高效液相色譜法檢測(cè)絞股藍(lán)茶中的蔗糖含量

◎ 馬 倩，杜 雨

（安康市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 安康 725000）

絞股藍(lán)是一種被人們廣泛認(rèn)知的藥食同源植物，分布于中國(guó)陜西南部和長(zhǎng)江以南各省[1]。早期絞股藍(lán)作為一種草藥被用于中國(guó)民間醫(yī)藥中，具有清熱解毒、止咳祛痰的功效，長(zhǎng)期喝絞股藍(lán)茶可以保護(hù)人體臟器及內(nèi)分泌器官，從而達(dá)到降血糖和改善糖代謝的作用[2-3]。

現(xiàn)代人對(duì)食品安全的要求不再僅限于吃得好，還要吃得健康。糖是普通食物中的主要成分之一，但是對(duì)一些特殊的消費(fèi)群體，例如糖尿病患者和肥胖癥患者的消費(fèi)者，他們對(duì)糖的攝入量有著嚴(yán)格的要求，因此有必要對(duì)食物中的糖含量進(jìn)行檢測(cè)，以免消費(fèi)者誤用[4]。糖類主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖等，高效液相色譜技術(shù)具備較高的靈敏度，能對(duì)碳水化合物進(jìn)行測(cè)定和分析，能對(duì)多糖類物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確判定，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，受到檢測(cè)人員的青睞[5-6]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于絞股藍(lán)茶中蔗糖的研究鮮有報(bào)道，我國(guó)也沒有出臺(tái)絞股藍(lán)茶中蔗糖含量的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)。本文使用高效液相色譜法對(duì)樣品的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，建立了一種高效、可靠的絞股藍(lán)茶中蔗糖測(cè)定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售絞股藍(lán)22個(gè)樣品。蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.7%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；色譜純乙腈；分析純亞鐵氰化鉀；分析純乙酸鋅；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀LC-20T—示差折光檢測(cè)器（島津公司）；H1850臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；PL-820J智能超聲清洗器（上海五湘儀器儀表公司）；電子分析天平BS-224S（0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電子天平JA5003（0.001 g， 上海良平儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

（1）蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（20 mg·mL-1）。準(zhǔn)確稱取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5000 g于50 mL燒杯中，加少量超純水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，燒杯經(jīng)超純水少量多次淋洗，淋洗液一并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。4 ℃冰箱保存，有效期一個(gè)月。

（2）蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。配制濃度為0.1 mg·mL-1、 0.8 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，臨用時(shí)現(xiàn)配。

（3）亞鐵氫化鉀溶液。稱取10.6 g亞鐵氫化鉀，用超純水溶解定容至100 mL。

（4）乙酸鋅溶液。稱取21.9 g乙酸鋅，用少量水溶解后，加入3 mL冰乙酸，用超純水定容至100 mL。

1.3.2 樣品制備及前處理

取100 g絞股藍(lán)茶樣品，用粉碎機(jī)粉碎至粉末狀，裝入樣品袋中，密封，標(biāo)明唯一性標(biāo)記。準(zhǔn)確稱取均勻絞股藍(lán)茶樣品約5.000 g，置于50 mL刻度離心管中，加入大約20 mL超純水，渦旋混勻，超聲提取，冷卻后，加入亞鐵氰化鉀溶液及乙酸鋅溶液后，混勻，定容，離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜于樣品瓶中，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈+超純水=70+30，流速：1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

色譜柱：氨基的色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

示差折光檢測(cè)器條件：溫度40 ℃。

1.3.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

（1）超聲時(shí)間。在亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液加入量為各3 mL，轉(zhuǎn)速8000 r·min-1，離心3 min的條件下，設(shè)置超聲時(shí)間分別為5 min、10 min、20 min、 30 min、40 min，進(jìn)行樣品制備。

（2）亞鐵氰化鉀、乙酸鋅溶液加入量。在超聲20 min，轉(zhuǎn)速8000 r·min-1，離心3 min的條件下，分別設(shè)置亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液加入量為各 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，進(jìn)行樣品制備。

（3）離心轉(zhuǎn)速。在超聲20 min，亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液加入量為各2.0 mL，離心3 min條件下，設(shè)置轉(zhuǎn)速分別為3000 r·min-1、5000 r·min-1、 8000 r·min-1、10000 r·min-1，進(jìn)行樣品制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化結(jié)果如圖1所示，蔗糖含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，增加到最高值后基本保持不變。分析其原因，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間較短時(shí)，蔗糖沒有被完全提取，蔗糖被完全提取后，再增加超聲時(shí)間，含量便幾乎不再變化，因此，考慮時(shí)間成本以及蔗糖含量，選擇超聲時(shí)間為20 min。

圖1 超聲時(shí)間優(yōu)化結(jié)果圖

2.2 亞鐵氰化鉀、乙酸鋅溶液加入量?jī)?yōu)化結(jié)果

優(yōu)化結(jié)果如表1所示，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅溶液加入量不影響蔗糖含量，隨著加入量的增加，雜質(zhì)峰有所減少，加入量達(dá)到一定程度，雜峰數(shù)量幾乎不再變化。分析其原因，可能是因?yàn)闃悠泛幸欢康鞍踪|(zhì)，而加入2 mL亞鐵氰化鉀和乙酸鋅時(shí)，已將蛋白質(zhì)完全沉淀，因此，考慮試劑成本，選擇加入量為2 mL。

表1 亞鐵氰化鉀、乙酸鋅加入量?jī)?yōu)化結(jié)果表

2.3 離心轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化結(jié)果如表2所示，離心機(jī)轉(zhuǎn)速大小只與分離效果有關(guān)，同等時(shí)間，轉(zhuǎn)速越大，分離效果越佳，考慮離心效果和儀器成本，選擇8000 r·min-1離心3 min。

表2 離心機(jī)轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果表

經(jīng)上述優(yōu)化，得到樣品前處理最優(yōu)流程如下。準(zhǔn)確稱取絞股藍(lán)茶樣品5.000 g左右，置于50 mL刻度離心管中，加入大約20 mL超純水，渦旋混勻，超聲20 min，冷卻后，加入亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液各2.0 mL，混勻，定容，以8000 r·min-1的轉(zhuǎn)速，離心3 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜于樣品瓶中，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 線性回歸方程

將蔗糖標(biāo)準(zhǔn)使用液依次按照色譜條件上機(jī)測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為縱坐標(biāo)（y），以峰面積為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到圖2。線性方程為y=239800x+19980，R2=0.9998。

圖2 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)曲線圖

2.5 方法檢出限與回收率試驗(yàn)

按照前述方法處理，以未添加蔗糖的絞股藍(lán)茶樣品為基質(zhì)，在同等條件下添加標(biāo)液含量為0.1 g/100 g、2.0 g/100 g、6.0 g/100 g蔗糖標(biāo)品，進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平各重復(fù)6次，加標(biāo)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，依據(jù)優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，所得的蔗糖的回收率在85.9%～92.3%，RSD在2.19%～3.07%，該方法的檢出限為0.10 g/100 g。

表3 絞股藍(lán)茶中蔗糖的加標(biāo)回收率表

2.6 樣品的檢測(cè)與分析

在對(duì)市場(chǎng)上的22份絞股藍(lán)茶樣品（編號(hào)為1～22）檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，不同絞股藍(lán)茶蔗糖含量存在一定的差異，檢測(cè)結(jié)果見表4。樣品中蔗糖最低含量為未檢出（＜0.10 g/100 g），最高含量為1.9 g/100 g。一些絞股藍(lán)茶蔗糖含量計(jì)算得到負(fù)值，是因?yàn)榻g股藍(lán)茶本身蔗糖含量較低，測(cè)量存在一定誤差，結(jié)果以未檢出計(jì)。未檢出蔗糖含量的樣品有13個(gè)，檢出樣品含量范圍在0.32～1.90。

表4 絞股藍(lán)茶樣品蔗糖含量檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)語

目前市面上有人工添加蔗糖的現(xiàn)象存在，可能有以下原因。①絞股藍(lán)自重較輕，為了增重，不法商販會(huì)通過添加蔗糖來達(dá)到增加成品重量的目的。②絞股藍(lán)茶口感微苦，人們?yōu)榱苏{(diào)節(jié)口感而添加蔗糖。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于絞股藍(lán)茶中蔗糖含量的檢測(cè)方法、判定標(biāo)準(zhǔn)沒有明確的相關(guān)規(guī)定，監(jiān)管部門和檢測(cè)部門缺乏標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)支撐，對(duì)將蔗糖摻入絞股藍(lán)茶的行為只能依靠生產(chǎn)領(lǐng)域現(xiàn)場(chǎng)取證和現(xiàn)場(chǎng)查處，執(zhí)法難度大，讓不法商人有機(jī)可乘。本文利用高效液相色譜法檢測(cè)絞股藍(lán)茶中蔗糖的含量，樣品經(jīng)水超聲提取，去除蛋白等雜質(zhì)后，進(jìn)行定性定量分析，蔗糖的回收率在85.9%～92.3%，RSD%在2.19～3.07，方法檢出限 0.10 g/100 g，適合于絞股藍(lán)茶中蔗糖的檢測(cè)。