mESC衍生內(nèi)皮祖細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞促傷口愈合

陳鳳嬌， 左朝艷， 呂佳薈， 楊 影， 彭 倩，楊 柳， 陸 瑩， 丁 潔*

(1)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴陽 550025；2)中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所， 上海 200031；3)貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室， 貴陽 550025)

皮膚是哺乳動物感知外界刺激的第一道防線，也是最容易受傷的器官[1]。燒傷、燙傷和機械損傷等原因造成的皮膚傷口若未得到及時有效的治療，通常引起感染[2]、休克[3]、脂肪栓塞綜合征[4]、應(yīng)激性潰瘍[5]、凝血功能障礙和器官功能障礙[6]等創(chuàng)傷并發(fā)癥，從而導(dǎo)致社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)增加和生活質(zhì)量下降。因此，關(guān)注皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的組織完整性和功能適應(yīng)性具有重要意義。

傷口的愈合在很大程度上取決于皮膚組織的血管是否被完整修復(fù)，足夠的血流量可以向創(chuàng)傷處運輸促炎因子和氧氣[7]，有效的炎性細(xì)胞募集和炎癥介質(zhì)釋放有助于創(chuàng)周處血管生成啟動[8, 9]。炎癥和血管新生協(xié)同調(diào)節(jié)傷口愈合。兩者重塑不足都會導(dǎo)致組織纖維化，而纖維化反向促進免疫細(xì)胞向脂肪庫遷移，阻礙血管內(nèi)皮細(xì)胞進一步再生[10, 11]。血管內(nèi)皮細(xì)胞以緊密排列的方式形成血管內(nèi)壁光滑面，便于血管內(nèi)外的液體、氣體和大分子物質(zhì)代謝交換；血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞即內(nèi)皮祖細(xì)胞，主要存在于臍血和外周血，其促血管生成功能在多種組織修復(fù)模型中已得到證實[12, 13]。然而，嚴(yán)重缺血的患者外周血細(xì)胞數(shù)量少，內(nèi)皮祖細(xì)胞取材有限，其血管生成能力弱[14]。胚胎干細(xì)胞是血管生物學(xué)中研究血管生成和皮膚血管化的成熟干細(xì)胞庫，具有庫量充足，增殖能力強和免疫原性低等優(yōu)點[15]。利用胚胎干細(xì)胞衍生血管內(nèi)皮細(xì)胞進行創(chuàng)傷修復(fù)治療手段具有較大的應(yīng)用價值，但衍生過程中內(nèi)皮祖細(xì)胞的形成周期未見報道。

本文采用血管內(nèi)皮細(xì)胞因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 進行體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，先篩選出具高表達(dá)的CD133和CD34內(nèi)皮祖細(xì)胞，再將該內(nèi)皮祖細(xì)胞進一步誘導(dǎo)為具有成管和遷移功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞及其誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠創(chuàng)面模型中促愈合情況，在內(nèi)皮祖細(xì)胞的衍生方面尋找新的思路，為組織工程皮膚研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：小鼠胚胎干細(xì)胞(品系：RW.4)購于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫。

主要試劑：胎牛血清(Gbico)，MEM 非必需氨基酸(Gbico)，L-谷氨酰胺(Gbico)，青-鏈霉素(solarbio)，β-巰基乙醇(Sigma)，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gbico)，胰酶(Gbico)，Acctuse酶(Gbico)，Matrigel基質(zhì)膠(BD Biosciences)，CD31(BD Pharmingen)，CD144(Santa Cruz Biotechnology)，LAMA5(Novus Biologicals)，4%多聚甲醛(Biosharp)，CCK-8試劑盒(Dojindo)，Laminnin(Gbico)。

1.2 體外誘導(dǎo)分化內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞

1.2.1 EPC體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)和形態(tài)觀察 加入0.05%含EDTA的胰酶消化mESC，當(dāng)mESC逐漸脫落培養(yǎng)皿底時，用2倍胰酶體積mESC培養(yǎng)液終止消化，輕輕晃動使mESC與MEF完全分離，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，離心800 r/min，3 min，棄上清。用1 mL VEC培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并接入預(yù)鋪明膠6 cm培養(yǎng)皿中，貼壁40 min，棄上清，沿壁加入4 mL VEC培養(yǎng)液，并加入10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF進行誘導(dǎo)，置于37 ℃培養(yǎng)箱，在相差顯微鏡下觀察并記錄0 ～ 5 d誘導(dǎo)EPC (mESC + VEGF + bFGF) 形態(tài)。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖測定 以5×104個/mL的密度將mESC和誘導(dǎo)的EPC的細(xì)胞懸液分別接入96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜，在培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8溶液，充分混合，37 ℃培養(yǎng)箱里孵育4 h，酶標(biāo)儀分析450 nm時的吸光值，計算0 ～ 5 d細(xì)胞的增殖活力。

1.2.3 定量實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測EPC基因表達(dá)量 采用Trizol提取mESC和誘導(dǎo)0 ～ 5 d EPC的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行qRT-PCR擴增，總體系20 μL，包括PowerupUp SYBR Greeen Master Mix 10 μL，上下游引物各1.4 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 6.7 μL。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-Δct進行相對定量，分析0 ～ 5 d的mESC和誘導(dǎo)EPC的祖細(xì)胞標(biāo)志基因CD133 和CD34的表達(dá)情況，篩選出EPC的最佳誘導(dǎo)時間。其引物序列見Table 1。

1.2.4 VEC的體外誘導(dǎo)和形態(tài)鑒定 用acctuse酶消化EPC 1 ～ 2 min，用2倍 acctuse酶體積的VEC培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)輕柔吹打皿底，使誘導(dǎo)的EPC完全脫落，收集至15 μL離心管，離心800 r/min，3 min，棄上清，用1 mL VEC培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以5×104個/孔的細(xì)胞密度接種在經(jīng)Laminin基質(zhì)鋪板的24孔培養(yǎng)板中，用含50 ng/mL VEGF和25 ng/mL bFGF的分化培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)。每天換液，在倒置顯微鏡下觀察并記錄0 ～ 7 d的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5 RT-PCR檢測mESC、EPC和VEC的標(biāo)志基因表達(dá)水平 分別提取mESC、誘導(dǎo)后EPC和誘導(dǎo)后VEC的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，采用Table 1所列引物進行PCR檢測。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，90 V，40 min，在紫外光下觀察染色條帶并記錄。

Table 1 Primer sequences

1.3 免疫熒光檢測標(biāo)志蛋白質(zhì)表達(dá)率

將分化細(xì)胞培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中細(xì)胞爬片上，分化培養(yǎng)7 d后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，用含0.25% TritonX-100的PBS通透細(xì)胞10 min，含1%BSA的PBST封閉細(xì)胞30 min，一抗(CD31、CD144、LAMA5)4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育1 h，DAPI染核2 min，在載玻片上加入10 μL 抗淬滅劑，指甲油封片。使用熒光共聚焦顯微鏡觀察，并記錄 CD31、CD144、LAMA5的表達(dá)水平。

1.4 Western 印跡檢測標(biāo)志蛋白質(zhì)表達(dá)量

冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)變性并進行SDS-PAGE 1 h ，轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(CD31、CD144、LAMA5)4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育1 h，TBST洗滌3次。隨后，進行化學(xué)發(fā)光顯色并拍照，采用ImageJ 8.0凝膠圖像分析CD31、CD144、LAMA 5的相對表達(dá)量。

1.5 體外管腔形成情況

Matrigel膠在4 ℃冰箱中解凍過夜。實驗前，將200 μL移液槍、200 μL槍頭和24孔培養(yǎng)板在4 ℃冰箱中預(yù)冷30 min。在冰上將Matrigel膠以50 μL/cm2均勻接到24孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中30 min，使其成膠。收集EPC和誘導(dǎo)7 d的VEC，將2×105個/孔的細(xì)胞量接種到鋪有Matrigel膠的24孔培養(yǎng)板，每組實驗設(shè)置5個重復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)，12 h后觀察管腔形成情況。

1.6 遷移能力檢測

收集預(yù)先消化的EPC和誘導(dǎo)7 d的VEC，將4×106個/孔的細(xì)胞量接入6孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，用10 μL移液槍在單層融合的細(xì)胞上劃痕，分別在0 h和24 h記錄細(xì)胞遷移情況。每組實驗至少重復(fù)5次，采用ImageJ 8.0測量遷移距離，并計算遷移率。

1.7 透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、W-P小體

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，將誘導(dǎo)后VEC放入2.5%戊二醛中固定，4 ℃過夜，PBS漂洗3次，1%鋨酸固定，4℃1 h，超純水漂洗3次，2%乙酸鈾酰固定，梯度丙酮依次脫水，浸潤、包埋、聚合后切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾進行雙染色，透射電鏡下觀察分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.8 體內(nèi)功能修復(fù)檢測

1.8.1 創(chuàng)面模型制作和創(chuàng)周注射治療 造模前3 h禁水禁食，將24只8周齡(33～37 g)ICR雄性小鼠分成3組：A組：PBS；B組：EPC；C組：VEC(誘導(dǎo)7 d的EPC)，每組8只。小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥麻醉后，剃除背部毛發(fā)，用0.9%氯化鈉清洗皮膚，碘伏消毒預(yù)處理皮膚區(qū)域，用尖鑷子夾住皮膚，眼科剪減去皮膚全層，以形成1個直徑1.5 cm創(chuàng)面，碘伏消毒創(chuàng)周，不包扎，并在創(chuàng)周處注射200 μL細(xì)胞懸液(2×106個)或PBS，待動物自然清醒后單籠喂養(yǎng)，每d觀察創(chuàng)面變化。

1.8.2 傷口面積分析 分別在術(shù)后0、3、5、7、9、11和14 d記錄創(chuàng)面愈合情況，使用ImageJ 8.0計算

1.8.3 組織學(xué)評價 麻醉小鼠后，取新生皮膚組織和遠(yuǎn)離傷口處組織，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片后，在光鏡下觀察皮膚組織病理變化。每張切片采集5個視野的圖像。

1.8.4 炎癥細(xì)胞差異分析 在光學(xué)顯微鏡下觀察病理切片，隨機取5個視野，計算每個視野的炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)數(shù)量，比較各組創(chuàng)周組織和正常組織的炎癥反應(yīng)情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 分化第 3 d的祖細(xì)胞被鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞

mESC在經(jīng)絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (mouse embryonic fibroblasts, MEF) 上呈集落狀生長，形成圓形或橢圓形的克隆。細(xì)胞排列緊密，表面光滑，邊緣清晰(見Fig.1A)。mESC通過胰酶消化后被接入6 cm培養(yǎng)皿中，并在10 ng/mLVEGF和5 ng/mL bFGF的誘導(dǎo)條件下生長。3 d后，細(xì)胞體積增大，呈現(xiàn)梭形，增殖速度加快，鑲嵌融合生長，未見細(xì)胞重疊現(xiàn)象。密集生長部分呈現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞典型的三角形、梭形或“鋪路石”樣狀態(tài)，形態(tài)圓潤，折光性好(見Fig.1B)。

針對Fig.1中細(xì)胞明顯的形態(tài)變化，以mESC為對照，檢測0～5 d的祖細(xì)胞CCK-8細(xì)胞活性-增殖能力。結(jié)果顯示，mESC增殖能力相對較低，經(jīng)VEGF和bFGF誘導(dǎo)后細(xì)胞的活力在0～4 d內(nèi)逐漸增加。其中，第3 d EPC的OD值(1.44 ± 0.07)在對數(shù)生長期(Fig.2A)；同時，EPC的標(biāo)志基因CD133(相對表達(dá)量0.88 ± 0.04)和CD34(相對表達(dá)量2.12 ± 0.02)在第3 d的表達(dá)量最高(Fig.2C)，與mESC組相比，具有顯著性差異 (P< 0.01)。

Fig.1 Morphological detection of mESCs and EPCs (A) mESCs were typically round or oval clones, scale bar 100 μm. (B) Cells on day 3 of EPC differentiation showed spindle, triangular, and irregular polygonal mosaic patterns, scale bar 100 μm

Fig.2 Proliferation capacity and gene expression of EPC (A, B) The proliferative capacity and viability of mESC progenitor cell differentiation within 5 days. mESCs were used as controls. O.D. values were presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01, 0.01<*P < 0.05. (C) qRT-PCR analyses for the expression of markers specific for CD34 and CD133 of EPC within 5 days. Expression values were relative to those of GAPDH and are presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01

上述研究結(jié)果顯示：誘導(dǎo)3 d的祖細(xì)胞的活性高、增殖能力強、標(biāo)志基因高表達(dá)。因此，選擇該階段的細(xì)胞作為內(nèi)皮祖細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞

2.2.1 EPC在分化7 d后具有VEC的形態(tài) EPC通過50 ng/mL VEGF和25 ng/mL bFGF體外誘導(dǎo)7 d的細(xì)胞形態(tài)見Fig.3A所示。細(xì)胞貼壁生長后，細(xì)胞匯集成單層細(xì)胞，有接觸抑制現(xiàn)象，未見重疊生長，細(xì)胞集落出現(xiàn)，呈現(xiàn)短梭狀、橢圓狀、三角狀及鵝卵石狀，細(xì)胞立體程度增加，折光性強，細(xì)胞質(zhì)飽滿，核明顯。結(jié)果正如Fig.3B所示，中間部分細(xì)胞密集程度大，呈現(xiàn)扁平狀，“鋪路石”樣顯著，邊緣細(xì)胞呈現(xiàn)多角狀、三角形、梭形等不規(guī)則形態(tài)，有微絨毛突起，這些表征符合血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特征。

Fig.3 Morphological detection of EPC on day 7 of endothelial differentiation (A) EPCs induced by VEGF and bFGF on days 7 were "paving stones" and chromatin was markedly increased, with the morphological characteristics of VECs, scale bar 100 μm. (B) Microvilli on the cell membrane were commonly seen, scale bar 100 μm

2.2.2 EPC在分化7 d后高表達(dá)VEC的標(biāo)記物 采用免疫熒光染色分別檢測mESC、EPC和誘導(dǎo)后VEC的內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原表達(dá)，結(jié)果如Fig.4所示。誘導(dǎo)獲得的VEC的內(nèi)皮譜系標(biāo)志抗原CD31、CD144陽性高表達(dá)，雙標(biāo)率為80.33 ± 1.45%，而EPC陽性弱表達(dá)(雙標(biāo)率1.91 ± 0.50%)，mESC陰性表達(dá)；同時，VEC的血管生成相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)AMA5陽性高表達(dá)，CD31和LAMA5雙標(biāo)率為83.33 ± 1.20%，而EPC陽性弱表達(dá)(雙標(biāo)率3.88 ± 0.79%)，mESC陰性表達(dá)。由此，誘導(dǎo)獲得的VEC具有較高標(biāo)記物陽性率。結(jié)果表明，EPC具有深度內(nèi)皮化潛能。

Fig.4 Immunofluorescence staining (A) Co-expression of VEC-specific antigen CD31 (green) and CD144 (red) in each group, scale bar 20 μm. (B) Co-expression of VEC-specific antigen CD31 (green) and LAMA5 (red) in each group, scale bar 20 μm. (C) The percentage of CD31 + CD144 or CD31 + LAMA5 double-positive cells in the total cell population of VECs was much higher than mESCs and EPCs. VEC: EPC on day 7 of endothelial differentiation. Expression values were presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01

通過RT-PCR檢測mESC、EPC和誘導(dǎo)獲得的VEC的標(biāo)志基因，并通過Western印跡檢測VEC特異性抗原的表達(dá)。結(jié)果顯示，mESC和EPC均表達(dá)干性基因Sox2、Klf4、Nanog和Oct4，mESC的表達(dá)水平明顯高于EPC，誘導(dǎo)獲得的VEC高表達(dá)VEC標(biāo)志基因CD31、CD144、LAMA5、vWF、Tek和KDR(Fig.5A)。同時，mESC和EPC表達(dá)VEC標(biāo)志基因CD31和LAMA5，但無相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)(Fig.5B)，VEC的標(biāo)志蛋白質(zhì)CD31、CD144和LAMA5僅在誘導(dǎo)獲得的VEC中高表達(dá)，相對表達(dá)量分別為CD31(1.07 ± 0.032)、CD144(0.60 ± 0.02)和LAMA5(0.70 ± 0.02)(Fig.5C)，結(jié)果均有顯著性差異。因此，相比mESC和EPC，誘導(dǎo)獲得的VEC高表達(dá)VEC標(biāo)志基因和蛋白質(zhì)。

Fig.5 Analysis of specific genes and protein expression (A) RT-PCR analyses for the expression of markers specific for the mESC (Sox2、Klf4、Nanog and Oct4), EPC (CD133 and CD34) and VEC (CD31, CD144, LAMA5, vWF, Tek and KDR). VEC: EPC on day 7 of endothelial differentiation. (B, C) The expression of CD31, CD144, LAMA5 in each group examined by Western blotting. VEC: EPC on day 7 of endothelial differentiation. Expression values were relative to those of GAPDH and are presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01

2.2.3 EPC在分化7 d后具有較好的成管、遷移和W-P小體形成能力 將不同濃度(2×105個/孔、3×105個/孔、4×105個/孔)的誘導(dǎo)獲得的VEC懸液接種到鋪有Matrigel膠的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，在接板12 h后，誘導(dǎo)獲得的VEC具有良好的管腔形成能力(Fig.6A)，且接種濃度為3×105個/孔實驗組血管總分支長度(1.14×104± 0.13)和分支節(jié)點數(shù)(174.70 ± 3.71)均大于2×105個/孔和4×105個/孔的2個實驗組(Fig.6B)，以3×105個/孔的密度接種可獲得較大的管腔形成率；為了進一步確認(rèn)誘導(dǎo)前后細(xì)胞的管腔形成能力變化，以EPC為對照，接種3×105個/孔密度的EPC和誘導(dǎo)獲得的VEC到Matrigel膠上。從Fig.6C可知，EPC呈單細(xì)胞狀分布，極少量細(xì)胞連接成短線狀，無管腔形成能力；誘導(dǎo)獲得的VEC可見明顯的交叉點與管腔，呈現(xiàn)出相對完整的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

Fig.6 Comparison of lumen formation (A, B) Different total segment lengths and numbers of branch junctions were formed by different density of EPCs on days 7 of endothelial differentiation (VECs), scale bar 100 μm. Expression values were presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01. (C) EPC on days 7 of endothelial differentiation (VEC) showed good tubulogenesis, but EPC did not, scale bar 100 μm

內(nèi)皮細(xì)胞的定向遷移在血管生成的開始發(fā)揮重要的作用。在確認(rèn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有較好的管腔形成能力前提下，本文以EPC為對照，通過劃痕檢測誘導(dǎo)獲得的VEC的遷移能力，結(jié)果正如Fig.7A所示，劃痕24 h后，誘導(dǎo)獲得的VEC具有較好的遷移功能，細(xì)胞內(nèi)皮化誘導(dǎo)7 d后的遷移能力(遷移率55.22 ± 193.30%)顯著地大于EPC(遷移率14.65 ± 45.44%)，該結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。

Fig.7 Comparison of migration capacity (A, B) The mobility of EPC on days 7 of endothelial differentiation (VEC) was significantly higher than that EPC after 24 hours of scratch, scale bar 100 μm. Expression values were presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01

確定誘導(dǎo)后VEC的表型功能后，進一步通過透射電鏡檢測該細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果正如Fig.8所示。誘導(dǎo)獲得的VEC呈現(xiàn)出內(nèi)皮樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點，細(xì)胞膜表面存在少量微絨毛，細(xì)胞基質(zhì)中存在大量的線粒體、高爾基復(fù)合體和吞飲小泡，基底膜及細(xì)胞頂端存在大量小泡，胞漿中可見小運輸泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及多聚核糖體散在分布于胞質(zhì)中，在高爾基復(fù)合體附近的細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域能清晰可見具有儲存vWF功能的W-P小體。

Fig.8 Intracellular structures of EPC on days 7 of endothelial differentiation (A) Complete intracellular structures, scale bar 5.0 μm. (B) Localized intracellular structures, a: rough endoplasmic reticulum, b: Golgi complex, c: swallowing vesicle, NU: nucleus, black arrow: W-P body, scale bar 1.0 μm. (C) Cross-section of the W-P body, scale bar 2.0 μm. (D) Longitudinal section of the W-P body, scale bar 1.0 um. (E) W-P bodies, scale bar 1.0 μm

綜上所述，本文采取體外兩步誘導(dǎo)法，先將小鼠胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為內(nèi)皮祖細(xì)胞，篩選出誘導(dǎo)率最好的時間，將內(nèi)皮祖細(xì)胞進行重接板和深度內(nèi)皮化誘導(dǎo)。研究結(jié)果表明，mESC-EPC在50 ng/mL VEGF和25 ng/mL bFGF的條件下，誘導(dǎo)7 d可獲得血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，且該細(xì)胞的血管生成程序被激活，促血管生成能力在后續(xù)體內(nèi)實驗中得到驗證。

2.3 誘導(dǎo)后的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞促進小鼠皮膚傷口愈合

2.3.1 VEC可促進傷口愈合和血管生成 為了驗證體外誘導(dǎo)的細(xì)胞是否具有促血管生成及皮膚修復(fù)實效，本文進行了活體小鼠模型體內(nèi)檢測。分別用PBS、EPC和VEC治療傷口邊緣，結(jié)果正如Fig.9A所示。術(shù)后第5 d，3個組的傷口均有結(jié)痂現(xiàn)象并開始愈合；第9 d時，VEC干預(yù)傷口的表皮層幾乎愈合(相對愈合率97.43 ± 127.70%)；第14 d時，EPC干預(yù)的愈合率達(dá)到95.57 ± 83.73%。同時，VEC組的傷口完全愈合(相對愈合率100.00 ± 0.00%)，說明EPC和VEC均能顯著促進傷口愈合。從解剖學(xué)角度看，VEC組新生皮膚處有大量的微血管生成(紅色)，而EPC組不明顯。由Fig.9B可知，VEC組的創(chuàng)面愈合率在各個時間點均明顯高于PBS組和EPC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。

Fig.9 Skin wound healing after surgery at different time points (A) Compared with PBS, both EPC and VEC can promote wound healing after 14 days. VEC promoted extensive angiogenesis at the perioperative stage. (B) The degree of relative wound healing varied with different treatment conditions: VEC > EPC > PBS. Expression values were presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01

2.3.2 VEC促進皮膚創(chuàng)面的組織再生 為了進一步研究PBS、EPC和VEC對小鼠創(chuàng)口愈合程度的影響，本文對小鼠創(chuàng)傷治療14 d后的病理切片進行HE染色，觀察各組的病理學(xué)變化。結(jié)果正如Fig.10所示，PBS對照組、EPC組和VEC組均有愈合的標(biāo)志出現(xiàn)，但愈合情況有差異，PBS創(chuàng)周組：組織結(jié)構(gòu)松散，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象和血管生成較少(Fig.10A)；EPC創(chuàng)周組：組織結(jié)構(gòu)較為致密，有數(shù)量較多的炎性細(xì)胞浸潤，可見少量新生肉芽組織(Fig.10B)；VEC創(chuàng)周組：膠原纖維排列緊密且有方向性，成纖維細(xì)胞數(shù)目多，大量新生毛囊和新生血管增多，且血管較粗大，不同種類的炎性細(xì)胞大量浸潤(Fig.10C)；而3個遠(yuǎn)離創(chuàng)周組僅有少量炎性細(xì)胞和血管生成(Fig.10A1、B1、C1)。

Fig.10 Pathological observation of trauma treatment after 14 days The abundance of new cells in wound tissues was higher than that in normal tissues in each group, scale bar 100 μm. Note: Black arrow = hair follicle cell; Red arrow = new blood vessel; Dark blue arrow = inflammatory cell; Green arrow = collagen fiber; Light blue arrow = muscle tissue

由Table 2可知，VEC創(chuàng)周組的血管生成數(shù)為50.67 ± 1.20，顯著高于EPC創(chuàng)周組 (血管生成數(shù)32.33 ± 1.45) 和PBS創(chuàng)周組 (血管生成數(shù)17.67 ± 0.88)；3個遠(yuǎn)離創(chuàng)周組的血管生成數(shù)均低于創(chuàng)周處，且組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，故VEC可提高創(chuàng)傷組織的血管生成率。

Table 2 Comparison of the number of angiogenesis in different treatment groups

2.3.3 VEC促進皮膚創(chuàng)面的炎性細(xì)胞生成 在HE染色的基礎(chǔ)上，通過對小鼠創(chuàng)傷治療14 d后的組織學(xué)觀察，本文進行了各組的炎癥反應(yīng)評估。從Fig.11中能清楚地觀察到各組創(chuàng)周處的炎性細(xì)胞的個數(shù)不同，差異趨勢為PBS < EPC < VEC，與PBS組創(chuàng)周處相比，EPC組(細(xì)胞數(shù)184.30 ± 10.48)和VEC組(細(xì)胞數(shù)391.30 ± 7.69)創(chuàng)周處炎性細(xì)胞的數(shù)目明顯增多，均有顯著性差異(P< 0.01)。結(jié)果闡明，EPC和VEC均能促進炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)的生成，且VEC促炎作用更大。此外，PBS組、EPC組和VEC組3組遠(yuǎn)離創(chuàng)周處炎性細(xì)胞數(shù)目差異不大，且炎性細(xì)胞的數(shù)量明顯均少于對應(yīng)創(chuàng)周處的數(shù)量。由此可見，EPC、VEC均起到促進創(chuàng)周處的炎癥反應(yīng)的作用，加速了傷口愈合。

Fig.11 Inflammatory cell formation of trauma treatment after 14 days (A, B) The number of new inflammatory cells of the wound tissues increased sequentially: PBS < EPC < VEC, but the rate of inflammatory cell generation in the normal tissues is not significant different, scale bar 20 μm. Expression values were presented as the mean ± SD (n = 5).** P < 0.01

3 討論

傷口愈合是通過連續(xù)和協(xié)同的重塑階段進行的，包括止血、收縮、炎癥、上皮化、毛囊再生和肌底恢復(fù)等[16, 17]，這一系列過程受生長因子和細(xì)胞因子的復(fù)雜環(huán)境調(diào)控[18, 19]。在傷口更新和修復(fù)的生理病理過程中，血管生成是皮膚早期上皮化的關(guān)鍵步驟，而血管的再生依賴于多種炎癥因子、血管生長因子和其他細(xì)胞因子的表達(dá)[20-22]，促炎因子增加血管通透性，從而促進免疫細(xì)胞向受損組織外滲[23]。

本文證實了可在體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為活力處于對數(shù)生長期且高表達(dá)CD34和CD133的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并進一步誘導(dǎo)分化為典型鋪路石樣和良好折光度的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，EPC誘導(dǎo)7 d后的細(xì)胞表達(dá)VEC標(biāo)志基因和蛋白質(zhì)；同時，在內(nèi)皮再生的功能性方面，維持血管管腔的完整度和血管的遷移張力是至關(guān)重要的。本文通過體外誘導(dǎo)獲得的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞具有較好的遷移和成管能力，透射電鏡下觀察到的W-P小體進一步驗證了其具備VEC的結(jié)構(gòu)完整性和功能性。本文結(jié)果得出通過兩步誘導(dǎo)法，成功獲得了血管內(nèi)皮樣細(xì)胞。值得注意的是，適當(dāng)濃度的血管內(nèi)皮細(xì)胞可以提高同一環(huán)境下的管腔形成率。這提示我們，可以根據(jù)調(diào)整血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)因子的濃度改善生理微環(huán)境狀況，以找到最佳的傷口治療方式。此外，通過EPC-VEC移植入小鼠體內(nèi)，創(chuàng)傷修復(fù)模型的血管生成增多，炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，出現(xiàn)大量的新生膠原纖維和毛囊。因此，EPC來源的VEC促進創(chuàng)周組織的血管重塑和炎癥反應(yīng)，協(xié)同調(diào)節(jié)炎癥和血管生成可提高傷口愈合率。

mESC作為一種強大的干細(xì)胞庫，被廣泛應(yīng)用于人類疾病建模、基因工程、譜系特異性、干細(xì)胞治療和組織再生的研究[24]，利用干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，可以將mESC分化為心肌細(xì)胞[25]、星形膠質(zhì)細(xì)胞[26]和血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞，但分化效率因復(fù)雜的誘導(dǎo)方法和信號分子變化而不同。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞分泌活躍和分布廣泛的因子，在血管生成、血管化和分化過程中發(fā)揮著重要作用[27]。本文通過2個濃度的VEGF進行兩步法誘導(dǎo)mESC分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，在祖細(xì)胞階段的差異貼壁法將狀態(tài)好、貼壁快的細(xì)胞篩選出來，這種方法在內(nèi)皮化中也有應(yīng)用[28]。在VEC分化階段，將未分化的小細(xì)胞團進行了二次信號刺激，分步誘導(dǎo)法增大了分化效率，提高了內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，也縮短了內(nèi)皮細(xì)胞的成熟時間，避免了細(xì)胞長時間在同一環(huán)境下生長所引起的旁分泌抑制效應(yīng)。mESC衍生的EPC可以高效地分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，體外誘導(dǎo)獲得的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞為有限的自體內(nèi)皮細(xì)胞源取材和原代內(nèi)皮細(xì)胞易老化的問題提供了新思路，也為血管組織工程和細(xì)胞移植治療缺血性疾病篩選合適的種子細(xì)胞提供了新的可能性。

需要注意的是，在血管內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生過程中，細(xì)胞仍表達(dá)少量的祖細(xì)胞基因。在后期研究中，需要進一步確定內(nèi)皮化初期和后期的功能性差異。目前，對于炎性細(xì)胞的種類數(shù)量和血管生成-炎癥互作的關(guān)聯(lián)因子尚未得到全面地確認(rèn)和分析，胞內(nèi)血管生成相關(guān)分子的表達(dá)和血管周圍胞間負(fù)向信號通訊對于傷口愈合的作用機制亟待進一步研究，將基于干細(xì)胞的治療性血管生成轉(zhuǎn)化為有效的臨床應(yīng)用值得探索。

致謝：珠海市金灣區(qū)三灶鎮(zhèn)中心小學(xué)陸婷婷老師對本文圖片處理提供悉心指導(dǎo)，在此表示由衷的感謝。