茯神質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

文鑫鑫，萬力華，龍 瀅

(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556000)

茯神(Poria cum Radix Pini)為貴州省的民族用藥，藥用部位為茯苓干燥菌核中間抱有松枝或松根的白色部分[1]。國內(nèi)對茯神化學(xué)成分的研究歷史已有二十多年，目前從茯神中分離鑒定出的特征化合物有幾十種，主要成分是多糖及三萜類化合物，多糖成分主要是茯苓多糖，三萜類成分主要有茯苓酸等[1]?！顿F州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載該品種，標(biāo)準(zhǔn)建立時間較早，方法簡單，僅有性狀檢查，橫截面及粉末的顯微鑒別及理化反應(yīng)。本次試驗根據(jù)藥典方法檢查顯微、水分等常規(guī)項目，重點嘗試建立含量測定的方法，因國內(nèi)尚無茯神中三萜類成分茯苓酸的法定標(biāo)準(zhǔn)品，本次試驗新增以多糖為檢測指標(biāo)的含量測定方法。

1 儀器和材料

1.1 儀器

萊卡DM2500顯微鏡和LAS V3.8顯像系統(tǒng)，Shimadzu UV-2600、UVProbe2.52工作站，Shimadzu UV-2700、UVprobe2.43工作站，數(shù)顯式電熱恒溫六孔水浴鍋，XPE205電子天平，數(shù)控超聲機(jī)器[7]。

1.2 試劑試藥

D-無水葡萄糖(中檢院 110833-201707 含量99.9%)、硫酸(重慶川東化工(集團(tuán))有限公司20160401)、蒽酮(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 20061021)均為分析純；氯仿、環(huán)己烷、乙醚等均為國藥集團(tuán)采購，為分析純；硅膠G板采購于青島海洋、勝海；濾紙為定性濾紙。本次所有實驗樣品均通過貴州中醫(yī)大(原貴陽中醫(yī)學(xué)院)孫慶文教授準(zhǔn)確鑒定為茯神，憑證標(biāo)本存貴州省食品藥品檢驗所。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

松枝橫切面：松枝外側(cè)帶有灰白色菌絲。晚材由3～5列管胞或纖維管胞組成，類長方形或長橢圓形，切向延長，長25～60 μm，寬約35 μm，壁厚10～15 μm，木化。早材管胞呈多邊形或類圓形，直徑50～90 μm，壁厚8～12 μm，木化。射線寬1～2列細(xì)胞，樹脂道類圓形，直徑150～400 μm，上皮細(xì)胞已脫落(圖1)。

圖1 松枝橫切面顯微鑒別Fig.1 Microscopic identification of pine branch cross section

粉末顯微特征：粉末灰黃白色。管胞眾多，直徑50～90 μm，厚8～15 μm，具緣紋孔呈兩行相對排列或一行單列，紋孔直徑20～30 μm。纖維管胞直徑35～60 μm，具單斜紋孔，孔徑15～30 μm。射線薄壁細(xì)胞長條形。菌絲分有節(jié)菌絲和無節(jié)菌絲，極少有棕色菌絲。色素塊黃棕色或紅棕色(圖2)。

圖2 粉末顯微鑒別Fig.2 Microscopic identification of powder

2.2 薄層色譜

稱取茯神粉末約1 g，加入乙醚50 mL，超聲處理約10 min，濾過，濾液在水浴上蒸干，殘渣用甲醇1 mL使溶解，即得供試品[8]。照藥典薄層色譜法[5]試驗，取一張活化好的硅膠G板，點樣量4 μL，展開劑為：三氯甲烷-環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲酸，展開劑比例為(V∶V)(7∶2∶2∶0.2)，顯色劑為含1%香草醛的硫酸溶液，噴灑均勻，105 ℃加熱至斑點清晰。供試品在與對照藥材相同的位置顯相同顏色的斑點，結(jié)果見圖3。

圖3 不同批樣品薄層色譜圖Fig.3 TLC of different samples

2.3 水分、灰分和浸出物

2.3.1 水分

依據(jù)藥典[5]水分測定法的第二法，分別對不同產(chǎn)地的三批次茯神藥材樣品測定水分。其值為12.5%～13.1%，均值為12.7%(結(jié)果見表1)。茯神不含揮發(fā)性物質(zhì)，所以本次試驗水分的測定方法選用了烘干法。

2.3.2 總灰分

依據(jù)藥典[5]四部通則，分別對不同產(chǎn)地三批次茯神藥材樣品測定總灰分。其值為0.25%～0.55%，均值為0.366%(結(jié)果見表1)。

2.3.3 浸出物

依據(jù)藥典[5]四部通則，以其中一批茯神(FS001)為樣品，分別用不同含量乙醇作為溶劑，對冷浸、熱浸法進(jìn)行比較，根據(jù)測定結(jié)果，選稀乙醇作溶劑。測定了3批樣品，以干燥品計算浸出物的含量，其值為5.4%～5.6%，均值為5.5%(結(jié)果見表1)。

表1 不同批號的茯神水分、總灰分、浸出物Tab.1 The moisture，total ash，and extracts of different samples

2.4 含量測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取對照品(D-無水葡萄糖)適量，加水溶解并稀釋成每1 mL中含無水葡萄糖約0.1 mg[7]。

2.4.2 樣品溶液的制備

樣品打粉過2號篩，精密稱取約0.9 g，置具塞錐形瓶中，以80%的乙醇溶液為溶劑，加入50 mL溶劑后，于水浴中回流2 h，用濾紙趁熱過濾，殘渣用熱的溶劑洗滌3次，每次20 mL，將殘渣及濾紙放入具塞錐形瓶中，加入50 mL的水，水浴中回流2 h，趁熱過濾至250 mL的容量瓶中，用熱水洗滌殘渣和錐形瓶3次，每次20 mL，洗液并入容量瓶中，待溶液冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，即得。同法制備空白溶液。

測定法：取干燥的具塞試管，精密量取樣品溶液1 mL加入試管中，加水至2.0 mL，搖勻，精密量取6 mL含0.15%蒽酮的硫酸溶液，快速加入，搖勻，在80 ℃水浴中保溫15 min后，再放置于0 ℃水浴中10 min，取出即得[7]。檢測波長為624 nm，從線性方程上得出葡萄糖的含量[7]。

2.4.3 線性考察

取具塞試管6支，分別精密加入2.4.1項下溶液0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.0 mL、1.2 mL，照2.4.2項下的方法，自“加水至2.0 mL”起，標(biāo)準(zhǔn)曲線用Origin 2018數(shù)據(jù)軟件繪得，橫坐標(biāo)為對照品葡萄糖的濃度(mg/L)，縱坐標(biāo)為吸光度A，回歸方程為A=0.0131x+0.03333(R2=0.999)，結(jié)果表明：該實驗條件下葡萄糖在10.86～65.15 mg/L的范圍線性關(guān)系好[7]。

2.4.4 重復(fù)性

分別精密稱取6份供試品(編號FS003)約0.9 g，按2.4.2項下操作。經(jīng)計算得多糖含量分別為：3.15%、3.15%、3.15%、3.20%、3.20%、3.20%，平均值為3.17%，RSD為0.81%。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Glucose standard curve

2.4.5 穩(wěn)定性

取2.4.4項下溶液，同法檢測，每隔1 h讀數(shù)3次，取平均值，實驗表明，顯色后供試品的溶液6 h內(nèi)吸光度差異不大，RSD為1.21%。

2.4.6 回收率

精密稱取本品(編號FS003)約0.44 g，各6份，各精密加入確定濃度的對照品溶液，按2.4.2項下操作，結(jié)果見表2，均值為101.4%，RSD為1.69%[7]。

表2 加樣回收率結(jié)果Tab.2 Results of spiked recovery tests

2.5 樣品測定

分別稱取3批次茯神樣品約0.88 g各2份，按照2.4.2項下制備供試品溶液，由2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算葡萄糖含量，結(jié)果見表3。

表3 不同批號樣品含量測定Tab.3 Content determination results of different samples

3 討論

1)薄層鑒別參考了茯苓藥材的藥典方法，本方法選用極性低的有機(jī)溶劑乙醚提取茯神三萜類成分中極性較低的成分，避免了提取出的成分過多過雜。原方法的展開劑中含有甲苯，因為甲苯的毒性，希望選擇毒性較低的有機(jī)溶劑替代，通過對茯神的展開劑進(jìn)行了比較和研究，選擇用三氯甲烷和環(huán)己烷的組合替代甲苯，該組合的斑點分離度好，顯色清晰，最終選用了三氯甲烷-環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(v∶v，7∶2∶2∶0.2)作為茯神薄層定性鑒別的展開劑。本試驗同時考察了不同品牌廠家(青島勝海，青島海洋化工)、不同環(huán)境溫度(5 ℃，20 ℃，35 ℃)、不同環(huán)境濕度(28%，52%，88%)等對茯神薄層鑒別分離效果的影響，結(jié)果表明這些因素對分離效果影響不大，該方法分離度好、簡單、耐用性好。

2)本文關(guān)于茯神多糖含量測定對多糖常用的檢測方法蒽酮比色法和苯酚比色法進(jìn)行比較研究，蒽酮比色法的線性、精密度等方面很理想，能很好地滿足茯神含量測定的要求。本實驗同時考察了提取溶劑、提取方法、提取時間等，以及蒽酮硫酸的濃度、顯色時間、溫度，最終確定最優(yōu)含量測定方法。不同產(chǎn)地的茯神含量相對穩(wěn)定，差異不大。

3)本文對3批次的茯神質(zhì)量進(jìn)行了顯微鑒別、薄層色譜鑒別、多糖含量測定、水分等項目的考察，結(jié)果顯示方法可行，可用作茯神的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。