虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

白雨鑫，童榮生，李晉齊

(1.四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部，成都 610072； 2.四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，成都610072)

虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)為四川省人民醫(yī)院的醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號(hào)為川藥制字Z20080173)，已在臨床應(yīng)用30余年，清熱、解毒療效顯著，廣受患者好評(píng)[1-2]。根據(jù)臨床實(shí)際需要，結(jié)合該制劑載藥量的要求，擬研制成無(wú)糖顆粒。課題組前期開(kāi)展了虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)成型工藝研究，獲得了穩(wěn)定可行的制備工藝[3]。為保證工藝變更后產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，本研究對(duì)虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2020年版)通則[4]，測(cè)定其粒徑、水分、溶化性和裝量差異，采用薄層色譜法定性鑒別虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)中的虎杖、板藍(lán)根和川射干3味藥材，采用高效液相色譜法定量測(cè)定顆粒中虎杖苷、大黃素的含量，采用加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)顆粒樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以期為虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的質(zhì)量控制提供依據(jù)[5-7]。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2998PDA型檢測(cè)器，Empower3色譜數(shù)據(jù)工作站(美國(guó) Waters公司)；BP211D型十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；優(yōu)普ULPHW型純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；KX-85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；雙框沖壓型標(biāo)準(zhǔn)藥典篩(浙江紹興市不銹鋼篩廠，1號(hào)、3號(hào)和5號(hào)藥典篩)。

1.2 藥品與試劑

虎杖苷(批號(hào)：11575-200502)、L-精氨酸(C6H14N4O2)、大黃素(批號(hào)：110756-200110)、大黃素甲醚(批號(hào)：110578-200610)、射干苷(批號(hào)：111632-200501)、虎杖對(duì)照藥材(批號(hào)：110980-200902)、板藍(lán)根對(duì)照藥材(批號(hào)：121177-201006)和川射干對(duì)照藥材(批號(hào)：110264-200902)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠分廠)；甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)DIKMA公司)；磷酸、乙酸乙酯、石油醚、甲酸乙酯、甲酸甲酯、正丁醇、冰醋酸、濃硫酸、三氯甲烷、丁酮和乙醚為分析純，均購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；試驗(yàn)用水超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀評(píng)價(jià)

本品為棕黃色至棕色顆粒，顆粒大小適中，色澤均勻，氣微香，味微甜，無(wú)吸潮、結(jié)塊現(xiàn)象。

2.2 粒度檢查

稱取3批顆粒各50 g，按《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2020年版)通則“物理檢查法0982”(第二法雙篩分法)下的方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，3批顆粒中不合格顆粒均未超過(guò)顆?？偭康?5%，符合藥典規(guī)定。

2.3 溶化性檢查

稱取3批顆粒各10 g，加熱水200 mL(70 ℃)，用磁力攪拌器以固定轉(zhuǎn)速攪拌，攪拌5 min，立即觀察。結(jié)果顯示，3批顆粒全部溶化且無(wú)異物，符合藥典規(guī)定。

2.4 水分檢查

稱取3批顆粒各2 g，按《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2020年版)通則“水分測(cè)定法0832”(第二法烘干法)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，3批顆粒的含水率均未超過(guò)6.0%，符合藥典規(guī)定。

2.5 裝量差異檢查

從3批顆粒中各隨機(jī)抽取10袋，去除包裝，分別稱定每袋內(nèi)容物的重量，并與標(biāo)示重量比較。結(jié)果顯示，3批樣品顆粒的裝量差異<±5%，符合藥典規(guī)定。

2.6 鑒別

參考《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2020年版)及大量相關(guān)文獻(xiàn)中資料，應(yīng)用通則“0502薄層色譜法”對(duì)方中藥材進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果顯示，虎杖、川射干和板藍(lán)根色譜斑點(diǎn)顯色清晰，可作為制劑質(zhì)量鑒別，但白芷、貫眾和青蒿專屬性不佳，未能納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案鑒別項(xiàng)。

2.6.1 虎杖的薄層鑒定：參照相關(guān)方法[8-11]，將虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)研細(xì)后過(guò)三號(hào)篩，稱取過(guò)篩粉末0.3 g，加入甲醇20 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h后濾過(guò)，揮干濾液，向殘?jiān)屑尤肓蛩?2.5 mol/L)和氯仿各10 mL，100 ℃條件下加熱回流1 h，放冷，轉(zhuǎn)移液體至分液漏斗中，加入氯仿10 mL振搖，收集氯仿液，重復(fù)2次后合并氯仿液，水浴蒸干，用1 mL氯仿液溶解殘?jiān)?，即得供試液。處方中去除虎杖藥材，以原工藝制備陰性樣品，稱取陰性樣品0.3 g、虎杖對(duì)照藥材0.1 g，按供試液制備法制得陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液。以甲醇為溶劑制備0.5 mg/mL的大黃素對(duì)照品溶液、大黃素甲醚對(duì)照品溶液。吸取上述5種溶液，各5 μL，在同一硅膠GF薄層板上點(diǎn)樣(樣品液點(diǎn)樣2份)，展開(kāi)劑選定2種，分別為石油醚-甲酸乙酯-甲酸(V∶V∶V=15∶ 5∶ 1)的上層溶液和石油醚-甲酸甲酯-甲酸(V∶V∶V=15∶ 5∶ 1)的上層溶液[12]。跑板結(jié)束后取出晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品在對(duì)照藥材與大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品的薄層色譜的相同位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品的相應(yīng)位置沒(méi)有斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

A.展開(kāi)劑1；B.展開(kāi)劑2；1.對(duì)照藥材；2.陰性對(duì)照品；3.大黃素甲醚；4.大黃素；5—6.供試品A. developing solvent 1; B. developing solvent 2; 1. control reference; 2. negative control reference; 3. physcion; 4. emodin; 5-6. samples for test

2.6.2 板藍(lán)根的薄層鑒別：參考相關(guān)方法[13-14]，將虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)研細(xì)后過(guò)三號(hào)篩，稱取過(guò)篩粉末0.5 g，加入稀乙醇20 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h后濾過(guò)，揮干濾液，加稀乙醇1 mL溶解殘?jiān)?，即得供試液。處方中去除板藍(lán)根藥材，以原工藝制備陰性樣品，稱取陰性樣品0.5 g、板藍(lán)根對(duì)照藥材0.2 g，按供試液制備法制得陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液。以稀乙醇為溶劑制備0.5 mg/mL的精氨酸對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液，各5 μL，在同一硅膠GF薄層板上點(diǎn)樣(樣品液點(diǎn)樣2份)，展開(kāi)劑選定2種，分別為正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=19∶ 5∶ 5)和正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=22∶ 6∶ 3)，跑板結(jié)束后取出晾干，噴以茚三酮顯色試液，吹風(fēng)加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，日光燈下，供試品在對(duì)照藥材與精氨酸對(duì)照品的薄層色譜的相同位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品的相應(yīng)位置沒(méi)有斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

A.展開(kāi)劑1；B.展開(kāi)劑2；1.精氨酸；2.陰性對(duì)照品；3.對(duì)照藥材；4—5.供試品A. developing solvent 1; B. developing solvent 2; 1. arginine; 2. negative control reference; 3. control reference; 4-5. samples for test

2.6.3 川射干的薄層鑒別：參考相關(guān)方法[15]，將虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)研細(xì)后過(guò)三號(hào)篩，稱取過(guò)篩粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)0.5 h后濾過(guò)，揮干濾液，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，即得供試液。處方中去除川射干藥材，以原工藝制備陰性樣品，稱取陰性樣品0.5 g、川射干對(duì)照藥材0.5 g，按供試液制備法制得陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液。以甲醇為溶劑制備0.5 mg/mL的射干苷對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液，各5 μL，在同一硅膠GF薄層板上點(diǎn)樣(樣品液點(diǎn)樣2份)，展開(kāi)劑選定2種，分別為三氯甲烷-丁酮-甲醇(V∶V∶V=3∶ 1∶ 1)和三氯甲烷-冰醋酸-甲醇(V∶V∶V=8∶ 0.2∶ 2)，跑板結(jié)束后取出晾干，置紫外線燈(254 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品在對(duì)照藥材與射干苷對(duì)照品的薄層色譜的相同位置上顯示斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品的相應(yīng)位置沒(méi)有斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

A.展開(kāi)劑1；B.展開(kāi)劑2；1.對(duì)照藥材；2.陰性對(duì)照品；3.射干苷；4—5.供試品A. developing solvent 1; B. developing solvent 2; 1. control reference; 2. negative control reference; 3. tectoridin; 4-5. samples for test

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 虎杖苷含量測(cè)定：(1)色譜條件。色譜柱為Phenom Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(V∶V=15∶ 85)；檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。(2)溶液的制備。將虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)研細(xì)后過(guò)三號(hào)篩，精密稱定過(guò)篩粉末(約0.5 g)入棕色容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h，放冷再精密定容，搖勻溶液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液即為供試品溶液[16]。處方中去除虎杖藥材，以原工藝制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。精密稱取干燥后的虎杖苷對(duì)照品，加甲醇制得8.83 μg/mL的對(duì)照品溶液。(3)系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)。取虎杖苷對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣。結(jié)果顯示，虎杖苷色譜峰與其他組分分離良好，與其相鄰色譜峰的分離度>1.5，陰性對(duì)照溶液在虎杖苷色譜峰位置上無(wú)干擾，虎杖苷保留時(shí)間為24.738 min，該法具有良好的專屬性，見(jiàn)圖4。(4)方法學(xué)考察。采用高效液相色譜法，精密吸取上述虎杖苷對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、14、18和20 μL，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，虎杖苷在0.017 6 6～0.176 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8)。連續(xù)進(jìn)樣6次，虎杖苷平均含量為1.071 5 mg/g，RSD為0.95%，儀器精密度良好。穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果的RSD分別為1.22%、1.12%。加樣回收率考察結(jié)果平均值為98.79%，RSD為1.97%。(5)樣品測(cè)定。取3批虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)樣品，每批取3份，每份0.5 g，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得出不同批次虎杖苷含量范圍為1.064 2～1.075 6 mg/g，平均含量為1.070 3 mg/g，RSD為0.54%。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，考慮到藥材的來(lái)源、制劑生產(chǎn)和貯藏等因素，暫定本品每袋含虎杖以虎杖苷計(jì)，不得少于8 mg/g。

A.虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)供試品；B.虎杖苷對(duì)照品；C.虎杖苷陰性對(duì)照品A. sample of Huzhang antidote granules (sugar-free); B. reference substance of polydatin; C. negative control reference of polydatin

2.7.2 大黃素含量測(cè)定：(1)色譜條件。色譜柱為Phenomenex Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(V∶V=72∶ 28)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL[17]。(2)溶液的制備。將虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)研細(xì)后過(guò)三號(hào)篩，精密稱定過(guò)篩粉末(約0.5 g)入棕色容量瓶中，加40 mL甲醇，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h，放冷再精密定容，搖勻溶液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，精確量取9 mL續(xù)濾液，揮干濾液，向殘?jiān)屑尤肓蛩?2.5 mol/L)和氯仿各10 mL，100 ℃條件下加熱回流1 h，放冷，轉(zhuǎn)移液體至分液漏斗中，加入氯仿10 mL振搖，收集氯仿液，重復(fù)2次后合并氯仿液，水浴揮干，用甲醇溶解殘?jiān)⒕芏ㄈ葜?0 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液即為供試品溶液[18]。處方中去除虎杖藥材，以原工藝制備陰性樣品，參照供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。精密稱取干燥后的大黃素對(duì)照品，加甲醇制得7.28 g/mL的對(duì)照品溶液。(3)系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)。取大黃素對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，以上述色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果顯示，大黃素色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度>1.5，大黃素保留時(shí)間為16.803 min，陰性對(duì)照溶液在該位置上無(wú)干擾，該法具備良好專屬性，見(jiàn)圖5。(4)方法學(xué)考察。利用高效液相色譜，精密吸取上述大黃素對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、14、18和20 μL，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，大黃素在0.014 56～0.145 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)。連續(xù)進(jìn)樣6次，大黃素平均含量為0.675 9 mg/g，RSD為0.68%，儀器精密度良好。穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果的RSD分別為1.7%、1.67%。加樣回收率考察結(jié)果平均值為101.53%，RSD為1.63%。(5)樣品測(cè)定。取虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)樣品3批，每批3份，每份0.5 g，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，不同批次的大黃素含量范圍為0.682 4～0.701 2 mg/g，平均含量為0.694 2 mg/g，RSD為1.48%。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，考慮到藥材的來(lái)源、制劑生產(chǎn)和貯藏等因素，暫定本品每袋含虎杖以大黃素計(jì)，不得少于5 mg/g。

A.虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)供試品；B.大黃素對(duì)照品；C.大黃素陰性對(duì)照品A. sample of Huzhang antidote granules (sugar-free); B. reference substance of emodin; C. negative control reference of emodin

2.8 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為考察顆粒質(zhì)量穩(wěn)定性，將3批樣品(市售包裝)，置溫度為40 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度為75%±5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，于第1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月取樣，進(jìn)行含量測(cè)定和薄層鑒別，并考察記錄顆粒性狀、粒度、水分、溶化性和裝量差異情況，結(jié)果見(jiàn)表1。與0個(gè)月考察結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，3批制劑樣品的各項(xiàng)檢查指標(biāo)均符合規(guī)定，在加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)條件下質(zhì)量基本穩(wěn)定[19]。

表1 加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of accelerated stability

3 討論

3.1 顆粒劑質(zhì)量檢查

參照《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2020年版)，檢查了3批顆粒樣品的粒徑、溶化性、水分和裝量的差異，結(jié)果表明，顆粒質(zhì)量符合規(guī)定。

3.2 薄層色譜法鑒別

為了控制制劑的質(zhì)量，保證療效，對(duì)處方中的藥材進(jìn)行薄層鑒別。為確保鑒別結(jié)果科學(xué)可靠，本研究對(duì)方中虎杖、川射干和板藍(lán)根均選擇2種不同的展開(kāi)劑進(jìn)行分離。結(jié)果顯示，不同展開(kāi)劑條件下分離效果均理想，斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾；并且3批顆粒樣品結(jié)果一致，表明鑒別方法穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性高，可作為該顆粒的質(zhì)量控制方法。

3.3 含量測(cè)定

本研究中，虎杖苷和大黃素的含量測(cè)定直接參照《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2020年版)虎杖的含量測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)虎杖苷采用藥典流動(dòng)相條件(乙腈-水，V∶V=23∶ 77)時(shí)，雜質(zhì)干擾很大，虎杖苷不能與相鄰的色譜峰完全分離。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的不斷探索，以乙腈-水(V∶V=15∶ 85)為流動(dòng)相，以去除其他成分的干擾。

綜上所述，本研究對(duì)虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的質(zhì)量進(jìn)行了考察，建立了虎杖、板藍(lán)根和川射干共3味中藥的薄層色譜鑒別法，以及以虎杖苷、大黃素為指標(biāo)成分的高效液相色譜含量測(cè)定方法。加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明制劑具有較好的穩(wěn)定性，工業(yè)生產(chǎn)后可長(zhǎng)期保質(zhì)存放，有效期的最終確立可待繼續(xù)考察。本研究為虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的質(zhì)量研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，建立的方法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的質(zhì)量控制。