金鐵鎖三萜皂苷生物合成及分子機理分析

江舟

（云南中醫(yī)藥大學，云南昆明 650500）

金鐵鎖（Psammosilenetunicoides W.C.Wu et C.Y.W u）為石竹科金鐵鎖屬多年生單種屬植物，生產地主要集中在云南、四川等西南地區(qū)，是當地一種特有藥用植物?！兜崮媳静荨返谝淮斡涗浟私痂F鎖，其根入藥，可以起到散瘀、止痛以及消炎之效，是云南白藥的一個重要組成部分。之前針對金鐵鎖研究中，主要是對其有效成分開展研究，結果發(fā)現，成分主要為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類物質。金鐵鎖在開采中完全依靠的是野生植物，同時這一植物生長非常緩慢，資源較少，長期開采進一步降低了野生資源，產量更低。當前，金鐵鎖已被納入到《中國植物紅皮書》中。金鐵鎖天然資源有限，同時三萜皂苷結構非常復雜，在應用中無法有效滿足市場需求，急需尋找和擴大新的資源途徑。

隨著深入三萜合成途徑研究，大量研究表明，三萜類的生物合成可以分為3 個階段，分別為前體的形成、骨架構建以及后期修飾，合成前體主要為乙酰輔酶A，再將其通過甲羥戊酸途徑（MVA），實施一系列合成酶催化后可以合成三萜類骨架，進一步對其實施萜類后期修飾酶，在繼續(xù)對骨架實施結構修飾后，可以得到三萜類皂苷化合物。其中在萜類生物合成途徑中，主要依靠關鍵酶的催化作用，直接影響萜類次生代謝的最終產物[1]。首次植物萜類關鍵酶基因克隆報道出現在20 世紀末，已經實現對多種藥用植物萜類化合物關鍵酶基因的鑒定，并完成了克隆。啟動子（promoter）是特定的DNA 序列，常位于基因5'端上游，是重要的基因調控元件，RNA 聚合酶（RNA polymerase，RNA poly）能夠準確識別啟動子，并結合在啟動子特定位點上進行啟動轉錄。啟動子一般情況下采用的是GCN4-motif、G-box、TATA-box、CGTCA-motif 等順式作用調控元件，不但可以在種子中實現特異表達，也可以實現對MeJA 或脫落酸等激素的響應，所以不管是在種子萌發(fā)、衰老，還是在產物合成等生物過程中，都可以起到重要的基因表達調控作用。如使用不同濃度的茉莉酸甲酯（methyljas monate，MeJA）誘導調控刺五加啟動子（Eleutherococcus senticosus L.MDD mevalonate diphosphate decarboxylase）從而實現調控相應皂苷類化合物的含量。其中在調控萜類合成酶基因啟動子表達過程中，也會直接影響植物萜類產物合成，在分析過程中針對藥用植物次生代謝相關功能基因啟動子實施克隆，并進一步實施藥物分析，更有助于了解藥用植物的萜類合成機制[2]。目前，對金鐵鎖三萜皂苷生物合成途徑中鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆與調控已有一定的研究和報道，但金鐵鎖鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）基因上游啟動子對鯊烯環(huán)氧酶基因表達和轉錄的調控作用機理仍是未知領域[3]。本次在針對金鐵鎖三萜皂苷分子機理分析基礎上，探討其生物合成技術，以此揭示SE 啟動子在金鐵鎖齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷合成過程中所具備的生物機理，為利用生物合成手段獲得中藥有效成分，提高瀕危藥用植物重要藥用次生代謝化合物的含量提供研究基礎。

1 金鐵鎖三萜皂苷分子機理

在金鐵鎖中通過分離鑒定，可以得到的三萜皂苷主要為五環(huán)三萜類成分，通過分析金鐵鎖皂苷母核結構，發(fā)現其分布為齊墩果酸型，經過調控可以轉化為3 位（R1）以及28 位（R2）接長度不同的糖鏈。一般情況下，金鐵鎖苷元為絲石竹酸或皂角酸，之間不會出現太大改變。在對其實施分離后所得產物為3—0—6'-0 一甲基一13 一D 葡萄糖醛酸絲石竹苷，測定發(fā)現在原藥材中的含量為3.75%。通過金鐵鎖根也可以實現對兩個齊墩果烷五環(huán)三萜皂苷的分離鑒定，最終分離產物為齊墩果烷-3α，16α-二羥基-12 烯-23-酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基（1—3）-β-D-葡萄吡喃糖基（1—6）-β-D-葡萄吡喃糖甙（Ⅰ）和齊墩果烷-3α，16α-二羥基-12 烯-23-酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基1—6[-β-D-葡萄吡喃糖基（1—3）-β-D-葡萄吡喃糖甙（Ⅱ）。進一步針對金鐵鎖根部的三萜皂苷成分實施，鑒定后所得產物為9 個齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷（見圖1）。

圖1 三萜皂苷類化舍榜1-9 的母核結構

三萜類化合物的組成為6 個異戊二烯結構單元聯(lián)結所得，大部分為五環(huán)三萜形式，同時也存在有30 個碳原子。五環(huán)三萜皂苷元碳架存在有以下類型，分別為：齊墩果烷型、木栓烷型、羽扇豆烷型等。在中草藥中，三萜類化合物是重要組成成分之一，相應的生物合成途徑即為甲羥戊酸（MVA）途徑。

2 金鐵鎖三萜皂苷生物合成

2.1 金鐵鎖皂苷合成途徑

MVA 途徑是植物體內皂苷實施生物合成的主要途徑，在合成過程中將乙酰輔酶A 作為主要供體，乙酰輔酶A 通過一系列步驟，比如縮合、還原后也會合成MVA，之后繼續(xù)對其實施焦磷酸化、脫水等處理會生成異戊二烯焦磷酸（IPP），所生成物質能夠構成為二甲丙烯焦磷酸（DMAPP），通過香葉二磷酸合成酶（GPS）的作用，可以促進IPP 及DMAPP 合成新物質櫳牛兒基焦磷酸（GPP），進而在基焦磷酸合酶（FPS）影響下，可以促進IPP 與GPP 頭尾連接下的轉化，生成法尼基焦磷酸（FPP），在鯊烯合成酶（SQS）的作用下能夠轉變?yōu)橄⊿Q），繼續(xù)實施氧化處理能夠獲取2，3-氧化鯊烯，通過氧鯊烯環(huán)化酶（OSC）的影響，且對其實施相應的處理，其中包括質子化、重排以及去質子化等，可以將其轉變?yōu)椴煌娜乒羌埽M而受到糖基轉移酶（GT）、細胞色素P450 單加氧酶（CYP450）以及B 一糖苷酶等共同修飾影響，最終形成特定三萜皂苷[4]。在金鐵鎖中所分離的皂苷，大部分是為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂，隨其實施SQS 處理可以轉變?yōu)槿魄绑wSQ，將其合成2，3-氧化鯊烯，最后在β-香樹素合成酶（-AS）作用下能夠合成五環(huán)三萜皂苷的骨架-香樹素。

在合成途徑中，SQS 對兩分子FPP 起催化作用，在頭對頭方式下合成SQ；SQE 對鯊烯具有催化作用，可以在C=C 雙鍵間增添氧原子，進而將其轉化為環(huán)氧化物，合成2，3-氧化鯊烯；2，3-氧化鯊烯在受到OSC 家族催化作用下，可以將其轉變?yōu)榻Y構功能不同的植物甾醇以及三萜類骨架，在三萜皂苷生物合成過程中為關鍵酶；植物三萜合成途徑中，CYP450 的作用即為后修飾，能夠對其合成發(fā)揮羥基化及氧化等作用，可實現對不同種類底物的催化，但在此過程中也需要有多個CYP450s參與，才能夠合成最后產物；GT 在對皂苷元與糖產生催化作用中，可以實現和糖苷鍵的相連，與之同時也具備高度轉移性，實現對不同糖基或糖基受體的轉移，在此過程中相應的糖基轉移酶也存在差異。在生物合成途徑中，SQS、SQE、OSC 后修飾酶都是非常重要的酶，然而在三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類物合成過程中SQ 為共同前體，在這些物質形成過程中SQ 為重要步驟之一，同時SQS 含量以及活性直接影響之后產物生成量[5]。2，3-氧化鯊烯在-AS 催化作用下，能夠形成母核-香樹素，是以上物質形成中的重要分支步驟之一。通過以上分析可知，兩個酶都在重要分支步驟上，同時對催化物質前后結構存在較大影響。當前，在針對SQS 以及-AS 研究過程中，重點是關于基因克隆以及表達展開分析，在基因工程手段應用下實現對SQS 以及-AS 表達的調控，以此獲得產物，截至目前甘草、人參以及青蒿等植物SQS 以及-AS 都已經成功被克隆和表達。在本次研究前期已進行了金鐵鎖的轉錄組測序工作，并已克隆鑒定了金鐵鎖齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷生物合成途徑中的鯊烯環(huán)氧酶（SE）關鍵酶基因長的全長cDNA。

2.2 金鐵鎖皂苷合成生物學

2.2.1 常用菌株。在合成生物學中，當前可作底盤菌株的微生物種類較多，主要可以將其分為兩大類，分別為具有遺傳背景的微生物以及阿維菌素產出的微生物。前者常用的有鏈霉菌、大腸桿菌；后者常用的有阿維鏈霉菌、惡臭假單胞菌等。

2.2.2 底盤菌株釀酒酵母。在合成生物學中，釀酒酵母遺傳背景清晰，應用中的優(yōu)點主要為發(fā)酵密度大、遺傳改造，另外，還擁有較為成熟的發(fā)酵方法、具有較高生物安全性等，所以在工業(yè)生產中的應用較為廣泛，尤其是在遺傳學分析、基因工程等中的應用較為廣泛。釀酒酵母體中所含成分，可以提供MVA 途徑，進而促進萜類化合物的合成，也可以進一步完成麥角甾醇為主要產物固醇類物質的代謝合成，所以可在β-香樹素等高修飾型外源天然產物生產中得到應用，所在生產天然產物底盤工程菌株中的應用較為廣泛。當前實施釀酒酵母基因工程菌建構中，研究重點主要集中在細胞工程高產所需有效成分上，同時已經具備較多完成天然產物細胞工程建構的實際案例，比如Keasling 團隊在酵母中，通過合成生物學的應用成功實現了對青蒿素前體物青蒿酸的合成，且產量能夠達到25g/L。在青蒿酸生物合成路線上，釀酒酵母菌的應用路線已經較為清晰，進而提出了相關的基因調控方法，以能夠在酵母代謝工程菌的應用下實現對青蒿酸的合成，產量能夠達到100mg/L，在此基礎上，能夠大量合成青蒿素前體物質，這一物質對抗瘧疾藥物的主要成分。另外，也有學者在研究過程中，通過釀酒酵母底盤細胞中，有效針對原人參二醇生物合成建構了相應途徑。在實驗過程中通過建構釀酒酵母工程菌株，可以實現對藥用有效成分及其中間體的迅速生產，便于促進瀕危藥材的保護以及利用。另外，在釀酒酵母的應用下，也可以有效完成人參中原人參二醇合成酶基因CYP716A47 異源表達鑒定菌株的建構。在此基礎上，真正實現人參中達瑪烯二醇合成酶基因PgDDS 和原人參二醇生物合成酶基因CYP716A47 的異源共表達，可見，在CYP716A47 的應用下實現對目標化合物的生產。

通過以上分析可知，釀酒酵母的應用也為三萜皂苷異源代謝合成提供了相應的表達系統(tǒng)，有助于實現工程中的三萜皂苷異源工業(yè)化生產以及發(fā)展。本次研究中主要分析金鐵鎖三萜皂苷合成下游途徑，也可以將釀酒酵母作為底盤菌株。

3 結語

綜上所述，針對金鐵鎖三萜皂苷生成中，可以在合成生物學的應用下在微生物體內完成重建，進而一一解析其藥用有效成分的生物合成途徑，也可以進一步深入挖掘及調控生物合成途徑以及關鍵酶基因，也有助于提升藥用植物的有效成分含量，進一步提升中藥材品質，能夠為重要的良種選育、質量管控等提供相應的技術支持。另外，在直接發(fā)酵法的應用下，將金鐵鎖三萜皂苷人工細胞有效成分實施生產，也是取得新資源的有效方式，進一步補充這一理論研究。