Wnt/β-catenin信號(hào)通路在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的系統(tǒng)性硬化癥小鼠模型血管重塑中的作用

彭一琳， 夏 強(qiáng)， 劉 韌， 王 燕， 吳 銳

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 南昌 330006)

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種以免疫系統(tǒng)的異常激活、血管受損以及新生血管生成和重塑異常，最終導(dǎo)致皮膚和多臟器廣泛纖維化為特征的自身免疫性疾病[1]。該病的全球患病率在21/100萬(wàn)～600/100萬(wàn)范圍內(nèi)，發(fā)病率為8/100萬(wàn)～56/100萬(wàn)[2]。廣泛的血管病變及全身多臟器的進(jìn)行性纖維化逐漸導(dǎo)致器官正常結(jié)構(gòu)和功能的喪失，這是系統(tǒng)性硬化癥高致死率的重要原因[3]。雖然關(guān)于系統(tǒng)性硬化癥的研究日益增多，但其發(fā)病機(jī)制仍尚不清楚。目前，臨床上仍然缺乏有效藥物控制SSc的疾病進(jìn)展。因此，深入研究系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制，找到有效治療靶點(diǎn)，具有重要臨床意義。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為一種高度保守的經(jīng)典信號(hào)通路，分為經(jīng)典Wnt途徑(canonical pathway)、非典型平面細(xì)胞極性途徑(planarcell polarity pathway)和非經(jīng)典Wnt信號(hào)/鈣通路(Wnt/Ca2+pathway)。其在發(fā)育過(guò)程參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，控制著發(fā)育的各個(gè)方面，包括細(xì)胞增殖、纖維化、凋亡、細(xì)胞遷移和發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞極性以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多功能性[4]。近年來(lái)證實(shí)，Wnt通路在疾病纖維化及血管增殖中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，Wnt通路可以和TGF-β通路相互作用，共同促進(jìn)SSc纖維化的發(fā)生發(fā)展[3,5-7]，但Wnt通路在SSc的血管病變中的作用尚無(wú)報(bào)道。因此，本文從SSc皮膚微血管Wnt通路入手，探討Wnt通路在SSc血管病變中的作用，以期為系統(tǒng)性硬化癥血管病變提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：賽默飛高速冷凍離心機(jī)-Legend Micro21R；賽默飛智能凝膠電泳系統(tǒng)-iBrightTMCL1000；尼康倒置顯微鏡-Eclipse CI-L；美國(guó)伯樂(lè)Q-PCR儀-CFX96；Servicebio組織碾磨機(jī)-KGA317。主要試劑：Solarbio品牌的博來(lái)霉素(125 mg/1.25 mL)；Proteintech品牌的β-聯(lián)蛋白(β-catenin)、平滑肌(smooth muscle)、Wnt5A、col1A1一抗抗體；Proteintech品牌的山羊抗兔IgG HRP、山羊抗小鼠IgG HRP二抗；Invitrogen的ECL發(fā)光顯影液；Proteintech品牌的DAB顯色液和檸檬酸鈉緩沖液；中杉金橋的免疫組化試劑盒；凱基生物的全蛋白質(zhì)提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒等。

1.2 博來(lái)霉素配制與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方案

博來(lái)霉素工作液配制：用移液槍吸取博來(lái)霉素 100 μL(125 mg/1.25 mL)原液于10 mL PBS中混勻，配制成濃度為1 mg/mL的博來(lái)霉素工作液，放置于4 ℃保存。原液置于冰箱-20 ℃保存。

18只Balb/C小鼠：6～8周齡，雌性，SPF級(jí)，購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體重約20±2 g，在南昌大學(xué)動(dòng)物科部飼養(yǎng)，環(huán)境適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)要求，通風(fēng)性好，光照交替，溫度22±2 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，進(jìn)食水與食物每日更換，每日清洗籠具。將小鼠按數(shù)字標(biāo)記隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為對(duì)照組、模型組、治療組。

對(duì)照組：用1 mL注射器在小鼠背部皮下注射無(wú)菌PBS 100 μL，前4次依次注射于方框的四角，第5次注射于方框中心，以此循環(huán)28 d，每周觀察小鼠皮下注射部位皮膚變化。

模型組：連續(xù)用1 mL注射器在小鼠背部皮下注射濃度為1 mg/mL的博來(lái)霉素溶液100 μL 28 d，注射方式同上，每周觀察小鼠皮下注射部位皮膚變化。

治療組：連續(xù)用1 mL注射器在小鼠背部皮下注射濃度為1 mg/mL的博來(lái)霉素溶液100 μL 28 d，同時(shí)腹膜內(nèi)注射iCRT3(5 mg/kg·d)，皮下注射方式同上，每周觀察小鼠皮下注射部位皮膚變化。

1.3 小鼠眼球采血及血清分離

抓取小鼠雙耳及頸后皮膚，固定小鼠尾部。將小鼠左側(cè)前肢固定于心臟部位并輕柔按壓小鼠腹部及取血側(cè)眼部皮膚，使眼球充血突出，用彎頭鑷夾取眼球，迅速摘取眼球側(cè)置于50 mL離心管上。輕柔按壓小鼠心血管部位，以加快心泵血速度。將所取血液標(biāo)本置于37 ℃水浴鍋中1 h，再置于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。觀察到血液凝固后，于4 000 r/min 離心10 min，取上清于干凈的EP管中，分裝后保存于-20 ℃，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)(避免反復(fù)凍融)。

1.4 小鼠處死及標(biāo)本采集

最后1次給藥后第2 d，剔除目標(biāo)區(qū)域皮膚組織毛發(fā)并進(jìn)行眼球取血，采用頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精消毒3次，移入超凈臺(tái)中并固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，剪取適量皮膚組織，取部分皮膚組織置于4%多聚甲醛中固定進(jìn)行組織學(xué)鑒定，剩余皮膚組織進(jìn)行微血管提取，分裝于5 mL EP管中于-80 ℃保存，以備后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物組織蛋白質(zhì)及RNA提取。

1.5 小鼠皮膚微血管提取方法

將所得新鮮皮膚組織置于含預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷PBS清洗3次，用無(wú)菌眼科剪將所取標(biāo)本鋪平，小心剔除皮下脂肪層，將皮膚組織剪成1 mm×1 mm大小，并移至15 mL離心管中。加入5 mL 0.1% I型膠原酶，37 ℃震搖消化1 h后，于4 ℃，3 000 r/min 離心10 min。棄上清，加入5 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，3 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入5 mL PBS重懸，經(jīng)100 μm尼龍膜濾網(wǎng)過(guò)濾組織上清液，用5 mL PBS加壓沖洗3次，將尼龍膜上的微血管片段沖洗收集；4 ℃，3 000 r/min 離心5 min后棄上清，加入15%葡聚糖T500溶解混勻，再經(jīng)25 000 r/min 離心5 min后棄上清，加入20%葡聚糖T500溶解混勻，25 000 r/min 離心5 min，收集沉淀物分裝置于-80 ℃保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 HE染色

將固定的組織通過(guò)包埋、切片、干燥等步驟制得組織切片，將玻片置于70 ℃烤箱中烘烤60 min(融蠟)，再將玻片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置10 min(脫蠟)；玻片置于100%酒精、95%酒精、85%酒精各5 min，再用自來(lái)水緩慢沖洗3次，1 min/次(水化)；再將玻片放置于蘇木素染色約40 s，用自來(lái)水緩慢沖洗3次，2 min/次；將玻片放入1%鹽酸酒精分化3 s(反復(fù)提浸3次，1 s/次)，自來(lái)水緩慢沖洗3次，將玻片置于碳酸鋰中返藍(lán)2 s，再將玻片置于流水中漂洗15 min，用伊紅溶液染色約5 min，玻片置于85%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精各5 min(脫水)，將玻片置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min(透明)。通風(fēng)處自然晾干后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

1.7 Masson染色

將組織切片置于烤箱中融蠟，再進(jìn)行脫蠟，用配制的 Weigert 鐵蘇木素染色液染色 5～10 min，再用酸性乙醇分化液分化 5～15 s，水洗；Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min，水洗；蒸餾水洗 1 min。麗春紅品紅染色液染色 5～10 min，用弱酸工作液洗1 min，再用磷鉬酸溶液洗 1～2 min，用配置好的弱酸工作液洗1 min。滴加適量苯胺藍(lán)染色液 1～2 min，用配置好的弱酸工作液洗1 min。使用95%乙醇快速脫水，無(wú)水乙醇脫水3次，每次5～10 s。二甲苯透明3次，每次1～2 min。最后用中性樹(shù)膠封固。

1.8 免疫組化染色

將組織切片玻片置于80 ℃烤箱中烘烤30 min(融蠟)；將烤好的玻片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置10 min(脫蠟)，置于100%酒精、95%酒精、85%酒精各5 min，自來(lái)水緩慢沖洗數(shù)遍(水化)；將玻片置于蒸餾水中漂洗1 min，置于PBS緩沖液中；在迷你不銹鋼鍋中加入500～1 000 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)中加熱至沸騰，迅速將裝好玻片的金屬架置于鍋中，使玻片位于液面以下，蓋上高壓鍋蓋并加上氣閥，待高壓鍋噴氣時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)2～3 min。結(jié)束后關(guān)閉電磁爐，室溫靜置15 min，去掉鍋蓋靜置2 min后取出玻片，用PBS漂洗2 min×3次；每張玻片加入50 μL左右的酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min；PBS緩沖液漂洗3次；將漂洗好的玻片用油筆畫(huà)圈，加入稀釋好的一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。次日取出，復(fù)溫20 min，PBS洗3遍，加二抗(PV-6000)，室溫孵育30 min；PBS洗3 min×3次，DAB顯色(5～8 min)，根據(jù)鏡下染色情況終止反應(yīng)，流水緩慢漂洗玻片5～10 min；蘇木素染液復(fù)染20～40 s，自來(lái)水漂洗3次，顯微鏡下觀察染色深淺。1%鹽酸酒精分化1 s，自來(lái)水漂洗3次，2 min/次，再將玻片置于返藍(lán)液中2 s，流水慢速漂洗5 min；置于85%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精各1 min(脫水)；置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2 min(透明)；最后將玻片置于通風(fēng)出自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片后鏡下觀察。

1.9 ELISA檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，從復(fù)溫好的試劑盒中取出適量板條?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育90 min。提前20 min準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。洗板5次，在空白孔中加入生物素化抗體稀釋液，其余孔中加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，置于37 ℃溫箱中1 h，洗板5次。在空白孔中加入酶結(jié)合物稀釋液，其余孔中加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，置于37 ℃溫箱中避光孵育30 min。提前打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測(cè)程序。洗板5次。每個(gè)孔中加入顯色底物100 μL，37 ℃溫箱中避光孵育15 min。每孔中加入反應(yīng)終止液100 μL后，用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔在450 nm處讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔的酶標(biāo)儀讀數(shù)及其濃度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式。將標(biāo)本孔的酶標(biāo)儀讀數(shù)帶入公式中，算出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子濃度。

1.10 Western印跡分析

采用Western印跡檢測(cè)皮膚微血管Wnt5A、β-聯(lián)蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白α1(recombinant collagen type Iα 1，col1A1)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。所得微血管沉淀從-80 ℃取出，根據(jù)組織量加入適量裂解液(1 mL 裂解緩沖液+ 蛋白酶抑制劑1 μL+磷酸酶抑制劑10 μL+PMSF 10 μL)，靜置30 min，于4 ℃ 12 000 g離心30 min。取上清液并采用BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)含量。上清液與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻煮沸冷卻，取總量為30 μg的蛋白質(zhì)點(diǎn)樣至濃縮膠中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟，獲得含有蛋白質(zhì)條帶的PVDF膜，經(jīng)過(guò)5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗孵育過(guò)夜、TBST洗3×10 min、二抗搖床孵育1 h、再次TBST洗3×10 min，采用ECL發(fā)光液顯影并使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.11 q-PCR檢測(cè)

將所得微血管組織放入1.5 mL無(wú)核酶EP管中，勻漿器充分勻漿后加入1 mL Trizol，用Trizol法進(jìn)行總RNA提取。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行引物逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。目的基因β-聯(lián)蛋白(β-catenin)及內(nèi)參基因GAPDH的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)Table 1。

Table 1 q-PCR Primer sequence

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示各數(shù)據(jù)，使用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad 5.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)檢驗(yàn)后如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布同時(shí)又符合方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間的差異，當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，設(shè)定P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 博來(lái)霉素可成功誘導(dǎo)系統(tǒng)性硬化癥小鼠模型

通過(guò)每日皮下注射博來(lái)霉素誘導(dǎo)Balb/c小鼠系統(tǒng)性硬化癥模型，連續(xù)28 d。隨著B(niǎo)LM注射天數(shù)的增加，小鼠皮下注射點(diǎn)周?chē)つw逐漸變緊變硬，進(jìn)針阻力感較正常組稍有增加，皮下注射區(qū)域毛發(fā)生長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減慢；對(duì)照組小鼠皮下注射區(qū)域的皮膚色澤正常，彈性未見(jiàn)明顯異常，同時(shí)皮膚也未出現(xiàn)變緊變硬；治療組的情況則處于模型組和對(duì)照組之間。

造模完成后，通過(guò)對(duì)3組小鼠皮膚組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示，模型組小鼠皮膚真皮層明顯增厚，皮下脂肪及附屬器減少和消失，對(duì)照組皮膚無(wú)明顯增厚，皮下脂肪飽滿，附屬器未見(jiàn)明顯減少，治療組小鼠皮膚狀態(tài)改變介于兩者之間。通過(guò)Masson染色發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠皮膚真皮層明顯增厚，膠原纖維增生明顯，治療組小鼠皮膚真皮層也有增生的膠原纖維，但較模型組少，對(duì)照組小鼠皮膚膠原纖維增生不明顯。對(duì)3組小鼠皮膚進(jìn)行α-SMA免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠皮膚中微血管明顯增厚，呈肌化性改變，微血管α-SMA染色陽(yáng)性面積、深度都較對(duì)照組明顯加重，治療組小鼠經(jīng)iCRT3抑制Wnt通路后，皮膚中α-SMA表達(dá)量較模型組明顯減少，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。HE染色、Masson染色和IHC染色結(jié)果均說(shuō)明，BLM誘導(dǎo)Balb/c小鼠系統(tǒng)性硬化癥模型建模成功，且經(jīng)iCRT3抑制Wnt通路后，能夠減少皮膚膠原纖維的增生，減緩皮膚病變程度(見(jiàn)Fig.1)。

Fig.1 Bleomycin can successfully induce the mouse model of systemic sclerosis through the identification of mouse skin histopathology Totally 18 BALB/c mice were randomly divided into three groups. The control group was subcutaneously injected with sterile PBS 100 μL. The model group was injected subcutaneously with bleomycin (BLM) 100 μL at a concentration of 1 mg/mL on the back. In the treatment group, BLM of 100 μL (1 mg/mL) was injected subcutaneously combined with iCRT3 (5 mg/kg·d) intraperitoneal injection. The skin changes at the subcutaneous injection site of mice were observed every week. After 28 days, the skin tissues of mice were collected and subjected to staining of HE (scale bar=100 μm), Masson (scale bar=100 μm) and IHC (scale bar=25 μm)

2.2 三組小鼠血清中IL-17、IL-6的含量

通過(guò)ELISA方法對(duì)取得的各組小鼠血清進(jìn)行IL-17和IL-6含量測(cè)定。結(jié)果顯示(Fig.2)，經(jīng)BLM誘導(dǎo)的皮膚纖維化模型(模型組)血清中IL-17及IL-6的含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；在經(jīng)iCRT3處理后的小鼠血清中IL-17及IL-6含量較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.2 Changes of IL-17 and IL-6 levels in the serum of mice in each group After modeling, the serum of mice in each group was obtained and the contents of IL-17 and IL-6 in the serum of mice in each group were measured by ELISA. n=6; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

2.3 Wnt/β-catenin信號(hào)在系統(tǒng)性硬化癥小鼠模型皮膚微血管中存在異常激活現(xiàn)象

為了進(jìn)一步探討B(tài)alb/c小鼠模型皮膚微血管是否存在Wnt通路的異常激活，本文分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)皮膚微血管Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子進(jìn)行研究。采用實(shí)時(shí)PCR來(lái)檢測(cè)β-聯(lián)蛋白的表達(dá)(見(jiàn)Fig.3)。結(jié)果顯示，BLM模型組小鼠皮膚微血管的β-聯(lián)蛋白的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組小鼠皮膚明顯增高(P<0.05)；而經(jīng)iCRT3處理后的小鼠(治療組)皮膚微血管中β-聯(lián)蛋白 mRNA相較模型組的表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig.3 Real time PCR was used to detect the expression of β-catenin Total RNAs from mouse skin microvessels were extracted by Trizol and the levels of β-catenin in each group were detected by PCR. n=6; ***P<0.001

對(duì)于蛋白質(zhì)水平的變化，根據(jù)Western印跡結(jié)果(Fig.4)顯示，模型組小鼠皮膚微血管中col1A1及α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)量較對(duì)照組小鼠明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這也從蛋白質(zhì)水平印證了本文造模是成功的。在經(jīng)iCRT3處理后的小鼠皮膚微血管中，col1A1及α-SMA表達(dá)量較模型組同樣明顯減少(P<0.05)。結(jié)果提示，抑制Wnt通路能有效減少微血管纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，減輕血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)沉積及纖維化重塑。同時(shí)，本文也對(duì)Wnt通路相關(guān)蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白及Wnt5A進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組β-聯(lián)蛋白及Wnt5A蛋白質(zhì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，而治療組β-聯(lián)蛋白及Wnt5A較模型組蛋白質(zhì)表達(dá)量有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig.4 Relative protein expression of α-SMA, col1A1, β-catenin and Wnt5A in mouse skin microvessels The protein levels of col1A1, α-SMA, β-catenin and Wnt5A in the skin microvessels of mice in each group were extracted and detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control. n=6; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

3 討論

博來(lái)霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)性硬化的小鼠模型可追溯至1999年，Yamamoto等[8]的報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在小鼠背部皮膚局部注射BLM可以誘導(dǎo)皮膚纖維化樣表現(xiàn)，與系統(tǒng)性硬化癥皮膚表現(xiàn)非常類(lèi)似。例如，皮膚變緊變硬、真皮層明顯增厚、膠原增生，脂肪層顯著減少、被纖維組織包繞，膠原含量增多，并伴有明顯的炎癥反應(yīng)。該學(xué)者還對(duì)比了不同品系小鼠在局部注射博來(lái)霉素后的皮膚纖維化情況，發(fā)現(xiàn)所有品系的小鼠在局部注射博來(lái)霉素后，均能誘導(dǎo)皮膚纖維化改變[9-10]。

因此，我們選擇更為經(jīng)濟(jì)、來(lái)源更為廣泛、造模方式更為成熟的Balb/C小鼠作為實(shí)驗(yàn)造模對(duì)象。通過(guò)在小鼠背部皮下注射BLM來(lái)誘導(dǎo)小鼠系統(tǒng)性硬化癥模型，在對(duì)小鼠連續(xù)4周皮下注射BLM后，取皮膚病理組織進(jìn)行觀察(見(jiàn)Fig.1)，小鼠皮膚表皮層及真皮層均明顯增厚，脂肪層明顯變薄，皮脂腺及毛囊萎縮、數(shù)目減少，膠原纖維增生、增粗，同時(shí)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這與SSc患者皮膚病理結(jié)果表現(xiàn)非常類(lèi)似，也與Yamamoto等所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈笃つw改變一致[8,10]，說(shuō)明本文成功地在Balb/C小鼠中誘導(dǎo)了SSc皮膚纖維化模型。模型組小鼠真皮層微血管也出現(xiàn)明顯增厚，呈肌化性改變，微血管α-SMA染色陽(yáng)性面積、深度都較對(duì)照組明顯加重(見(jiàn)Fig.1)，說(shuō)明BLM誘導(dǎo)皮膚纖維化發(fā)生的同時(shí)，也伴隨皮膚微血管病變。

系統(tǒng)性硬化癥的血管病變往往發(fā)生在疾病的早期，甚至常常早于纖維化的發(fā)生。持續(xù)性炎性損傷、促血管生成因子和抗血管生成因子之間的失衡、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的異常激活、血管內(nèi)膜增厚，最終導(dǎo)致SSc血管病變，血管狹窄和閉塞、組織缺血、纖維化，器官功能障礙[11-14]。但迄今，SSc血管病變的初始事件仍不清楚，結(jié)構(gòu)性和功能性血管異常之間的相互關(guān)系復(fù)雜，病理機(jī)制也尚不明確。

以往有研究證實(shí)，Wnt通路在SSc的纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要病理作用[3,5-7]，尚無(wú)研究報(bào)道Wnt通路在SSc血管病變中的作用。但研究證實(shí)，經(jīng)典Wnt通路可參與血管病變，是血管形成和成熟的主要驅(qū)動(dòng)力[15]，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化和增殖[16-17]。在BLM誘導(dǎo)的小鼠皮膚纖維化模型中，皮膚Wnt 蛋白上調(diào)(見(jiàn)Fig.4)，α-SMA免疫組化(見(jiàn)Fig.1)結(jié)果提示，微血管肌化性改變明顯，α-SMA陽(yáng)性染色明顯加深，而在經(jīng)iCRT3抑制劑治療后的小鼠皮膚免疫組化顯示，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)較減低。本文的研究提示，Wnt通路的異常激活參與了BLM誘導(dǎo)的系統(tǒng)性硬化小鼠的皮膚血管病變的發(fā)生。

白細(xì)胞介素-6(IL-6)是一種經(jīng)典的促炎細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。研究已證實(shí)，IL-6可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，促進(jìn)SSc皮膚和臟器的纖維化[18-20]。有研究顯示，Th17細(xì)胞的比例、IL-17A表達(dá)水平在SSc中明顯升高，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和膠原合成，參與了SSc纖維化的發(fā)生發(fā)展，與疾病活動(dòng)度、毛細(xì)血管擴(kuò)張等均有相關(guān)性[16,21-22]。本研究顯示(見(jiàn)Fig.2)，Wnt通路抑制劑可使BLM誘導(dǎo)的SSc小鼠模型血清IL-6及IL-17表達(dá)水平下降(P<0.05)，提示W(wǎng)nt通路可能是通過(guò)直接或間接的方式下調(diào)細(xì)胞因子IL-6及IL-17表達(dá)，干預(yù)BLM誘導(dǎo)的小鼠血管病變的進(jìn)展。

綜上所述，本研究在BLM誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中成功地驗(yàn)證了Wnt/β-catenin通路在小鼠皮膚微血管中存在異常激活現(xiàn)象。抑制Wnt通路可以改善BLM誘導(dǎo)的SSc小鼠皮膚纖維化及血管病變，這為SSc治療提供了新的研究思路與方向。但本研究不足之處在于未從細(xì)胞水平，例如內(nèi)皮細(xì)胞及血管周細(xì)胞來(lái)觀察Wnt/β-catenin通路改變，今后將進(jìn)一步探討Wnt通路在SSc血管病變的細(xì)胞分子機(jī)制。