小兒感冒顆粒連翹苷的提取及含量測定研究*

胡秀虹，張廷輝，潘曉蕓，吳蘭云

(1凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011；2黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，貴州 凱里 556011)

小兒感冒顆粒為小兒感冒類非處方藥藥品，清熱解表，主要用于風(fēng)熱感冒、發(fā)熱重、惡寒輕、汗出而熱不解、頭痛鼻塞、咳嗽、口渴咽紅等癥狀，其主要成分有連翹、廣藿香、菊花、板藍(lán)根、大青葉、薄荷等[1]。連翹來源于木犀科植物連翹的干燥果實(shí)[2]，別名黃花條、連殼、青翹等，是早春優(yōu)良觀花灌木[3]。連翹株高約3 m，枝干叢生，小枝黃色，拱形下垂，中空，葉對生，單葉或3小葉，卵形或卵狀橢圓形，緣具齒，花冠黃色，1～3朵生于葉腋；果卵球形、卵狀橢圓形或長橢圓形，先端喙?fàn)顫u尖，表面疏生皮孔，果梗長0.7～1.5 cm。連翹花期在3月至4月，果期在7月至9月，果實(shí)可以入藥[4-5]。連翹性涼味苦，入心、肝、膽經(jīng)，主要成分為連翹苷，每公斤連翹中連翹苷含量可以達(dá)到3%左右，連翹苷可藥用，具有清熱、解毒、散結(jié)排膿等功效[6-8]。臨床上，連翹主要應(yīng)用于治療各種感染性疾病[9]，常作為小兒感冒顆粒、雙黃連口服液、雙黃連粉針劑、清熱解毒口服液、連草解熱口服液、連翹解毒沖劑等中藥制劑的主要原料[10-11]。

據(jù)《中國藥典》記載，小兒感冒顆粒的處方工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立尚不完善，難以滿足國家評價(jià)抽驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。在最新版的2020年版《中國藥典》里的小兒感冒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，也還沒有明確連翹有效成分的含量[13]。基于此，本文利用高效液相色譜法-單因素輪換法進(jìn)行小兒感冒顆粒中連翹苷的提取工藝優(yōu)化，同時(shí)隨機(jī)抽取四個(gè)廠家的小兒感冒顆粒進(jìn)行有效成分連翹苷的含量測定。本研究旨在為進(jìn)一步完善該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥

小兒感冒顆粒(神奇制藥)，連翹苷對照品(批號(hào)：110821-201112純度：96.8%)，甲醇、乙腈，均為色譜醇，其他試劑均為分析醇，中性氧化鋁、農(nóng)夫山泉礦泉水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UItimate3000型高效液相色譜，津工儀器科技有限公司；AE240電子分析天平METTLER TOLEDO；KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；雙列四5L(DK-98-Ⅱ)電熱恒溫水浴鍋，南京伊諾達(dá)儀器設(shè)備有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，津藤實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 連翹苷對照品溶液的制備

稱取連翹苷對照品12.22 mg，純化水溶解并定容至20 mL，搖勻再量取1 mL，定容至25 mL，搖勻即得[14]。

1.2.2 供試品溶液的制備及工藝優(yōu)化

取適量規(guī)格為6 g的小兒感冒顆粒研細(xì)混勻，稱取一定量粉末2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，精密稱重，超聲處理(功率500 W、頻率40 kHz)15 min后，取出，放冷至室溫后再次精密稱重，用上述溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻?yàn)V過，取濾液，過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試品溶液[15]。

以提取溶劑、提取方式、純化方式、提取時(shí)間、稱樣量為考察因素，以供試品溶液中連翹苷的含量為測定指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化供試品溶液的制備工藝。各因素的設(shè)置條件如下：

提取溶劑：50%甲醇、75%甲醇和甲醇；

提取方式：80 ℃加熱回流15 min、室溫超聲處理(500 W、40 kHz)15 min；

超聲提取時(shí)間：15 min、30 min、45 min；

稱樣量：2 g、4 g、6 g。

1.2.3 連翹苷含量的測定及方法學(xué)考察

精密吸取上述連翹苷對照品溶液及供試品溶液通過高效液相色譜儀在特定色譜條件下進(jìn)行連翹苷含量測定，以適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾的75%甲醇為空白溶液。色譜條件具體如下：色譜柱：Thermo SPZ-869(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75)等度洗脫；檢測波長：201 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下，進(jìn)一步確定其線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及加樣回收率。

1.2.4 不同廠家小兒感冒顆粒連翹苷的含量測定

隨機(jī)抽取四個(gè)廠家(999、昆中藥、神奇、小葵花)的小兒感冒顆粒，按1.2.2項(xiàng)下的操作方法制備供試品溶液，根據(jù)1.2.3項(xiàng)下的色譜條件依次測定其連翹苷含量[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小兒感冒顆粒連翹苷的提取工藝研究

表1為提取溶劑的考察結(jié)果。由表1可知，75%甲醇處理的連翹苷提取含量最高，為0.1296 mg/g±0.0046 mg/g，用甲醇提取的連翹苷含量最低，為0.1086 mg/g±0.0086 mg/g，因此連翹苷提取的最佳溶劑為75%甲醇。

表1 提取溶劑的考察Tab.1 Investigation of extraction solvent

以75%甲醇為提取溶劑，考察提取方式對連翹苷提取含量的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，超聲提取法與加熱回流提取法所得的連翹苷含量相差很小，考慮加熱回流的提取方式較為麻煩且耗時(shí)較長，因此選擇超聲提取法作為連翹苷的提取方法。

表2 提取方式的考察Tab.2 Investigation of extraction method

采用超聲提取法進(jìn)行供試品溶液的制備，進(jìn)一步分析提取時(shí)間對連翹苷提取含量的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，隨著超聲時(shí)間的增加，連翹苷含量逐漸增大，但差值均在0.003 mg/g以內(nèi)，從節(jié)約時(shí)間的角度考慮，故以超聲時(shí)間15 min為最佳。

表3 提取時(shí)間的考察Tab.3 Investigation of extraction time

表4是小兒感冒顆粒稱樣量對連翹苷提取含量的影響結(jié)果。由表4可知，隨著稱樣量的增加，樣品中提取出的連翹苷含量依次減少，應(yīng)該是提取溶劑所能溶解的連翹苷達(dá)到飽和，且干擾雜質(zhì)增多所導(dǎo)致的，因此選擇稱樣量為2 g。

表4 稱樣量的考察Tab.4 Investigation of sample weight

2.2 連翹苷含量測定的方法學(xué)考察

2.2.1 最佳波長的確定

圖1是連翹苷對照品溶液在高效液相色譜儀上進(jìn)行全波長掃描的結(jié)果。由圖1可知，連翹苷對照品在201 nm處有最大吸收峰。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，連翹苷溶液在277 nm、278 nm處進(jìn)行含量測定[14，16，18]。本研究經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)探索，最后確定在201 nm處進(jìn)行連翹苷含量測定。

圖1 連翹苷對照品紫外吸收曲線Fig.1 UV absorption curve of forsythin reference substance

2.2.2 線性關(guān)系的考察

取1.2.1項(xiàng)下的連翹苷對照品溶液，分別按照2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL的體積進(jìn)樣，測定峰面積，記錄色譜圖。以濃度(mg/g)為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)計(jì)算回歸方程[16]，結(jié)果見圖2。

圖2 連翹苷的線性回歸曲線Fig.2 Linear regression curve of forsythin

由圖2可知，在線性范圍為0.0473～0.2839 mg/mL內(nèi)，連翹苷的線性回歸方程為Y=109.28x+0.9743，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

取1.2.1項(xiàng)下的連翹苷對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，按照1.2.3項(xiàng)下的色譜條件測定連翹苷的峰面積，結(jié)果見表5。以峰面積計(jì)算RSD，計(jì)算公式如下。

由表5可知，6次進(jìn)樣的峰面積在32.81～33.97之間，RSD為1.39%，說明高效液相色譜儀的精密度良好。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Precision test results

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取小兒感冒顆粒樣品粉末1 g，按1.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照1.2.3項(xiàng)下的操作，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h時(shí)進(jìn)樣，測定連翹苷的峰面積，以峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果見表6。由表6可知，RSD為1.31%，由此說明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Stability test results

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取小兒感冒顆粒樣品粉末6份，按1.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照1.2.3項(xiàng)下色譜條件測定連翹苷的峰面積，以峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果見表7。由表7可知，連翹苷的峰面積在6.97～7.26之間，RSD為1.75%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表7 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Reproducibility test results

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取小兒感冒顆粒樣品粉末1 g，共6份，按1.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密加入濃度0.0237 mg/g的連翹苷對照品溶液0.5 mL，按照1.2.3項(xiàng)下方法測定連翹苷的含量并計(jì)算回收率[17]，結(jié)果見表8。由表8可知，回收率在102.84～104.96之間，RSD為0.83%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

表8 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Spiked recovery test results

2.2.7 陰性對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以75%甲醇為空白對照溶液，進(jìn)行陰性對照實(shí)驗(yàn)。圖3為連翹苷對照品溶液、供試品溶液及空白對照溶液的高效液相色譜圖。如圖3所示，供試品的出峰位置與對照品的出峰位置差不多，都在接近6.5 min出峰，經(jīng)確認(rèn)是連翹苷的色譜峰，而空白溶液在相應(yīng)位置沒有出峰，因此確認(rèn)陰性對照溶液無干擾。

圖3 連翹苷高效液相色譜法測定的色譜圖Fig.3 Chromatogram of forsythin determined by HPLC

2.3 不同廠家小兒感冒顆粒連翹苷含量測定

表9、圖4是999、昆中藥、神奇及小葵花四個(gè)廠家的小兒感冒顆粒連翹苷的含量測定結(jié)果。 由表9、圖4所示，四個(gè)廠家的小兒感冒顆粒連翹苷含量存在一定的差異，其連翹苷含量分別為0.1505 mg/g、0.0931 mg/g、0.1302 mg/g和0.1435 mg/g，其中999小兒感冒顆粒連翹苷含量最高，昆中藥最低。

表9 不同廠家小兒感冒顆粒連翹苷含量測定結(jié)果Tab.9 Determination results of forsythin in Xiaoer Ganmao Granules from different manufacturers

圖4 不同廠家小兒感冒顆粒連翹苷含量測定結(jié)果Fig.4 Determination results of forsythin in Xiaoer Ganmao Granules from different manufacturers

3 結(jié)論

本文采用單因素輪換法，考察了提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間及稱樣量對小兒感冒顆粒連翹苷提取含量的影響，得出最佳工藝為：提取劑為75%甲醇，稱樣量為2 g，室溫超聲提取15 min。在最佳提取工藝條件下，進(jìn)一步對高效液相色譜法進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果顯示，在201nm波長處，0.0473～0.2839 mg/mL線性范圍，連翹苷的線性回歸方程為y=109.28x+0.9743，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，精密度(RSD=1.39%)，穩(wěn)定性(RSD=1.31%)，重現(xiàn)性(RSD=1.75%)均良好。加樣回收率為102.84～104.96，RSD為0.83%，準(zhǔn)確度良好。

上述最佳條件下，對隨機(jī)抽取的999、昆中藥、神奇和小葵花四個(gè)廠家的小兒感冒顆粒進(jìn)行連翹苷含量測定，得到999的連翹苷含量為0.1505 mg/g，昆中藥的連翹苷含量為0.0931 mg/g，神奇的連翹苷含量為0.1302 mg/g，小葵花的連翹苷含量為0.1435 mg/g，其中999廠家的連翹苷含量最高，昆中藥廠家的連翹苷含量最低。