Hsa_circ_0087354通過hsa-miR-199-3p/SLC7A11調(diào)節(jié)MG-63細胞增殖及氧化還原狀態(tài)

鄭寶蓮， 何嘉軒， 梁珮琪， 李 丹， 劉小川， 張靜瑩

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院，口腔醫(yī)學(xué)3D打印技術(shù)重點實驗室， 廣東東莞 523710)

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生增多并超出了抗氧化酶的清除能力，造成氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，引起中性粒細胞炎性浸潤和蛋白酶分泌增加，同時產(chǎn)生大量活性氧自由基，嚴重阻礙細胞增殖和分化，進而引起生物損傷的一種反應(yīng)[1]。嚴重的氧化應(yīng)激不僅會損傷細胞和組織，造成多種疾病的發(fā)生；同時也調(diào)控組織(骨、軟骨、軟組織)的再生，影響疾病的治療和預(yù)后[2]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病、牙周病等慢性疾病的患者，牙種植體失敗率顯著高于正常人[3]。軟組織愈合和骨組織修復(fù)時間比健康人更長[4]。

細胞的氧化還原狀態(tài)，受到多種基因及生物學(xué)行為調(diào)控，針對單一基因的治療通常不能達到滿意效果。近年研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)修飾等多個層面調(diào)控多個下游基因的表達，在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。環(huán)狀RNA (circular RNA，circRNA)作為一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長非編碼RNA，是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴，并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。大部分circRNA是由外顯子序列構(gòu)成，在不同物種間高度保守；其在細胞漿中富集，豐度有時甚至比相應(yīng)的線性RNA高10余倍；其對核酸酶具有高耐受性，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達中發(fā)揮重要調(diào)控作用[6]。CircRNA具有理想生物標(biāo)志物(biomarker)的特征優(yōu)勢：取材無損傷、檢測穩(wěn)定性高、組織特異性好、靈敏度高、具有半衰期長、穩(wěn)定性強的典型優(yōu)勢，具有較好的臨床轉(zhuǎn)化價值[7]。

CircRNA可作為吸附microRNA (miRNA)的海綿體，通過“circRNA-miRNA-mRNA”網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)途徑，發(fā)揮關(guān)鍵的基因調(diào)控功能[8]，已有研究證實，circRNA參與氧化應(yīng)激反應(yīng)過程[9]。Hsa_circ_0087354是本課題組在牙髓干細胞中發(fā)現(xiàn)的與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的一個新的circRNA[10]，但其發(fā)揮作用的機制尚待進一步闡明。本研究將通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方式，在MG-63細胞中過表達hsa_circ_0087354，通過檢測氧化應(yīng)激的成骨細胞內(nèi)溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)、活性氧1(reactive oxygen species1，ROS1)及超氧化物歧化酶1(surperoxide dismutase1，SOD1)等氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達和氧化應(yīng)激細胞增殖能力，以及GSH(glutathione)濃度及ROS、SOD等氧化還原酶的活性，明確hsa_circ_0087354調(diào)控成骨細胞增殖和氧化還原狀態(tài)的作用及其作用途徑。有望為hsa_circ_0087354在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中的靶向治療提供理論依據(jù)，并為臨床上促進高血壓、糖尿病、牙周炎等慢性疾病患者牙種植體骨結(jié)合，提高種植體成功提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

MG-63細胞 (human osteosarcoma cells)來源于南方醫(yī)科大學(xué)黃文華課題組；胎牛血清、LipofectamineTM2000 CD Reagent、高糖DMEM粉末、青鏈霉素、胎牛血清(FBS)、NanoDrop2000和胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技有限公司；PBS粉末、3%雙氧水(H2O2)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；總超氧化物歧化酶(surperoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(NBT法)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測(double luciferase reporter gene assay)試劑盒和總RNA抽提試劑(Trizol)購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒購于北京蘭杰柯科技有限公司；RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；載體和引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；hsa-miR-199a-3p mimics、hsa-miR-199b-3p mimics及hsa-NC-mimics由漢恒生物科技(上海)有限公司合成；質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒(Plasmid Mini/Midiprep Kit)購于Axygen；野生型(WT)SLC7A11、突變型(MUT)SLC7A11、野生型(WT)hsa_circ_0087354以及突變型(MUT)hsa_circ_0087354載體由酸談(上海)信息科技有限公司構(gòu)建合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

從-80 ℃低溫冰箱中取出MG-63細胞，復(fù)蘇后用完全培養(yǎng)基(10%FBS+1%青鏈霉素 +DMEM)培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長密度達70% ～ 80%時，用胰蛋白酶消化，獲得細胞懸液，以2×105細胞/mL 接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前1 h更換為0.5 mL DMEM培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000 CD Reagent說明書進行轉(zhuǎn)染，將孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后進行RT-PCR檢測，30 h后進行氧化應(yīng)激相關(guān)試劑盒檢測。

1.3 氧化應(yīng)激細胞模型構(gòu)建

MG-63細胞 (2×105細胞/mL) 接種于24孔細胞培養(yǎng)板中(n= 3)，每孔1 mL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以3% H2O2溶于DMEM稀釋成0.3 mmol/L的工作液，加入細胞中培養(yǎng)24 h，用于檢測細胞內(nèi)ROS、GPx和SOD活性。

1.4 谷胱甘肽濃度檢測

MG-63細胞(2 × 105細胞/mL)接種于24孔培養(yǎng)板中(n= 3)，每孔1 mL，按上述細胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)30 h，用胰蛋白酶消化收集，計數(shù)后的細胞置于1.5 mL無菌離心管中，每管加入100 μL谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒中的試劑一。加入適量液氮，凍融3次。4 ℃ ，8 000 g離心10 min，每組每孔加入20 μL上清液，140 μL試劑二，40 μL試劑三。充分混勻后，將96孔板置于全波段熒光酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2，BioTek，德國)上，412 nm波長處檢測吸光值，計算出應(yīng)激后的細胞內(nèi)GSH濃度。

1.5 總超氧化物歧化酶活性檢測

MG-63細胞(2 × 105細胞/mL)接種于24孔培養(yǎng)板中(n= 3)。每孔1 mL，按上述細胞轉(zhuǎn)染和氧化應(yīng)激方法處理細胞。用胰蛋白酶消化收集后的細胞于1.5 mL離心管中,每管加入SOD檢測緩沖液300 μL,用適量液氮凍融3次。4 ℃，12 000 g離心3 min，獲取上清液。按說明書操作，制備NBT/酶工作液和反應(yīng)啟動工作液。并將上述兩者和上清液按量加入到96孔板，充分混合后，于全波段熒光酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2，BioTek，德國)560 nm波長處檢測吸光度，通過計算其抑制百分率，最后得出SOD活性。

1.6 活性氧的活性檢測

MG-63細胞(2 × 105細胞/mL)接種于24孔培養(yǎng)板中(n= 3)，每孔1 mL，按上述細胞轉(zhuǎn)染和氧化應(yīng)激方法處理細胞。去除0.3 mmol/L H2O2刺激后的氧化應(yīng)激細胞培養(yǎng)液(n= 3)，用1×PBS洗滌3次，加入提前配置好的DCFH-DA，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵化20 min，用1×PBS清洗氧化應(yīng)激細胞3次去除染料。在全波段熒光酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2，BioTek，德國)488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長下，計算ROS活性。

1.7 谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測

MG-63細胞(2 × 105細胞/mL)接種于24孔培養(yǎng)板中(n= 3)，每孔1 mL，按上述細胞轉(zhuǎn)染和氧化應(yīng)激方法處理細胞。向各孔加入1 mL預(yù)冷的1×PBS后，置-20 ℃冰箱孵化30 min，用1 mL 移液槍輕輕吹打混勻獲得細胞懸液，1 000 r/min離心3 min，收集細胞沉淀。加入100 μL 1×PBS混勻，用液氮凍融3次，4 ℃，12 000 g離心3 min，獲得上清液。按說明書操作，將相應(yīng)的試劑按量加入96孔板后，25 ℃全波段熒光酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2，BioTek，德國)340 nm波長處檢測吸光度，計算GPx活性。

1.8 RNA提取和RT-qPCR

采用Trizol試劑盒提取氧化應(yīng)激細胞總RNA，具體方法參考說明書。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，合成的cDNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。RT-PCR總體系為20 μL包括引物(10 μmol/L，上下游引物 1∶1 混合)2 μL，cDNA 4 μL，2 × SYBR Premix Ex Taq 10 μL，RNAase Free ddH2O補至 20 μL。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃ 5 s；PCR定量分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 min；降溫50 ℃ 30 s。在實時定量PCR儀(LightCycle 480, 上海羅氏有限公司, 中國)上檢測基因相對表達。以U6和β-actin分別作為miRNA和其他基因的內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算hsa_circ_0087354、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199b-3p、Nrf2、SOD1、ROS1和SLC7A11相對表達水平(n=3)。各基因的引物序列見Table 1。

2000級曼巴扎倉第一屆醫(yī)學(xué)生久麥多杰，32歲，梳著一個略顯花白的小辮子，他在共和縣開了一家藏醫(yī)診所，當(dāng)曼巴扎倉的病人太多時他就回來分擔(dān)活佛壓力。他回顧10年的學(xué)醫(yī)生涯時說：

Table 1 RT-qPCRprimer sequence

1.9 CCK-8法細胞增殖檢測

MG-63細胞(2 × 104細胞/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中(n= 3)，每孔100 μL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按上述法進行細胞轉(zhuǎn)染，6 h，更換為完全培養(yǎng)基，分別在轉(zhuǎn)染后1 d、2 d、3 d和4 d，在相對應(yīng)的孔內(nèi)加入CCK-8試劑10 μL/孔，培養(yǎng)3 h后取出。在全波段熒光酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2，BioTek，德國)上490 nm波長處檢測各孔吸光度值。

1.10 雙熒光素酶活性驗證靶向關(guān)系

取對數(shù)生長期的MG-63細胞(2×105細胞/mL)接種于24孔培養(yǎng)板(n= 5)，每孔1 mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染前1 h更換為0.5 mL空白培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000 CD Reagent說明書，將構(gòu)建的熒光素酶報告基因野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒及合成的hsa-miR-199-3p及hsa-miR-NC共轉(zhuǎn)染到細胞；轉(zhuǎn)染 48 h ，將細胞用1×PBS 洗滌3次；每孔加入200 μL細胞裂解液，室溫孵化10 min，10 000 r/min離心5 min，獲得應(yīng)激后的細胞裂解液上清液；取100 μL上清液加入96孔板中，上機測其發(fā)光值；再加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測工作液，吹吸混勻，上機測發(fā)光值；以螢火蟲熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值作為相對熒光素酶活性，并與陰性對照比較。

1.11 生物信息學(xué)分析

通過Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)[11]、circBank(http://www.circbank.cn/index.html)[12]和circAtlas 2.0(http://circatlas.biols.ac.cn/)[13]3個數(shù)據(jù)庫，預(yù)測與hsa_circ_0087354相互作用的miRNA，獲得3個數(shù)據(jù)庫共交集靶向預(yù)測miRNA；隨后，采用miRNA靶基因的預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRDB(http://mirdb.org/)[14]、Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)及DIANA TOOLS(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8/index)[15]，預(yù)測上述交集獲得的miRNA的靶基因，獲得3個數(shù)據(jù)庫共交集的mRNA。最后，利用cytoscape 3.7.1構(gòu)建“circRNA-miRNA-mRNA”互作網(wǎng)絡(luò)。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD) 表示，采用GraphPad Prism 8.0.2(263)軟件進行兩組間配對t檢驗分析，分析各組之間是否存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 Hsa_circ_0087354降低MG-63細胞氧化應(yīng)激

為研究hsa_circ_0087354對細胞氧化應(yīng)激的作用，以0.3 mmol/L H2O2刺激細胞，構(gòu)建氧化應(yīng)激模型?；钚詸z測表明，相比于NC組的ROS(87.67±2.62)和SOD(0.42±0.02)及GPx(10.03±0.59)的活性，0.3 mmol/L H2O2組的ROS(148.67±8.38)活性顯著上升(P<0.001)，SOD(0.28±0.001)及GPx(6.21±0.51)活性顯著下降(P<0.001, Fig. 1A)，表明0.3 mmol/L H2O2成功構(gòu)建氧化應(yīng)激細胞模型。與NC組(0.50±0.03)相比，hsa_circ_0087354(1.00±0.09)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的基因表達顯著提高(P<0.01)，提示hsa_circ_0087354可能參與調(diào)控細胞的氧化還原反應(yīng)。

為進一步明確hsa_circ_0087354調(diào)控細胞氧化還原作用，構(gòu)建ctrl質(zhì)粒和hsa_circ_0087354質(zhì)粒過表達載體，采用LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染MG-63細胞。24 h后，使用倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73, Olympus Corporation，日本)對轉(zhuǎn)染的細胞進行實時熒光拍攝及相關(guān)基因表達檢測。RT-qPCR結(jié)果顯示，相對于ctrl組hsa_circ_0087354(0.56±0.22)和SOD(1.00±0.01)及ROS1(1.78±0.07)的基因表達量，hsa_circ_0087354組的hsa_circ_0087354(8.88±1.13)和SOD1(1.23±0.14)基因表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，而ROS1(1.30±0.07)基因表達量顯著下調(diào)(P<0.01)。表明hsa_circ_0087354成功轉(zhuǎn)入氧化應(yīng)激的細胞內(nèi)，而且具有抗氧化作用(Fig. 1B)。通過氧化應(yīng)激相關(guān)試劑盒活性分析發(fā)現(xiàn)，在hsa_circ_0087354組氧化應(yīng)激的細胞內(nèi)，GSH濃度(53.22±0.41)及SOD(1.94±0.10)和GPx活性(23.11±2.35)顯著高于ctrl組的GSH濃度(43.53±0.47)以及SOD(0.51±0.05)和GPx活性(10.10±1.21)(P<0.01,Fig. 1C)。在功能層面證實了hsa_circ_0087354具有抗氧化作用。CCK-8結(jié)果表明，hsa_circ_0087354具有促進氧化應(yīng)激細胞增殖的作用(P<0.05, Fig. 1D)。

Fig.1 Hsa_circ_0087354 regulated cellular redox state (A) After MG-63 cells were stimulated with 0.3 mmol/L H2O2, the relative expression of hsa_circ_0087354 and the activities of SOD and GPx were increased, while the activities of ROS was decreased compared with normal cells. (B) The fluorescence pictures showed the hsa_circ_008735 group was transfected in MG-63 cells by LipofectamieTM 2000. After transfected with hsa_circ_0087354, the mRNA expressions of hsa_circ_0087354, ROS1 and SOD1 were changed by RT-qPCR. (C) The activities of GSH, SOD and GPx were improved after overexpression of hsa_circ_0087354 in MG-63 cells. (D) The CCK-8 assay was used to evaluate the proliferation of MG-63 cells with hsa_circ_0087354 overexpression at 1, 2, 3, 4days after transfection. Values are the mean ±SD of three determinations from separate experiments.* means P<0.05;**means P<0.01;*** means P<0.001;**** means P<0.0001

2.2 生物信息學(xué)分析預(yù)測hsa_circ_0087354/hsa-miR-199-3p/SLC7A11之間靶向調(diào)控關(guān)系

通過Starbase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0087354的3′ UTR與hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-199b-3p之間存在靶向結(jié)合。通過miRNA的靶基因預(yù)測軟件，發(fā)現(xiàn)在眾多的哺乳動物中，均存在SLC7A11的3′UTR與hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-199b-3p的靶向結(jié)合。因此，可能存在hsa_circ_0087354/hsa-miR-199-3p/SLC7A11信號通路調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(Fig. 2B)。

Fig.2 Bioinformatics analysis and prediction of target genes (A) The target genes from Starbase, miRDB and DIANA TOOLS were integrated into the Cytoscape 3.7.1 and exported "hsa_circ_0087354/hsa-miR-199-3p/SLC7A11" interaction network. (B) Starbase showed the predicted binding sites of hsa_circ_0087354 with hsa-miR-199-3p and Targetscan showed the predicted binding sites of SLC7A11 with hsa-miR-199-3p

2.3 hsa_circ_0087354靶向抑制hsa-miR-199-3p，促進SLC7A11表達顯著上調(diào)

circRNA可以在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的不同水平進行功能調(diào)控。為了明確hsa_circ_0087354調(diào)控細胞氧化還原狀態(tài)的作用機制，本研究采用LipofectamineTM2000將ctrl質(zhì)粒和hsa_circ_0087354質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MG-63細胞，24 h后進行下游基因的RT-qPCR檢測。結(jié)果顯示，相對于ctrl 組的Nrf2(3.11±0.12)和SLC7A11(1.00±0.08)以及hsa-miR-199a-3p(1.11±0.38)和hsa-miR-199b-3p(1.49±0.39)的基因表達，hsa_circ_0087354組的Nrf2(22.43±2.16)和SLC7A11(1.22±0.06)表達顯著上調(diào)(P<0.05)；而hsa-miR-199a-3p(0.01±0.00)和hsa-miR-199b-3p(0.01±0.00)的表達量均顯著下調(diào)(P<0.01)。表明hsa_circ_0087354可能吸附hsa-miR-199-3p，調(diào)節(jié)SLC7A11基因表達(Fig. 3A)。

Fig.3 Hsa-circ-0087354 promoted expression of SLC7A11 by sponging hsa-miR-199-3p (A) After hsa_circ_0087354 transiently transfected in MG-63 cells, the mRNA expressions of hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b-3p, Nrf2 and SLC7A11 were detected by RT-qPCR. (B) Groups by hsa_circ_0087354-WT+hsa-miR-NC mimics, hsa_circ_0087354-WT+hsa-miR-199-3p mimics, hsa_circ_0087354-MUT+hsa-miR-NC mimics and hsa_circ_0087354-MUT+hsa-miR-199-3p mimics were used for cotransfection and luciferase activity was detected. Values are the mean ±SD of three determinations from separate experiments.* means P<0.05;**means P<0.01; *** means P<0.001

為了進一步確認基因的靶向調(diào)控關(guān)系，進行雙熒光素酶報告檢測，在螢火蟲熒光素酶后面插入hsa_circ_0087354的3′ UTR序列，構(gòu)建hsa_circ_0087354野生型和突變型載體，合成hsa-miR-199-3p和hsa-miR-NC mimics，按hsa_circ_0087354-WT+hsa-miR-NC mimics、hsa_circ_0087354-WT+hsa-miR-199-3p mimics、hsa_circ_0087354-MUT+hsa-miR-NC mimics及hsa_circ_0087354-MUT+hsa-miR-199-3p mimics分組進行共轉(zhuǎn)染實驗。由于hsa_circ_0087354中的結(jié)合序列對熒光值的影響較大，導(dǎo)致在hsa_circ_0087354-MUT型中兩組熒光素酶活性比在hsa_circ_0087354-WT型中均顯著升高。但是在hsa_circ_0087354-WT型中，hsa-miR-199-3p組(6.39±0.44)的熒光素酶活性明顯比hsa-miR-NC組(7.44±0.16)降低(P<0.01)，而在hsa_circ_0087354-MUT型中，hsa-miR-199-3p組(8.32±0.39)和hsa-miR-NC組(8.72±0.05)熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)(Fig. 3B)，證實hsa_circ_0087354與hsa-miR-199-3p之間存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。

2.4 hsa-miR-199-3p靶向抑制SLC7A11的表達

為驗證hsa-miR-199-3p的功能及作用機制，合成hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199b-3p mimics和hsa-miR-NC mimics，瞬時轉(zhuǎn)染進入MG-63細胞內(nèi)。RT-qPCR結(jié)果表明，hsa-miR-199a-3p mimics組中SLC7A11(1.33±0.15)和Nrf2(0.60±0.04)的相對表達量比hsa-miR-NC mimics組的SLC7A11(2.66±0.10)和Nrf2(0.80±0.04)的相對表達量均顯著降低(P<0.01)。SLC7A11的表達在hsa-miR-199b-3p mimics組(1.27±0.10)比hsa-miR-NC mimics組(8.04±0.62)顯著下調(diào)(P<0.0001)，而Nrf2表達在hsa-miR-199b-3p mimics組(0.78±0.054)與hsa-miR-NC mimics組(8.04±0.62)相比無顯著差異(P>0.05, Fig. 4A)。另外，發(fā)現(xiàn)細胞瞬時轉(zhuǎn)染hsa-miR-199-3p mimics時，相比于hsa-miR-NC mimics組的GSH濃度(5.31±0.10)以及SOD(2.28±0.02)和GPx活性(29.51±0.39)，在hsa-miR-199a-3p mimics組中，氧化應(yīng)激的細胞內(nèi)GSH濃度(3.02±0.27)以及SOD(1.82±0.06)和GPx活性(27.86±0.10)和hsa-miR-199b-3p mimics組中的應(yīng)激后的細胞內(nèi)GSH濃度(4.43±0.05)以及SOD(1.62±0.02)和GPx活性(25.44±0.19)均顯著降低(P<0.01, Fig. 4B)。CCK-8試驗表明，過表達hsa-miR-199a-3p和hsa-miR-199b-3p后，細胞增殖能力降低(P<0.05, Fig. 4C)。結(jié)果表明，hsa-miR-199-3p可能通過SLC7A11調(diào)控氧化應(yīng)激細胞增殖及氧化還原狀態(tài)。

為驗證hsa-miR-199-3p與SLC7A11之間的靶向調(diào)控關(guān)系，在螢火蟲熒光素酶的后面插入SLC7A11的3′ UTR序列，構(gòu)建SLC7A11野生型和突變型載體，合成hsa-miR-199-3p和hsa-miR-NC mimics，以SLC7A11-WT+hsa-miR-NC mimics、SLC7A11-WT+hsa-miR-199-3p mimics、SLC7A11-MUT+hsa-miR-NC mimics及SLC7A11-MUT+hsa-miR-199-3p mimics分組，進行共轉(zhuǎn)染實驗。由于SLC7A11中的結(jié)合序列對熒光值的影響較大，導(dǎo)致在SLC7A11-MUT型中兩組熒光素酶活性比在SLC7A11-WT型中均明顯降低，但是在SLC7A11-WT型中，hsa-miR-199-3p組(6.26±0.74)的熒光素酶活性明顯比hsa-miR-NC組(8.04±0.62)降低(P<0.01)，而在SLC7A11-MUT型中，hsa-miR-199-3p組(6.41±0.39)的熒光素酶活性明顯比hsa-miR-NC組(4.47±0.24)高(P<0.001, Fig. 4D)，證實hsa-miR-199-3p與SLC7A11之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。

Fig.4 Function and mechanism of hsa-miR-199-3p (A) After hsa-miR-199a-3p or hsa-miR-199b-3p were transiently transfected in MG-63 cells, the mRNA expressions of Nrf2 and SLC7A11 were detected by RT-qPCR. (B) After overexpression of hsa-miR-199a-3p and hsa-miR-199b-3p in MG-63 cells, the expression levels of GSH, SOD and GPx were detected. (C) The CCK-8 assay was used to evaluate the proliferation of MG-63 cells with hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b-3p overexpression 24-96 hours post transfection. (D) Groups by SLC7A11-WT+hsa-miR-NC mimics, SLC7A11-WT+hsa-miR-199-3p mimic, SLC7A11-MUT+hsa-miR-NC mimics and SLC7A11-MUT+hsa-miR-199-3p mimics were used for cotransfection and luciferase activity was detected. Values are the mean ±SD of three determinations from separate experiments.* means P<0.05,** means P<0.01,*** means P<0.001,**** means P<0.0001

3 討論

研究報道，circRNA產(chǎn)生于細胞核，經(jīng)過特定的剪切修飾形成環(huán)狀RNA出核，在胞質(zhì)中參與細胞生長、分化以及衰老等過程[16]，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[17]。circRNA可作為競爭內(nèi)源性RNA (competing endogenous RNAs, ceRNA)與miRNA結(jié)合形成海綿吸附體，影響后者調(diào)控靶基因的表達，抑制翻譯或mRNA降解[18]。近年來，越來越多的研究表明，circRNA與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。例如，circNCX1、circNFIX、circRNA_000203及circRNA_010567在缺血性心肌病中的研究[19-22]，circHIPK3和cZNF609在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能的作用[23, 24]，circ-PRKCB在腸缺血再灌注損傷中的作用[25]、circPRKCI在氧化應(yīng)激下的神經(jīng)元損傷作用[26]以及circRSU1通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激在骨關(guān)節(jié)炎進展中的新作用[27]等。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11，也稱xCT，近年來受到學(xué)者廣泛關(guān)注，但是對于調(diào)控SLC7A11的circRNA相關(guān)研究較為少見。

本研究以0.3 mmol/L H2O2構(gòu)建氧化應(yīng)激細胞模型，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0087354與細胞氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。通過轉(zhuǎn)染hsa_circ_0087354后，檢測氧化應(yīng)激的MG-63細胞內(nèi)ROS1與SOD1基因表達、GPx和SOD酶活性以及GSH濃度，證實了hsa_circ_0087354具有降低細胞氧化應(yīng)激作用。Starbase生物信息預(yù)測表明，hsa_circ_00087354的3′UTR存在hsa-miR-199-3p的結(jié)合位點。MiR-199是一個高度保守的miRNA家族，由miR-199a和miR-199b組成，成熟的miR-199在維持正常穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)疾病發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。此外，Targetscan預(yù)測提示，在SLC7A11的3′UTR存在hsa-miR-199-3p的結(jié)合位點[29-32]。SLC7A11主要參與氧化還原狀態(tài)、鐵死亡和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)。主要功能是介導(dǎo)細胞攝取胱氨酸，維持細胞內(nèi)GSH水平；同時具有維持細胞胱氨酸和半胱氨酸的氧化還原平衡[33]。最后，通過雙熒光素酶試驗證實了hsa-miR-199-3p與hsa_circ_00087354和SLC7A11之間靶向調(diào)控關(guān)系。Hsa_circ_0087354作為ceRNA，與hsa-miR-199-3p形成海綿吸附體，調(diào)控靶基因SLC7A11的轉(zhuǎn)錄，促進SLC7A11的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，使細胞內(nèi)GSH生成增多(Fig. 5)，從而消除細胞內(nèi)積聚的ROS，降低MG-63細胞的氧化應(yīng)激。

Fig.5 Graphical abstract of how hsa_circ_00087354 regulates redox state via SLC7A11 by sponging hsa-miR-199-3p in MG-63 cells The excessive ROS induced high expression of hsa_circ_0087354 in the nucleus. Hsa_circ_0087354 inhibited the transcription and translation of SLC7A11 by sponging hsa-miR-199-3p in cells, resulting in an increase in intracellular GSH concentration, eliminating excess ROS produced by the cell, and alleviating oxidative stress state of cells

此外，有證據(jù)表明，Nrf2是介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)SLC7A11的表達，進而影響GSH代謝[34]。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-related protein 1,KEAP1)的半胱氨酸殘基的氧化，降低KEAP1-Cullin3泛素連接酶復(fù)合物對Nrf2的降解；而后穩(wěn)定的Nrf2轉(zhuǎn)位到細胞核，與基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements，ARE)結(jié)合，并調(diào)節(jié)一系列與抗氧化反應(yīng)和細胞氧化還原維持相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括SLC7A11和SOD等相關(guān)基因[35, 36]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達hsa_circ_0087354和hsa-miR-199-3p后，SLC7A11的表達顯著改變，同時在過表達hsa_circ_0087354和hsa-miR-199a-3p后，Nrf2的基因表達顯著改變。但是，在過表達hsa-miR-199b-3p后，Nrf2的基因表達無明顯變化，表明hsa-miR-199-3p的兩種基因分型對Nrf2的調(diào)節(jié)可能存在更復(fù)雜的機制，這還有待進一步探究。

隨著牙種植技術(shù)的不斷進步及人們對牙體缺損修復(fù)要求的不斷提高，牙種植修復(fù)已經(jīng)成為目前臨床上修復(fù)牙列缺失和牙體缺失首選的治療方法之一。牙種植修復(fù)更加符合牙齒的生理形態(tài)與功能標(biāo)準(zhǔn)，達到更加舒適與美觀的效果[37]。骨結(jié)合是牙種植修復(fù)成功的關(guān)鍵[38]，因此足夠的三維骨量以及適宜的骨密度，能夠為種植體的短期成骨及遠期成功率提供保障和支持。當(dāng)前，種植修復(fù)的適應(yīng)癥在不斷擴大，老年人、高血壓、糖尿病、牙周炎患者已經(jīng)不是牙種植手術(shù)的絕對禁忌癥；而且其種植需求也在不斷增加。但是這類患者體內(nèi)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致其種植手術(shù)有更高的風(fēng)險。已有研究表明，機體氧化還原狀態(tài)與種植體骨結(jié)合密切相關(guān)[39]。也有研究發(fā)現(xiàn)，早期種植失敗通常歸因于創(chuàng)傷愈合不良，阻礙或阻止骨結(jié)合；晚期種植失敗通常是由于咬合(生物力學(xué))過載或種植體周圍炎[40]。因此，氧化應(yīng)激對于牙種植體的成功有重要影響。

本文的前期研究發(fā)現(xiàn)，在MG-63細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)中，對可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的hsa_circ_00087354進行了深入研究，通過構(gòu)建過表達hsa_circ_0087354質(zhì)粒和ctrl質(zhì)粒脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法，明確hsa_circ_00087354在MG-63細胞中對于氧化應(yīng)激相關(guān)基因及對細胞氧化還原功能的作用，并且通過RT-PCR以及雙熒光素酶實驗驗證了hsa_circ_00087354通過與hsa-miR-199-3p競爭結(jié)合，作用于靶基因SLC7A11的作用途徑。circRNA通過在轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)修飾等多個層面調(diào)控多個下游基因的表達，抑制氧化應(yīng)激的級聯(lián)瀑布效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)證實的hsa_circ_00087354對于MG-63細胞的作用及機制，有望通過精準(zhǔn)靶向治療以及牙種植體的表面修飾，促進種植體早期骨結(jié)合，提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下種植體的短期成功率及遠期效果，為牙種植體的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。