4 ℃,10 000~12 000 g離心10 min,收集上清液,用0.22 μm濾膜過濾到超離管中,加入預冷的PBS至總體積10~18 mL。2~8 ℃,100 000~150 000 g超離1.5~2.5 h(優(yōu)選4 ℃超離2 h)。將超離管中的沉淀用1 mL PBS溶解,獲得初步純化的組織外泌體懸液;之后,將所得外泌體懸液加入到排阻柱中,待液體流盡,加入2.5 mL PBS。與此同時,開始收集流出液,將流出液轉移到超濾管中。4 ℃,3 000~5 000 g離心1~5 min,留取截留液200~500 μL,即為高純度外泌體。

    1.4 蛋白質質量檢測、透射電子顯微鏡觀察、納米粒徑和蛋白質印跡分析

    1.4.1 蛋白質質量檢測 將10 μL樣品加入到96孔板中,并加入200 μL BCA溶液。在37 ℃下,孵育30 min。設置平板閱讀器吸光度562 nm,用標準曲線測量每個待測樣品的蛋白質濃度。不同稀釋倍數(shù)的樣品溶液重復3次。

    1.4.2 透射電子顯微鏡觀察 將10 μL外泌體懸液滴至銅網中。室溫下,孵育10 min后,用無菌蒸餾水清洗。然后,用醋酸雙氧鈾負染1 min,并在白熾燈下干燥2 min。最后,用透射電子顯微鏡(H7650)進行觀察并拍照。

    1.4.3 納米粒徑分析 通過納米顆粒追蹤分析儀(Zeta View PMX 110)對1×107/mL至1×109/mL顆粒濃度的外泌體溶液進行尺寸和顆粒濃度檢測。在波長為405 nm的激發(fā)光波下,以30幀/s的幀速率拍攝一段60 s的視頻,并使用NTA軟件(Zeta View 8.02.28)分析粒子運動軌跡,從而獲得外泌體的尺寸和濃度。

    1.4.4 Western印跡 分析通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的小鼠肝組織外泌體樣本進行著色。在自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon4600)中對蛋白質檢測結果進行可視化,并分析著色的位置和深度獲得外泌體的陽性蛋白質標志物CD9、TSG101、ALIX和CD63和外泌體陰性蛋白質標志物鈣連蛋白的表達情況。CD9和CD63是外泌體跨膜蛋白家族成員,直接參與了外泌體的分泌,TSG101(Tumor Susceptibility 101)是與外泌體釋放結構ESCRT復合體有關的蛋白質,ALG2相互作用蛋白ALIX,涉及到了泡膜在形成過程中切割脫離質膜形成獨立膜結構的過程,它們均可以作為外泌體Western印跡分析的陽性蛋白質標志物,可用來評價外泌體的純度和質量。

    2 結果

    2.1 組織消化酶解離提取的外泌體質量更佳

    小鼠心組織的質量和BCA蛋白質總量見Table 2。表中顯示,優(yōu)化后的酶解方法提取蛋白質含量更多。通常,外泌體粒徑范圍介于30~150 nm之間,在此范圍內的外泌體質量較好。通過不同相關酶對小鼠心組織進行解離,所得到的外泌體粒徑范圍為30~150 nm,并可以明顯觀察到組織消化酶(Fig.1C)提取的外泌體粒徑主峰范圍在80~150 nm之間,外泌體質量較好,而木瓜蛋白酶和膠原蛋白酶D和DNase I(Fig.1A,B)提取外泌體的粒徑主峰范圍在100~300 nm之間,多數(shù)為非外泌體,因此外泌體質量相對較差。

    Table 2 The BCA protein of exosomes of enzymes related to the optimization of enzymatic hydrolysis process

    CK為小鼠細胞裂解物,通過不同相關酶對小鼠心組織進行解離,所得到的外泌體污染程度有所不同,組織消化酶提取的外泌體中的鈣連蛋白幾乎檢測不到(Fig.2C),因此組織消化酶的細胞來源蛋白質污染程度相對較小,其次是木瓜蛋白酶的外泌體鈣連蛋白依稀可見,膠原蛋白酶D和DNase I(Fig.1A,B)提取的外泌體鈣連蛋白污染程度最大。

    Fig.2 Proteomic expression on basis of Western blot depicted negative expression Calnexin of exosome that isolated through various tissue dissociation techniques (A) Calnexin expression after papain. (B) Calnexin expression after collagenase D and DNase I extraction. (C) Calnexin expression after enzymatic treatment for extraction

    2.2 采用本方法富集的不同組織的外泌體質量更高

    2.2.1 不同組織外泌體粒徑均在外泌體粒徑范圍內 將不同組織外泌體的NTA數(shù)據匯總在Table 3 中。顯示這些外泌體的粒徑均介于30~150 nm之間,符合外泌體正常的粒徑范圍,屬于質量較好的外泌體。

    Table 3 NTA results of exosomes from various tissues

    2.2.2 不同組織外泌體結構均清晰 透射電子顯微鏡下觀察結果(見Fig.4)顯示,各組織外泌體呈茶托狀結構,均清晰可見,粒徑均與NTA結果吻合,顆粒直徑在100 nm左右。同時,在可觀察的視野中,各組織之間所提取的外泌體數(shù)量無明顯差異,結果趨于一致,說明該提取方法滿足了大多數(shù)組織所提取的外泌體的后續(xù)實驗。

    Fig.3 Exosome particle size distribution in various tissues samples (A ) Exosome particle size distribution in mouse cardiac tissues. (B) Exosome particle size distribution in mouse liver tissues. (C) Exosome particle size distribution in mouse kidney tissues. (D) Exosome particle size distribution in human colon cancerous tissue. (E) Exosome particle size distribution in human breast cancer cells. (F) Exosome particle size distribution in atherosclerotic tissue. Typical range of exosome particle sizes from 30 nm to 150 nm. The higher the concentration of exosomes in this range, the better the quality

    Fig.4 TEM images of exosomes from diverse tissues TEM pictures of exosomes from various tissue depicted complete structure of exosome that are clearly evident, scale bar is 200 nm

    2.2.3 小鼠肝組織外泌體無污染 小鼠肝組織外泌體的Western 印跡檢測結果(見Fig.5)表明,圖中清晰可見陽性蛋白質標志物CD9、ALIX和CD63的表達,TSG101弱表達,陰性蛋白質標志物鈣連蛋白無表達,富集得到的小鼠肝組織外泌體無污染,質量高。

    Fig.5 Proteomic expression exosomes in mouse liver The expression of positive and negative protein markers were analyzed with Western blotting in mouse liver exosomes. The weak expression of negative protein and high expression of positive protein indicated the high quality of exosomes. The higher the concentration of exosomes in this range, the better the quality

    3 討論

    近年來,國內外眾多學者越來越重視對外泌體的研究。組織細胞懸液的獲得是快速富集外泌體的基礎。根據酶解工藝優(yōu)化實驗結果中可得出,本文提供的組織消化酶的酶解方案能獲得的外泌體,質量好且結構更加清晰,大多數(shù)粒徑范圍符合外泌體的特征。目前,通常使用超速離心法、蔗糖梯度離心法、超濾法、尺寸排阻液相色譜法、免疫親和珠分離法、ExoQuick提取法等實現(xiàn)對外泌體的富集[17],也有采用微流芯片等新技術成功分離并檢測出外泌體[18]。但研究多基于血液、唾液和尿液等體液中。組織間隙中外泌體的分離更容易受到雜質的影響。

    邱金戈等[19]對比指出了以上幾種方法的缺點,例如超速離心法可能會破壞外泌體結構,ExoQuick提取法耗時長、且易污染等。本文提供了一種新的方法,即將差速離心、超離、SEC排阻和超濾幾種方法依次使用。在透射電鏡觀察中,均能看出外泌體茶托狀結構,且結構清晰無損傷;NTA粒徑分析,幾種組織的粒徑完全符合外泌體的生物學特性,且與透射電鏡觀察結果吻合;對小鼠肝組織進行Western印跡結果分析,發(fā)現(xiàn)外泌體標記蛋白質CD9、ALIX、CD63、TSG101等[20],均有不同程度的表達,提取物中外泌體的含量高,而為內質網蛋白標志物鈣連蛋白無表達,表明提取物中雜質含量少。而且?guī)追N組織的外泌體富集實驗時間都在4.5 h之內,操作簡單方便,使用微量組織樣本富集的外泌體即可滿足后續(xù)NTA、Western印跡、電鏡和轉錄物組等分析。同時,組織外泌體分離富集可用于篩選疾病標志物或進行細胞增殖、凋亡侵襲、轉移等后續(xù)研究,進一步挖掘疾病的信號通路機制,對疾病的鑒別診斷、預后復發(fā)監(jiān)控、靶向載藥治療等具有重要意義。

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