RMT1-10體外誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞對(duì)小鼠高危角膜移植排斥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制

趙敏 楊柳清 王夢宇 陶鈺 郭永越 蘇銳鋒 石晶 譚小波

1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，承德 067000；2承德市中心醫(yī)院眼科，承德 067000

角膜移植是治療角膜盲的有效方式，但高危角膜移植的排斥反應(yīng)發(fā)生率超過70%，尋找誘導(dǎo)受體產(chǎn)生對(duì)供體的抗原特異性免疫耐受策略對(duì)防治角膜移植排斥反應(yīng)具有重大意義[1]。近年來，T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子1(T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-1，Tim-1)在角膜移植排斥反應(yīng)中的作用受到研究者的關(guān)注。馬明等[2]研究證實(shí)Tim-1表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面，通過提高正性共刺激信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞活化增生以及相應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生，最終促進(jìn)角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tim-1的阻斷抗體RMT1-10可以誘導(dǎo)受體形成免疫耐受并抑制角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生，但其作用機(jī)制尚未完全明確[3]。研究發(fā)現(xiàn)，如果在致敏階段未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDCs)暴露于抗原時(shí)抑制其表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)或共刺激分子可以使其轉(zhuǎn)化為耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cells，Tol-DCs)，而Tol-DCs可以在免疫反應(yīng)過程中保持其未成熟表型并通過減少抗原提呈、降低促炎細(xì)胞因子、增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)等機(jī)制誘導(dǎo)形成免疫耐受，因此Tol-DCs也被認(rèn)為是抑制角膜移植排斥反應(yīng)的有力工具[4-7]。作為共刺激分子家族的重要一員，Tim-1不僅分布于活化的CD4+T細(xì)胞表面，也分布于DCs表面，推測RMT1-10阻斷Tim-1信號(hào)可能促使imDCs轉(zhuǎn)化為Tol-DCs，誘導(dǎo)免疫耐受并抑制角膜移植排斥反應(yīng)。本研究擬探討RMT1-10體外誘導(dǎo)的Tol-DCs對(duì)小鼠高危角膜移植排斥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠100只和C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。本研究方案經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：CYFYLL2020055)。

1.1.2主要試劑及儀器 重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF)、重組小鼠白細(xì)胞介素4(recombinant mouse interleukin-4，rmIL-4)、FITC標(biāo)記的抗鼠CD11c抗體、PE標(biāo)記的抗鼠MHC-Ⅱ、CD80、CD86、Tim-4、CD103抗體(美國eBioscience公司)；脂多糖、Tris-NH4Cl(美國Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；抗鼠Fc封閉性抗體(美國eBioscience公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit，CCK)-8(美國Sigma-Aldrich公司)；IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(美國Biosource公司)；RMT1-10及其IgG同型對(duì)照抗體(美國Bio X Cell公司)。Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國Termo Fisher Scientific公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Mitsutovo螺旋測微器(日本三豐公司)。

1.2 方法

1.2.1DCs的獲取及分組處理 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌取股骨，沖洗骨髓細(xì)胞，Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞5 min，以1×l06個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔添加10 ng/ml rmGM-CSF和1 ng/ml rmIL-4，培養(yǎng)3 d后，吸棄培養(yǎng)基及懸浮細(xì)胞，重新加入RPMI1640完全培養(yǎng)基及rmGM-CSF、rmIL-4，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集疏松貼壁細(xì)胞即為imDCs。將獲取的imDCs按照誘導(dǎo)干預(yù)措施的不同分為imDCs組、mDCs組、RMT1-10組和IgG同型對(duì)照組，其中imDCs組不做干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；mDCs組在培養(yǎng)第6天加入終質(zhì)量濃度為10 mg/L脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h；RMT1-10組在培養(yǎng)第1天加入200 ng RMT1-10，第6天加入終質(zhì)量濃度為10 mg/L脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h；IgG同型對(duì)照組在培養(yǎng)第1天加入200 ng RMT1-10的IgG同型對(duì)照抗體，第6天加入終質(zhì)量濃度為10 mg/L脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs表型 收集各組細(xì)胞，用含有體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)作為染色液洗滌2次。每50 μl染色液添加1～2 μl抗鼠Fc封閉性抗體。將細(xì)胞用50 μl含有封閉性抗體的染色液混懸，4 ℃避光孵育30 min。每50 μl染色液分別添加1～2 μl抗鼠CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、Tim-4、CD103抗體或其同型IgG抗體。再加入50 μl染色液混懸，4 ℃避光孵育30 min，洗滌2次，離心半徑15 cm，1 500 r/min離心5 min棄上清，100 μl PBS混懸后上機(jī)檢測，F(xiàn)lowjo 10.0軟件(日本Tomy Digital Biology公司)分析結(jié)果。測定時(shí)以前向散色光和側(cè)向散色光設(shè)定R1排除細(xì)胞碎片，以CD11c設(shè)門R2，以平均熒光強(qiáng)度計(jì)算CD80、CD86、MHC-Ⅱ、Tim-4、CD103陽性細(xì)胞在CD11c陽性細(xì)胞中的百分比。每個(gè)樣品均用熒光標(biāo)記同型IgG抗體作為相應(yīng)的陰性對(duì)照。

1.2.3ELISA法檢測DCs培養(yǎng)上清液中IL-10和TGF-β的表達(dá)水平 收集各組DCs培養(yǎng)上清液，分別使用IL-10和TGF-β的ELISA檢測試劑盒按說明書操作方法進(jìn)行檢測。抗體包被板條中加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品(100 U/孔)，室溫孵育90 min，洗板，每孔加入50 μl PBS內(nèi)含生物素標(biāo)記抗IL-10和抗TGF-β抗體(1∶ 2 000)，室溫孵育60 min，PBS洗滌3次。每孔加入100 μl親和鏈霉素-HRP，室溫孵育20 min，PBS洗滌3次。每孔加入100 μl 0.01%四甲基聯(lián)苯胺緩沖液，室溫避光孵育20 min，加入100 μl 1 mmol/L H2SO4終止顯色，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度(A450)值，參考波長為690 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品細(xì)胞因子水平。

1.2.4磁柱分選法獲取小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞 頸椎脫臼法處死BALB/c小鼠，無菌摘取脾臟，200目篩網(wǎng)研磨過濾，裂解紅細(xì)胞10 min，洗滌后調(diào)整細(xì)胞密度為1×l06/ml，加入CD4特異性磁珠(1 μl磁珠/107個(gè)細(xì)胞)，4 ℃避光孵育15 min，以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%牛血清白蛋白的PBS洗滌后上磁柱分選(MS+，德國Miltenyi Biotec公司)，即得到CD4+T細(xì)胞，其分選純度經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測大于95%。

1.2.5混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測DCs刺激CD4+T細(xì)胞的增生能力 收集4個(gè)組DCs分別以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔均添加25 μg/ml絲裂霉素C，重懸后作為刺激細(xì)胞，每孔再加入CD4+T細(xì)胞(5×105個(gè)/100 μl)作為反應(yīng)細(xì)胞。按照刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量比為1∶ 5、1∶ 10、1∶ 20和1∶ 40分別添加4個(gè)組細(xì)胞，每個(gè)比例均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)立單獨(dú)T細(xì)胞為陰性對(duì)照。72 h后每孔添加20 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定A450值，參考波長620 nm。刺激指數(shù)(stimulation index，SI)=(待測樣品A值-培養(yǎng)液對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-培養(yǎng)液對(duì)照組A值)。

1.2.6小鼠高危角膜移植模型的建立及分組 以角膜基質(zhì)縫線法誘導(dǎo)BALB/c小鼠角膜新生血管，于右眼角膜以11-0縫線間隔120°間斷縫線3針，7 d后拆線。選擇4個(gè)象限新生血管均勻長入角膜中周區(qū)的小鼠作為受體。采用隨機(jī)數(shù)字表法將80只受體小鼠隨機(jī)分為imDCs組、mDCs組、RMT1-10組和IgG同型對(duì)照組，每組20只，分別經(jīng)尾靜脈注射供體源imDCs、mDCs(imDCs+脂多糖)、RMT1-10誘導(dǎo)的DCs(imDCs+RMT1-10+脂多糖)和RMT1-10IgG同型對(duì)照抗體誘導(dǎo)的DCs(imDCs+IgG+脂多糖)，均為1×106個(gè)細(xì)胞/100 μl。7 d后，以C57BL/6小鼠為供體行穿透角膜移植術(shù)。腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%戊巴比妥鈉(0.4 ml/只)麻醉小鼠，供體角膜植片和受體植床直徑均為2.0 mm，11-0尼龍縫線間斷縫合8針，消毒空氣形成前房，術(shù)畢紅霉素眼膏涂眼，瞼緣縫合，24 h后拆除瞼緣縫線觀察。發(fā)生前房消失、前房出血、感染、虹膜前粘連、白內(nèi)障等并發(fā)癥者8例，不納入實(shí)驗(yàn)并及時(shí)補(bǔ)充樣本。手術(shù)由同一術(shù)者完成。

1.2.7裂隙燈顯微鏡下觀察各組角膜植片排斥體征 術(shù)后每日在裂隙燈顯微鏡下觀察受體角膜植片排斥體征，參考Larkin等[8]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)角膜排斥反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分：(1)角膜混濁 角膜植片完全透明為0分；植片透明度輕度丟失為1分；植片透明度中度丟失，虹膜血管可見為2分；虹膜血管窺不清，但瞳孔輪廓可見為3分；瞳孔輪廓不清為4分。(2)水腫 角膜植片無水腫為0分；角膜植片中度水腫為1分；伴有植片增厚的顯著水腫為2分。(3)新生血管 植片無新生血管為0分；新生血管在任何象限伸入達(dá)到植片半徑的25%為1分；新生血管在任何象限伸入達(dá)到植片半徑的50%為2分；新生血管在任何象限伸入達(dá)到植片半徑的75%為3分；新生血管達(dá)到植片中央為4分。3項(xiàng)評(píng)分之和為當(dāng)日排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection index，RI)，RI≥5或植片混濁評(píng)分≥3分即認(rèn)為發(fā)生排斥反應(yīng)，術(shù)后30 d植片仍保持透明者確定為存活。

1.2.8遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測 角膜移植術(shù)后第21天，每組按照抽簽法隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)檢測。首先取正常C57BL/6小鼠，頸椎脫臼法處死，浸入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中1～2 min，無菌摘取脾臟，200目篩網(wǎng)研磨過濾，Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞5 min，轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃下1 500 r/min離心5 min，棄上清，Hanks液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×l07/ml，加入終質(zhì)量濃度為1.25 mg/ml絲裂霉素C，于37 ℃水浴中作用30 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清，Hanks液洗滌3次。取20 μl(1×106個(gè)細(xì)胞)注射于受體小鼠右耳廓皮下，對(duì)側(cè)耳廓注射等容量生理鹽水。24 h后，以螺旋測微器測量耳廓腫脹度。耳廓腫脹度=右耳(24 h測量值-0 h測量值)-左耳(24 h測量值-0 h測量值)。取正常BALB/c小鼠5只，耳廓注射前7 d，小鼠腹部皮下注射1 ml(1×107個(gè)細(xì)胞)C57BL/6脾臟細(xì)胞懸液作為陽性對(duì)照。取正常BALB/c小鼠5只，右耳廓皮下僅注射生理鹽水作為陰性對(duì)照。根據(jù)耳廓是否腫脹判定是否存在DTH反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組DCs中不同細(xì)胞表型所占百分比比較

各組DCs中CD80、CD86、MHC-Ⅱ、Tim-4和CD103總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，其中RMT1-10組DCs中CD80、CD86、MHC-Ⅱ和Tim-4陽性細(xì)胞占CD11c陽性細(xì)胞百分比均明顯低于mDCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；RMT1-10組Tim-4陽性細(xì)胞百分比明顯低于imDCs組，CD103陽性細(xì)胞百分比明顯高于其他3個(gè)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(圖1，表1)。

圖1 各組DCs不同表型比較的代表性流式圖 mDCs：成熟樹突狀細(xì)胞；imDCs：未成熟樹突狀細(xì)胞；MHC：主要組織相容性復(fù)合物；Tim：T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子

表1 各組DCs中不同細(xì)胞表型所占百分比比較(x±s,%)Table 1 Comparisons of different DCs phenotypes among various groups (x±s,%)組別樣本量CD80CD86MHC-ⅡTim-4CD103imDCs組522.87±3.3625.94±2.5323.80±2.3518.32±1.4716.75±1.35mDCs組558.98±3.1965.65±2.1462.60±3.2027.04±2.359.34±1.43RMT1-10組525.12±2.64b27.86±2.68b26.03±2.53b12.39±2.07ab28.66±2.29abIgG同型對(duì)照組560.63±3.5465.24±2.5563.04±2.0527.94±3.118.91±0.98cF值209.30402.30364.6050.870169.00P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與imDCs組比較,aP<0.001;與mDCs組比較,bP<0.001;與RMT1-10組比較,cP<0.001(單因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) DCs:樹突狀細(xì)胞;imDCs:未成熟樹突狀細(xì)胞;mDCs:成熟樹突狀細(xì)胞;MHC:主要組織相容性復(fù)合物;Tim:T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子 Note:Compared with imDCs group,aP<0.001;compared with mDCs group,bP<0.001;compared with RMT1-10 group,cP<0.001 (One-way ANOVA,Tukey test) DCs:dendritic cells;imDCs:immature dendritic cells;mDCs:mature dendritic cells;MHC:major histocompatibility complex;Tim:T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule

表2 各組DCs刺激CD4+ T細(xì)胞增生反應(yīng)SI比較(x±s,%)Table 2 Comparison of SI of CD4+ T cell proliferation response stimulatedwith DCs among various groups (x±s,%)組別樣本量DCs與CD4+ T細(xì)胞比例1∶51∶101∶201∶40imDCs組31.61±0.031.51±0.021.46±0.021.32±0.08mDCs組32.34±0.02a2.24±0.03a2.19±0.03a1.90±0.07aRMT1-10組31.51±0.03a1.40±0.02a1.26±0.03a1.08±0.06aIgG同型對(duì)照組32.38±0.042.26±0.012.18±0.032.00±0.03 注:F分組=1 833.00,P<0.001;F比例=230.40,P<0.001;F交互作用=3.06,P=0.01.與imDCs組比較,aP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) DCs:樹突狀細(xì)胞;SI:刺激指數(shù);imDCs:未成熟樹突狀細(xì)胞;mDCs:成熟樹突狀細(xì)胞 Note:Fgroup=1 833.00,P<0.001;Fratio=230.40,P<0.001;Finteraction=3.06,P=0.01.Compared with imDCs group,aP<0.05 (Two-way ANOVA,Tukey test) DCs:dendritic cells;SI:stimulation index;imDCs:immature dendritic cells;mDCs:mature dendritic cells

2.2 各組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10和TGF-β質(zhì)量濃度比較

imDCs組、RMT1-10組、mDCs組和IgG同型對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10質(zhì)量濃度分別為(61.35±3.76)、(27.47±2.51)、(86.63±7.81)和(29.27±3.67)pg/ml，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=154.30，P<0.001)；TGF-β質(zhì)量濃度分別為(31.48±1.69)、(13.66±1.80)、(45.23±4.32)和(15.09±0.94)pg/ml，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=174.60，P<0.001)。RMT1-10組IL-10和TGF-β質(zhì)量濃度明顯高于其他組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；imDCs組IL-10和TGF-β質(zhì)量濃度明顯高于mDCs組和IgG同型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(圖2)。

圖2 各組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10和TGF-β質(zhì)量濃度比較 A：各組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10質(zhì)量濃度比較 F=154.30，P<0.001.與imDCs組比較，aP<0.001；與RMT1-10組比較，bP<0.001(單因素方差分析，Tukey檢驗(yàn)，n=5) B：各組DCs培養(yǎng)上清液中TGF-β質(zhì)量濃度比較 F=174.60，P<0.001.與imDCs組比較，aP<0.001；與RMT1-10組比較，bP<0.001(單因素方差分析，Tukey檢驗(yàn)，n=5) 1：imDCs組；2：RMT1-10組；3：mDCs組；4：IgG同型對(duì)照組 IL：白細(xì)胞介素；TGF：轉(zhuǎn)化生長因子

2.3 各組DCs刺激CD4+ T細(xì)胞增生反應(yīng)SI比較

各組DCs刺激CD4+T細(xì)胞增生反應(yīng)SI總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=1 833.00，P<0.001；F比例=230.40，P<0.001)。在同一細(xì)胞比例內(nèi)，imDCs組SI均低于mDCs組，RMT1-10組SI均低于imDCs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

2.4 角膜移植術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察

術(shù)后14 d，mDCs組和IgG同型對(duì)照組角膜植片均發(fā)生排斥反應(yīng)，可見角膜植片顯著水腫并呈灰白色混濁，新生血管長入植片中央，不可窺見虹膜紋理及瞳孔。imDCs組和RMT1-10組角膜植片未見排斥反應(yīng)，imDCs組角膜植片輕度水腫，新生血管長至植片邊緣。RMT1-10組角膜植片透明，無水腫、新生血管，虹膜紋理及瞳孔清晰可見(圖3)。

圖3 術(shù)后14 d裂隙燈顯微鏡下各組角膜植片排斥反應(yīng)情況 A：imDCs組角膜植片輕度水腫 B：mDCs組角膜植片灰白色混濁 C：IgG同型對(duì)照組角膜植片顯著水腫并呈灰白色混濁 D：RMT1-10組角膜植片透明

2.5 各組DCs過繼轉(zhuǎn)移后受體小鼠角膜植片生存分析

將各組角膜植片生存時(shí)間繪制為Kaplan-Meier生存曲線，mDCs組和IgG同型對(duì)照組角膜植片均在術(shù)后第8天開始發(fā)生排斥反應(yīng)，14 d內(nèi)全部發(fā)生排斥反應(yīng)。imDCs組角膜植片術(shù)后第17天開始發(fā)生排斥反應(yīng)，4周內(nèi)80%植片發(fā)生排斥反應(yīng)。RMT1-10組角膜植片術(shù)后第24天開始發(fā)生排斥反應(yīng)，4周內(nèi)50%植片發(fā)生排斥反應(yīng)。各組角膜植片生存曲線總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=77.69，P<0.001)，其中imDCs組角膜植片存活數(shù)量明顯多于mDCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.02，P<0.001)；RMT1-10組角膜植片存活數(shù)量明顯多于imDCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.74，P=0.002)(圖4)。

圖4 各組DCs過繼轉(zhuǎn)移后受體小鼠角膜植片生存分析(Log-rank檢驗(yàn)，n=15) 各組角膜植片生存曲線總體比較， χ2=77.69，P<0.001.imDCs組與mDCs組比較， χ2=31.02，P<0.001；RMT1-10組與imDCs組比較， χ2=9.74，P=0.002 imDCs：未成熟樹突狀細(xì)胞；mDCs：成熟樹突狀細(xì)胞

2.6 各組DCs過繼轉(zhuǎn)移后受體小鼠耳廓腫脹度比較

陽性對(duì)照組、mDCs組、IgG同型對(duì)照組、imDCs組、RMT1-10組和陰性對(duì)照組小鼠耳廓腫脹度分別為(503.6±17.2)、(475.7±17.6)、(456.2±18.8)、(225.2±39.4)、(118.1±12.6)和(106.4±7.4)μm，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=377.10，P<0.001)，其中mDCs組小鼠耳廓腫脹度低于陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)；imDCs組小鼠耳廓腫脹度明顯低于IgG同型對(duì)照組，明顯高于RMT1-10組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(圖5)。

圖5 各組受體小鼠耳廓腫脹度比較(單因素方差分析，Tukey檢驗(yàn)，n=5) F=377.10，P<0.001.與陽性對(duì)照組比較，aP<0.05；與imDCs組比較，bP<0.05 1：陽性對(duì)照組；2：mDCs組；3：IgG同型對(duì)照組；4：imDCs組；5：RMT1-10組；6：陰性對(duì)照組

3 討論

Tim最早于2001年被發(fā)現(xiàn)，鼠類由8個(gè)成員組成，人類由3個(gè)成員組成，兩者有3個(gè)成員最為接近，包括Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim家族在免疫應(yīng)答和免疫耐受中扮演重要角色[9]。Tim-1是最新發(fā)現(xiàn)的Tim家族成員，初始CD4+T細(xì)胞表面并不表達(dá)Tim-1，但在受到T細(xì)胞表面受體刺激數(shù)小時(shí)后迅速上調(diào)并偏好表達(dá)于分化成熟的Th2細(xì)胞表面。因此，Tim-1被認(rèn)為是Th2細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物并主要參與Th2型免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[10]。研究發(fā)現(xiàn)Tim-1阻斷抗體RMT1-10能夠有效抑制免疫排斥反應(yīng)[11]。本課題組前期研究中采用腹腔內(nèi)注射RMT1-10防治小鼠角膜移植排斥反應(yīng)，結(jié)果顯示角膜植片的存活率顯著提高[3]。通過對(duì)其作用機(jī)制的探討，發(fā)現(xiàn)RMT1-10可以抑制CD4+T細(xì)胞活化增生、抑制Th1反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)Tregs反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫耐受[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RMT1-10可以使DCs保持未成熟表型，抑制CD4+T細(xì)胞活化增生，從而抑制角膜移植排斥反應(yīng)[12]。然而，雖然imDCs具有很強(qiáng)的抗原捕獲和處理能力，以及較弱的T細(xì)胞刺激能力，但不能致敏T細(xì)胞，也不能通過使T細(xì)胞凋亡或無能或刺激Tregs誘導(dǎo)免疫耐受[13]。因此，RMT1-10的作用可能并非通過imDCs實(shí)現(xiàn)。

Tol-DCs被認(rèn)為是一種介于imDCs和mDCs之間的DCs，所有誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tol-DCs都具有一些的共性：(1)低表達(dá)共刺激分子；(2)在促成熟刺激時(shí)保持穩(wěn)定同時(shí)高分泌IL-10；(3)激活T細(xì)胞的能力較弱[14]。在本研究中，經(jīng)RMT1-10干預(yù)同時(shí)接受脂多糖刺激的DCs低表達(dá)MHC-Ⅱ和T細(xì)胞激活所需的共刺激分子CD80和CD86。Tim-4是Tim-1的天然配體，組成性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞，特別是mDCs，Tim-4可誘導(dǎo)Tim-1胞內(nèi)尾巴區(qū)酪氨酸磷酸化，從而提供共刺激信號(hào)增強(qiáng)IL-4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄并激活T細(xì)胞核因子轉(zhuǎn)錄和活化蛋白-1，因此Tim-1和Tim-4結(jié)合對(duì)于T細(xì)胞增生和細(xì)胞因子產(chǎn)生具有重要意義[15]。本研究中DCs表面Tim-4也同時(shí)被抑制，說明其激活T細(xì)胞的能力也較弱。實(shí)際上，目前仍不確定Tol-DCs是DCs的特定亞群還是一類具有能反映其處于活化耐受狀態(tài)階段的DCs，研究者對(duì)一些特征性Tol-DCs，如CD103+DC和穿孔素表達(dá)性DCs(perf-DCs)等進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CD103+DCs不僅可以誘導(dǎo)Tregs產(chǎn)生，還可以指導(dǎo)T細(xì)胞表面歸巢分子CCR9和α4β7的表達(dá)，因此被認(rèn)為是具有免疫耐受誘導(dǎo)功能的一種DCs[16]。在本研究中，RMT1-10誘導(dǎo)DCs表面CD103的表達(dá)水平明顯高于其他組。因此，盡管RMT1-10誘導(dǎo)DCs的部分表型屬于imDCs，但還具有明顯不同于imDCs的耐受性表型分子表達(dá)，這類DCs是否為CD103+Tol-DCs仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

從細(xì)胞因子角度來看，DCs分泌的免疫抑制因子TGF-β和IL-10對(duì)于誘導(dǎo)外周免疫耐受至關(guān)重要。在穩(wěn)態(tài)下，CD103+DCs需要在TGF-β參與下將初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Tregs。在受到脂多糖刺激時(shí)，DCs需要在TGF-β參與下減少CD80和CD86等分子表達(dá)以抵抗成熟刺激，TGF-β誘導(dǎo)的IL-10表達(dá)增加也參與這一過程[17]。IL-10參與多種免疫細(xì)胞，特別是Tregs和Tr1細(xì)胞的誘導(dǎo)[18]。在穩(wěn)態(tài)下，外周的CD4+CD25-Foxp3-T細(xì)胞在TGF-β和IL-10參與下暴露于抗原后會(huì)明顯上調(diào)表達(dá)Foxp3[19]。本研究中，RMT1-10誘導(dǎo)的DCs明顯抑制CD4+T細(xì)胞增生，且分泌的TGF-β和IL-10明顯多于對(duì)照組，進(jìn)一步說明RMT1-10可能誘導(dǎo)產(chǎn)生的是Tol-DCs，且其免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過上調(diào)表達(dá)TGF-β和IL-10實(shí)現(xiàn)的。

本課題組前期研究顯示，腹腔內(nèi)注射RMT1-10可以使體內(nèi)DCs保持未成熟狀態(tài)，進(jìn)而抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)，這種效應(yīng)隨著藥物劑量的加大而增強(qiáng)，但這樣可能會(huì)引起嚴(yán)重的全身不良反應(yīng)，因此在體外誘導(dǎo)imDCs轉(zhuǎn)化為Tol-DCs再轉(zhuǎn)移至體內(nèi)可能效率更高且更為安全[12]。臨床上，Tol-DCs已被用于包括器官移植和自身免疫性疾病的I期臨床試驗(yàn)，并顯示出良好的安全性和應(yīng)用前景[20-21]。在本研究中，RMT1-10誘導(dǎo)的DCs將高危角膜植片存活率明顯提高且未發(fā)生明顯不良反應(yīng)，而受體小鼠的DTH反應(yīng)更接近正常小鼠，也說明其可通過抑制受體的DTH反應(yīng)安全、有效地誘導(dǎo)受體形成抗原特異性免疫耐受。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-1阻斷抗體RMT1-10可以抑制小鼠高危角膜移植排斥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是體外誘導(dǎo)imDCs轉(zhuǎn)化為Tol-DCs并上調(diào)TGF-β和IL-10表達(dá)，經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移后促進(jìn)受體抗原特異性免疫耐受，進(jìn)而間接延長角膜植片存活時(shí)間。隨著細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)的進(jìn)步，Tol-DCs有望應(yīng)用于臨床角膜移植，改善角膜移植療效、減少對(duì)免疫抑制劑的依賴、提高患者的生存質(zhì)量。本研究尚存在一些局限性，如在觀察RMT1-10誘導(dǎo)Tol-DCs的抗排斥效果時(shí)，未使用常規(guī)藥物，如地塞米松作為對(duì)照。實(shí)際上，地塞米松不只是免疫抑制劑，也可能通過抑制DCs成熟誘導(dǎo)Tol-DCs轉(zhuǎn)化，因此將其作為藥物對(duì)照可能更具說服力。另外，Tol-DCs和其他免疫細(xì)胞，如Tregs、Bregs、自然殺傷細(xì)胞等構(gòu)成一個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)于放大其正反饋效應(yīng)并維系免疫耐受至關(guān)重要，本研究在對(duì)RMT1-10誘導(dǎo)的Tol-DCs作用機(jī)制進(jìn)行探討時(shí)未對(duì)此進(jìn)行深入分析，這些問題都有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明趙敏：實(shí)施研究、論文初稿撰寫；楊柳清、王夢宇、陶鈺：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)；郭永越：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理；蘇銳鋒：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；石晶：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析；譚小波：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、論文審閱與修訂及定稿