從廢舊報(bào)紙中分離高產(chǎn)纖維素酶菌種的鑒定和研究

曹哲，閆雅清瀅，于靜怡，吳玲艷，路婉婷，于欣悅，徐佳璐，鄭苗苗

從廢舊報(bào)紙中分離高產(chǎn)纖維素酶菌種的鑒定和研究

曹哲1，閆雅清瀅1，于靜怡1，吳玲艷1，路婉婷1，于欣悅1，徐佳璐2，鄭苗苗1

（1. 哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目前，造紙行業(yè)是對(duì)森林資源消耗最大的產(chǎn)業(yè)，每年用于造紙消耗的木材數(shù)量巨大．以預(yù)處理的廢報(bào)紙漿為原料，在一定條件下篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，應(yīng)用于廢紙紙漿脫墨研究，考察了濃度、時(shí)間、溫度對(duì)廢報(bào)紙中分離高產(chǎn)纖維素酶菌種的影響，并采用簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色和剛果平板法進(jìn)行菌株鑒定．結(jié)果表明，以報(bào)紙為唯一營(yíng)養(yǎng)源，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離純化出一株短桿狀具有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌．以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，最終篩選出具有高產(chǎn)能力的產(chǎn)纖維素酶菌株，命名為QQ1128.1．提取16S rDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)序后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定細(xì)菌QQ1128.1為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種．獲得的脫墨菌種能夠提高再生資源的有效利用，實(shí)現(xiàn)國(guó)家生態(tài)文明建設(shè)．

纖維素酶；16S rDNA；篩選；鑒定

隨著科技飛速發(fā)展，纖維素酶在食品、醫(yī)藥、紡織、造紙和能源等工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用[1]．目前，我國(guó)林木資源匱乏，并且面臨著“植樹(shù)不見(jiàn)樹(shù)、造林難成林”的問(wèn)題，而紙張的主要成分來(lái)源于林木資源．我國(guó)紙漿消耗量居亞洲首位，導(dǎo)致紙漿進(jìn)口依賴(lài)很大[2]257．當(dāng)今廢舊報(bào)紙、書(shū)、雜志等廢紙浪費(fèi)嚴(yán)重，因此，回收利用廢紙對(duì)林木資源的緊張有一定的緩解，而且可以減少對(duì)國(guó)外紙漿的進(jìn)口量．

廢紙脫墨是回收廢紙不可或缺的一部分，一般的對(duì)廢紙進(jìn)行脫墨的方法會(huì)用到化學(xué)方法，但是這種方法要用到大量的化學(xué)物質(zhì)，如NaOH、Na2SiO3、Na2CO3、H2O2、螯合劑、表面活性劑等，對(duì)環(huán)境造成污染．除此之外還有洗滌脫墨、浮選脫墨、蒸汽爆破、溶劑脫墨和生物酶脫墨等方法．對(duì)廢紙脫墨時(shí)用生物酶法不僅可以提高廢紙的脫墨作用和效果，還可以削減化學(xué)藥品對(duì)環(huán)境的破壞．現(xiàn)在對(duì)廢紙進(jìn)行脫墨的探究和鉆研主要是對(duì)脂肪酶、漆酶、纖維素酶等，通常是把纖維素酶和其他酶結(jié)合起來(lái)進(jìn)行應(yīng)用[2]258．雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素酶用于脫墨進(jìn)行了廣泛大量的研究[3]，但很少有直接以報(bào)紙為唯一營(yíng)養(yǎng)源進(jìn)行培養(yǎng)并從報(bào)紙培養(yǎng)液里分離篩選可以產(chǎn)生纖維素酶細(xì)菌，然后將篩選出的菌株用于對(duì)廢紙進(jìn)行脫墨的研究中．菌種篩選和培育主要有2種方法[4-6]：一是以得到有更高的產(chǎn)纖維素酶能力的菌株為目的，從可以分解纖維素的菌源中篩選分離出所需要的菌株；二是用誘變育種法，獲得可以產(chǎn)生纖維素酶并且具有高產(chǎn)能力的菌株．隨著DNA體外重組技術(shù)的不斷完善和進(jìn)步，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量科研工作者將DNA體外重組技術(shù)用于改造或創(chuàng)造出具有高產(chǎn)纖維素酶能力的菌株中．

本研究擬從以報(bào)紙為唯一營(yíng)養(yǎng)源的報(bào)紙培養(yǎng)液中篩選出一株可以產(chǎn)生纖維素酶并且具有高產(chǎn)能力的菌株，并鑒定篩選出的菌株，該實(shí)驗(yàn)為具有高產(chǎn)纖維素酶能力的菌株對(duì)廢紙進(jìn)行脫墨提供一定的研究依據(jù)．目前實(shí)驗(yàn)已完成菌株的分離，并將獲得的新型脫墨菌株——枯草芽孢桿菌保存于中國(guó)微生物菌種保藏中心．已經(jīng)完成產(chǎn)品迭代并制作出復(fù)合生物菌劑，且已經(jīng)得到良好反饋．

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

顯微鏡（蘇州南光電子科技有限公司）；恒溫恒濕箱（上海平軒科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海鑫翁科學(xué)儀器有限公司）；微波爐（琪摩電子科技有限公司）；多功能電磁爐（深圳市龍華新區(qū)智首電器廠）；臺(tái)式離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；凈化工作臺(tái)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（濟(jì)南展康醫(yī)療器械有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（濟(jì)南銘晟醫(yī)療器械有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）；冰箱（松下電器（中國(guó)）有限公司）；PCR儀（BIO RAD，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海啟閔生物科技有限公司）；紫外透射分析儀（上虞艾科儀器設(shè)備有限公司）．

無(wú)水乙醇（開(kāi)封百川匯寶實(shí)業(yè)有限公司）；羧甲基纖維素鈉（河北鵬與生物科技有限公司）；Tris，溶菌酶（Biotopped，北京博奧拓科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（牡丹江市豐達(dá)化工進(jìn)出口有限責(zé)任公司）；剛果紅（湖北欣欣佳麗生物科技有限公司）；胰蛋白胨（上海振品化工有限公司）；酵母膏（武漢恩比德化工產(chǎn)品有限公司）；Agar（BIOSHARP，北京蘭杰柯科技有限公司）；氫氧化鈉（滄州劉氏化工有限公司）；硫酸鎂（山東騰飛生物科技有限公司）；磷酸二氫鉀（柳州市新納精細(xì)化工廠）；丙三醇（沈陽(yáng)久野化工原料有限公司）；硝酸銨（昆明鹿阜商貿(mào)有限公司）；冰醋酸（山東旭晨化工科技有限公司）；溴化乙錠（Sigma，江蘇西格瑪電器有限公司）．

以廢舊報(bào)紙為唯一碳源進(jìn)行搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)液．

1.2　方法

1.2.1培養(yǎng)基（1）LB固體培養(yǎng)基．胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉7.5 g，d H2O 500 mL，pH7.0．（2）LB液體培養(yǎng)基．胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，NaCl 5 g，d H2O 500 mL，pH7.0．（3）篩選培養(yǎng)基[7]．羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）7.5 g，NH4NO30.5 g，酵母膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂粉10 g，d H2O 500 mL，pH自然．

1.2.2初篩在三角瓶中倒入200 mL蒸餾水和20個(gè)玻璃珠，再放入0.3 g報(bào)紙剪成的碎紙片．把三角瓶放置于37 ℃、180 r/min的搖床培養(yǎng)48 h．繼續(xù)進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?.1 mL稀釋樣液在LB固體培養(yǎng)基平板上涂布，將每個(gè)濃度梯度的平板密封做好記號(hào)后于37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1～2 d．選擇單個(gè)菌落進(jìn)行染色（簡(jiǎn)單染色[8]、革蘭氏染色和芽孢染色[9]）觀察，將分離純化出的菌株接到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，準(zhǔn)備用于復(fù)篩實(shí)驗(yàn)．

1.2.3復(fù)篩只有能夠把纖維素水解成單糖，并且可以利用水解纖維素生成產(chǎn)物的細(xì)菌才可以在以CMC-Na為唯一碳源的剛果紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[10-12]，利用篩選培養(yǎng)基篩選分離出能夠產(chǎn)生纖維素酶并且具有高產(chǎn)能力的菌株．將配置好的每200 mL CMC-Na培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，封口滅菌．稱(chēng)0.05 g剛果紅用于配制10 mg/mL的剛果紅溶液，取1 mL的剛果紅溶液加到200 mL的培養(yǎng)基中．震蕩搖勻后倒平板．取待測(cè)菌接種于LB液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)活化，吸取菌液涂布后，倒置37 ℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落外部形態(tài)特征及在培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的大?。畬?fù)篩得到的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃，180 r/min的搖床培養(yǎng)8～10 h，液體LB培養(yǎng)基變渾濁．將1 mL的菌液和1 mL濃度為50%滅菌后的甘油移入2 mL離心管中并震蕩，充分混合溶液．最后甘油的濃度為25%，把甘油與菌液混合均勻后放入-20 ℃冰箱進(jìn)行菌種保藏[13]，為篩選得到的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定做準(zhǔn)備．

1.3　鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定在細(xì)菌生長(zhǎng)的平板上觀察菌落的特點(diǎn)（如顏色、外形、表面是否光滑等[14]）；簡(jiǎn)單染色觀察細(xì)菌的形態(tài)；革蘭氏染色鑒定篩選的菌株為G+還是G-；芽孢染色看到細(xì)菌可以產(chǎn)生芽孢．并和初篩的染色結(jié)果對(duì)比，確定復(fù)篩得到的菌株是從以報(bào)紙為唯一營(yíng)養(yǎng)源的報(bào)紙培養(yǎng)液中分離篩選出的菌株并進(jìn)行初步的鑒定．

1.3.2分子生物學(xué)鑒定（1）細(xì)菌基因組16S rDNA的提取[15]．在超凈工作臺(tái)中用移液槍吸取保藏菌液800 μL，移入裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放到溫度設(shè)置為37 ℃轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min的搖床里一直到液體中能夠看到渾濁．把細(xì)菌的16S rDNA用DNA提取試劑盒（離心柱型）提取出來(lái)．試劑盒產(chǎn)品組成為：緩沖液GA 15 mL，緩沖液GB 15 mL，緩沖液GD 13 mL，漂洗液PW 15 mL，洗脫緩沖液TE 15 mL，ProteinaseK 1 mL，吸附柱CB 350個(gè)，收集管（2 mL）50個(gè)．離心管中得到的溶液即為提取到的細(xì)菌16S rDNA．將得到細(xì)菌的16S rDNA放到-20 ℃的冰箱儲(chǔ)存．

（2）0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[16-17]．DNA在電泳液中經(jīng)過(guò)電場(chǎng)中的凝膠介質(zhì)移向正極，DNA片段不一樣在單位時(shí)間內(nèi)泳動(dòng)的距離也不一樣．

①配制50*TAE緩沖液．稱(chēng)Tris 2.42 g，乙二胺四乙酸二鈉0.372 g，加入8 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚝蠹尤?.571 mL冰乙酸，攪拌均勻后倒入蒸餾水至10 mL．在配好的50*TAE中倒入490 mL蒸餾水，稀釋為500 mL的1*TAE緩沖液后，放置一旁待需要時(shí)使用．

②配40 mL 0.8%的瓊脂糖凝膠．拿一個(gè)250 mL三角瓶，用分析天平稱(chēng)0.32 g瓊脂糖，稱(chēng)量40 mL的1*TAE倒在三角瓶里，再把稱(chēng)好的瓊脂糖倒進(jìn)去，混勻后用封口膜封上，放入微波爐中加熱，使溶液變成透明．

③制備膠板．在電泳槽一側(cè)插好梳子，等瓊脂糖凝膠液冷卻到用手摸不燙時(shí)加入1 μL 0.5 mg/mL的EB混合均勻后，慢慢地把膠液倒在制膠槽中，靜置，等膠液變成固體可以看到乳白色后，把膠上的梳子輕輕地直著拿下來(lái)．把凝膠和膠板按正確的方向放進(jìn)電泳槽里并卡住膠板，在電泳槽中倒入1*TAE緩沖液直到?jīng)]過(guò)膠板．

④上樣．用移液槍吸取2份2 μL的溴酚藍(lán)，分別與5 μL Marker和DNA樣品在點(diǎn)樣板上混合均勻后，用移液槍按順序移到點(diǎn)樣孔中，每加完一個(gè)樣品要更換槍頭．

⑤電泳．把電泳槽上的線接好，打開(kāi)電泳儀，電壓調(diào)到90～100 V，當(dāng)藍(lán)色條帶移到距離點(diǎn)樣孔2 cm時(shí)，關(guān)閉電泳儀的電源．

⑥觀察．取出膠板放到紫外透射分析儀觀察后，放在成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄．

（3）PCR擴(kuò)增．PCR[18]后可以得到指數(shù)倍的模板DNA片段，很快就可以獲得很多的特定的基因片段．提取細(xì)菌的16S rDNA片段用作模板．PCR反應(yīng)體系（25 μL）：引物1 1 μL，引物2 1 μL，DNA模板1 μL，緩沖液、4種dNTP溶液、taqDNA聚合酶、Mg2+等混合液12.5 μL，ddH2O 9.5 μL．PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，49 ℃退火10 s，72 ℃下延伸1 min，共來(lái)回32次，最后在72 ℃下延伸5 min，到溫度下降到12 ℃時(shí)反應(yīng)結(jié)束．取5 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩下的PCR產(chǎn)物放到冰箱4 ℃保藏．檢測(cè)后取出膠板放到紫外透射分析儀觀察，并放在成像系統(tǒng)觀察且拍照記錄，檢測(cè)結(jié)果滿意后在哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序．

（4）菌株16S rDNA序列分析與菌株鑒定．把DNA序列粘貼到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)Blast得到與該細(xì)菌基因序列同源性較高的序列，建立該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19-20]，鑒定篩選分離出的菌株．

2　結(jié)果與分析

2.1　菌株初篩結(jié)果分析

在三角瓶中倒入200 mL蒸餾水，放入20個(gè)玻璃珠后，將報(bào)紙剪成細(xì)小的碎片，并稱(chēng)取0.3 g放到三角瓶中（見(jiàn)圖1a），把三角瓶放到37 ℃、180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h后（見(jiàn)圖1b），培養(yǎng)48 h后（見(jiàn)圖1c），觀察效果．由圖1b～c可見(jiàn)，培養(yǎng)48 h后的培養(yǎng)液顏色明顯比培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液顏色變淺．由此可以得出，以報(bào)紙為唯一碳源的培養(yǎng)液中存在具有脫墨作用的微生物．

圖1　報(bào)紙紙漿不同培養(yǎng)時(shí)間效果

取報(bào)紙培養(yǎng)液稀釋?zhuān)坎嫉絃B固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出不同形態(tài)菌落（見(jiàn)圖2a），選擇一個(gè)長(zhǎng)得好的單菌落，把它用接種環(huán)挑出來(lái)一點(diǎn)，然后在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，培養(yǎng)后得到的細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況（見(jiàn)圖2b）．

圖2 報(bào)紙培養(yǎng)液中分離脫墨細(xì)菌生長(zhǎng)形態(tài)

用接種環(huán)挑取圖2b中的單個(gè)菌落進(jìn)行染色（見(jiàn)圖3）．由圖3可見(jiàn)，篩選出的為短桿狀菌體，革蘭氏染色把菌體染為紫色（見(jiàn)圖3b），說(shuō)明該菌為G+，芽孢染色后看到芽孢被染成綠色，菌體被染成紅色（見(jiàn)圖3c），說(shuō)明篩選出的細(xì)菌能夠產(chǎn)生芽孢．

圖3　不同染色方法的初篩效果

2.2　菌株復(fù)篩結(jié)果分析

吸取初篩的菌株保藏的菌液，移入LB液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)活化后，用移液槍吸取菌液滴到以CMC-Na為唯一碳源的剛果紅培養(yǎng)基上涂布后，倒著放到培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)圖4．篩選出的菌株可以在以CMC-Na為唯一碳源的剛果紅培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)并能產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明這個(gè)細(xì)菌是能夠產(chǎn)纖維素酶并且具有高產(chǎn)能力的菌株．

2.3　菌株的鑒定

2.3.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定選擇復(fù)篩平板上生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，用接種環(huán)挑一點(diǎn)細(xì)菌放到LB液體培養(yǎng)基中，然后放到37 ℃、180 r/min的搖床里培養(yǎng)，等三角瓶中的液體能看到混濁后，取菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上．放到37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，可以看到菌落的外沿呈現(xiàn)出乳白色，中間為粉紅色，菌落表面比較粗糙（見(jiàn)圖5）．

圖4　菌株復(fù)篩結(jié)果

圖5　復(fù)篩培養(yǎng)12 h菌落

對(duì)待鑒定的菌落進(jìn)行染色（見(jiàn)圖6），并放到顯微鏡下觀察，在低倍鏡下找到視野后再調(diào)換到油鏡觀察．

圖6　不同染色方法的復(fù)篩效果

通過(guò)染色觀察比較，鑒定的菌株與初篩的菌株是一樣的，菌體全為短桿狀，用革蘭氏染色法染色后，菌體呈紫色（見(jiàn)圖6b），表明這個(gè)菌為G+，芽孢染色觀察到芽孢為綠色，菌體為紅色（見(jiàn)圖6c），說(shuō)明該菌產(chǎn)芽孢，暫且將此菌株命名為QQ1128.1．

2.3.2菌株的分子生物學(xué)鑒定將提取的細(xì)菌16Sr DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，放到電子成像系統(tǒng)下觀察，電泳結(jié)果見(jiàn)圖7．

把QQ1128.1的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，觀察電泳結(jié)果，得到的DNA片段長(zhǎng)度約1 500 bp（見(jiàn)圖8）．

圖7　細(xì)菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳電子成像

注：1. Maker DL2000；2. QQ1128.1的16Sr DNA．

圖8　電泳檢測(cè)QQ1128.1的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

注：1. Maker DL2000；2. CK；3. QQ1128.1的16Sr DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物．

在哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序后，測(cè)得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長(zhǎng)度為1 049 bp，核苷酸序列為：GGGCGTCGTGCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGGTTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGGGGAAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTCCTCTGACATCCCTAAAGATAGGACGTCCCTTTCGGGGCAAAATGACAGGGGGTTCATGGTTGTCCCCACTTCGGGCC．

圖9　BioEdit軟件打開(kāi)序列

將序列用BioEdit軟件打開(kāi)（見(jiàn)圖9），由圖9可見(jiàn)，序列無(wú)雙峰和底峰，說(shuō)明所用引物和模板較純．

2.3.3構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)把DNA序列粘貼到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，經(jīng)過(guò)Blast得到QQ1128.1基因組序列（見(jiàn)圖10），發(fā)現(xiàn)QQ1128.1與枯草芽孢桿菌同源性最高，達(dá)98.43%．

圖10　Blast得到QQ1128.1基因組序列

選擇5個(gè)和QQ1128.1最可能是從共同祖先經(jīng)過(guò)進(jìn)化后成為不同序列的菌株，下載這5個(gè)菌株的序列，用clustal X軟件對(duì)序列進(jìn)行比較后，用MEGA 4軟件建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖11），鑒定QQ1128.1為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種．

圖11　MEGA 4軟件建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3　結(jié)論

以報(bào)紙為唯一營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)液中存在具有脫墨作用的微生物，從培養(yǎng)液中經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩得到一株產(chǎn)纖維素酶的高產(chǎn)菌株并命名為QQ1128.1．通過(guò)對(duì)該菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定QQ1128.1為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種．

[1] 鄭昆．淺議纖維素酶的研究與應(yīng)用[J]．科技展望，2016，26（31）：68．

[2] 陳夏蘭，韋平英．纖維素酶用于制漿造紙的研究進(jìn)展[J]．化學(xué)工程與裝備，2016（9）：257-258．

[3] 張玉雙，劉婧，陳禮輝，等．混合辦公廢紙的纖維素酶脫墨[J]．紙和造紙，2014，33（1）：4-7．

[4] MOKATSE K M P，WYKJPHV．Relative saccharification of various waste paper materials by cellulose from niger[J]．Dvelopment，2015，3：44-46．

[5] 嚴(yán)維博，王建，王志杰．生物酶技術(shù)在廢紙脫墨中的研究進(jìn)展[J]．天津造紙，2013，35（4）：25-29．

[6] 李豪，白光劍，蘭楠，等．高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2019，46（3）：711-718．

[7] 唐樂(lè)麗．高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及所產(chǎn)酶的應(yīng)用研究[D]．廣州：廣東藥科大學(xué)，2018．

[8] 葛含靜．細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（16）：282-285．

[9] 趙鈺．產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]．沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017．

[10] Lee C K，I brahim D，Omar I C．Enzymatic deinking of various types of waste paper：Efficiency and characteristics[J]．PROCESS BIOCHEMISTRY，2013，48（2）：299-305．

[11] 宋朝霞，范玲，李鵬，等．一株纖維素酶高產(chǎn)細(xì)菌的篩選及鑒定[J]．河南工程學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，30（4）：76-81．

[12] Bayer E A，Lamed R，Himmel M E．The potential of cellulases and cellulosomes for cellulosic waste management[J]．Curr Opin Biotechnol，2007，18（3）：237-245．

[13] Park J，Park K．Improvement of the physical properties of reprocessed paper by using biological treatment with modified cellulase[J]．Bioresource Technology，2002，21：323-332．

[14] 吳自祥，萬(wàn)學(xué)瑞，馬亞茹，等．產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離篩選與鑒定[J]．草原與草坪，2017，37（2）：7-11，19．

[15] Bhat M K．Cellulases and related enzymes in biotechnology[J]．Biotechnology Advances，2000，18（5）：355-383．

[16] 李碧嬋，陳金燕，蘇雅娜，等．纖維素酶高產(chǎn)細(xì)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)特性分析[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（17）：4572-4576．

[17] 田云，曹林友，周賡，等．一株纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定與產(chǎn)酶研究[J]．化學(xué)與生物工程，2016，33（7）：34-39．

[18] 張璐璐，衛(wèi)旭彪，斯大勇，等．產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的篩選及鑒定[J]．飼料工業(yè)，2016，37（18）：45-50．

[19] 孫旭東，黃曉梅，陳秀玲，等．產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]．基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（6）：1281-1287．

[20] 張麗影，汪寒寒，潘婷，等．產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]．纖維素科學(xué)與技術(shù)，2015，23（2）：1-7．

Identification and study of high cellulase producing strains isolated from waste newspapers

CAO Zhe1，YAN Yaqingying1，YU Jingyi1，WU Lingyan1，LU Wanting1，YU Xinyue1，XU Jialu2，ZHENG Miaomiao1

（1. School of Food Engineering，Harbin Institute，Harbin 150001，China；2. School of Dentistry，Harbin Medical University，Harbin 150001，China）

Currently，the paper industry is the industry that consumes the largest amount of forest resources，and the amount of wood consumed for paper making is huge every year．Pretreated waste newspaper pulp was used as raw material to screen cellulase producing strains under certain conditions and applied to the study of deinking of waste paper pulp．The effects of concentration，time and temperature on the isolation of high cellulase producing strains from waste newspaper were investigated，and the strains were identified by simple staining，Gram staining and Congo plate method．The results showed that a short rod-shaped Gram-positive strain with budding spores was isolated and purified from the culture solution by shaking bed culture using newspaper as the only nutrient source．Using sodium carboxymethyl cellulose as the sole carbon source，a cellulase producing strain with high capacity was finally screened and named QQ1128.1．16S rDNA was extracted，and after PCR amplification and sequence sequencing，a phylogenetic tree was constructed to identify the bacterium QQ1128.1 as a new species of the．The deinked strain obtained can improve the effective use of renewable resources，realize the construction of national ecological civilization．

cellulase；16S rDNA；screening；identification

1007-9831（2022）08-0063-08

Q55

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.013

2022-04-18

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210234018）；哈爾濱學(xué)院青年博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（HUDF2019103）；黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（LBH-Z18028）

曹哲（2000-），男，山西大同人，在讀本科生．E-mail：1491514846@qq.com

鄭苗苗（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，教授，博土，從事應(yīng)用微生物研究．E-mail：miaomiao_0000@126.com