佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠miR145-5p/Smads 通路變化、巨噬細(xì)胞極化及其相關(guān)性分析

范文杰，諶 曦，萬 磊，范海霞，劉天陽，李 明，劉 磊，葛 瑤，王晴晴，費(fèi)陳晨，周 倩

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕科，安徽 合肥 230031）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，其特征在于滑膜關(guān)節(jié)的慢性炎癥、血管翳形成、進(jìn)行性骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞［1］。相關(guān)流行病學(xué)顯示，該病在國內(nèi)的發(fā)病率為0.42%，致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。RA 的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但大量研究表明與免疫反應(yīng)造成的關(guān)節(jié)滑膜炎癥有關(guān)［3］。巨噬細(xì)胞是常見的免疫細(xì)胞，通過分泌、吞噬炎癥介質(zhì)參與人體的免疫反應(yīng)。已有研究表明［4］，RA 疾病發(fā)展的過程中有巨噬細(xì)胞參與。在不同環(huán)境、因素誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞分化成功能不同的具有促炎特性的M1 型巨噬細(xì)胞和抗炎特性的M2 型巨噬細(xì)胞，這就是巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象，巨噬細(xì)胞之間的極化失衡可能是RA 疾病發(fā)展的重要特征［5，6］，但目前RA 疾病發(fā)展過程中巨噬細(xì)胞極化失衡的機(jī)制仍未明確［7］。研究發(fā)現(xiàn)，RA 的巨噬細(xì)胞極化可能與microRNA（miRNA）調(diào)控紊亂及TGF-β1/Smads 信號通路異常激活有關(guān)［8，9］，TGF-β 1/Smads 可通過募集炎性因子、細(xì)胞增殖等形式作用于巨噬細(xì)胞及免疫細(xì)胞等，并以此為靶點(diǎn)促進(jìn)RA 進(jìn)展。miRNA 是高度保守的小型非編碼RNA，在多種疾病中的作用已得到證實(shí)，TGF-β1/Smads 通路參與 RA 巨噬細(xì)胞極化可能與miR145-5p 相 關(guān)［10］。有 報 道 顯 示miR-145-5p 在RA疾病發(fā)展過程中起到重要作用，能夠調(diào)控RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)，可能是治療RA的潛在靶點(diǎn)［11，12］。miR145-5p/Smads 信號的異常激活可能影響RA 的炎癥進(jìn)展，但其對巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制尚未明確。本研究基于佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠（adjuvantarthritis，AA）模 型，觀 察miR145-5p/Smads 信號通路相關(guān)因子及M1、M2 巨噬細(xì)胞主要標(biāo)志物IL-8、CD206 表達(dá)的相關(guān)性來探討AA 大鼠miR145-5p/Smads 通路與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的清潔級SD 雄性大鼠12 只，體質(zhì)量（180±10）g，動 物 許 可 證 號：Lscxk（皖）2017-001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開展實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)得到我院的實(shí)驗(yàn) 動 物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號：AHUCM-rats-2021022。

1.1.2主要試劑 IL8、CD206 試劑購自武漢基因美科技有限公司，貨號分別為JYM0583Ra、JYM1324Ra。ECL 試劑盒購自美國Therm 公司，貨號為340958。弗氏完全佐劑（CFA）購自美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及造模 使用隨機(jī)數(shù)字表法將12 只清潔級SD 雄性大鼠分為正常組與模型組，每組6 只，喂養(yǎng)1 周后將CFA 0.1 mL 注射于模型組各大鼠右后足跖皮內(nèi)造模，復(fù)制AA 大鼠模型。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物IL-8、CD206 的表達(dá)按照試劑盒說明設(shè)置待測樣品及空白孔，37 ℃溫育30 min，加入顯色劑，37 ℃避光顯色10 min，用酶標(biāo)儀檢測IL-8、CD206 吸光度，根據(jù)標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-8、CD206 的含量。

1.2.3免疫蛋白印記法檢測大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TGF-β1/Smads 信號通路相關(guān)因子的表達(dá) 滑膜組織裂解，離心后收集上清液蛋白，加入蛋白上樣緩沖液變性，使用SDS-PAGE 加樣孔電泳。蛋白使用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜后漂洗，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。4 ℃孵育山羊抗兔IgG（1∶1 000）過夜，室溫孵育山羊抗小鼠（1∶20 000）IgG 1.2 h，洗膜后使用ECL 發(fā)光試劑盒檢測蛋白。使用Image J 軟件解析出目的蛋白灰度值，計(jì)算TGF-β1、Smad3、Smad7 相對表達(dá)量，并與內(nèi)參蛋白進(jìn)行對比。

1.2.4RT-qPCR 檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織中miR145-5p、Smad3、Smad7基因的表達(dá) 使用引物見表1，采用Trizol 法提取滑膜巨噬細(xì)胞RNA，PCR儀上42 ℃加熱2 min，冰浴1 min。加入反應(yīng)液置于37 ℃，15 min；85 ℃，5 s ，取出反應(yīng)液（cDNA）作為熒光定量的模板。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性1 min（1 個循環(huán)），95 ℃變性20 s，60 ℃，1 min，40 個循環(huán)。PCR 采集內(nèi)參基因及目的基因的Ct 值，β-actin為 內(nèi) 參，采 用2-△△Ct 法 計(jì) 算miR145-5p、Smad3、Smad7的相對表達(dá)量。

表1 miR145-5p 受體及配體引物序列Tab 1 Sequences of miR-145-5p receptors and ligand primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組滑膜組織中巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的變化

與正常組比較，模型組滑膜IL-8 表達(dá)明顯升高，CD206 表達(dá)明顯降低，模型組巨噬細(xì)胞向M1 型極化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組M1、M2 標(biāo)志物比較（pg/mL ，n=6，xˉ±s）Tab 2 Comparison of markers of M1 and M2 between the two groups（pg/mL ，n=6，xˉ±s）

2.2 兩組滑膜組織中TGF-β1/Smads 通路因子的變化

與正常組比較，模型組TGF-β1、Smad3 表達(dá)升高，Smad7 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3 及圖1。

表3 兩組滑膜中TGF-β1/Smads 通路的變化比較（n=6，xˉ±s）Tab 3 Comparison of changes of TGF-β1/Smads pathway in synovium（n=6，xˉ±s）

圖1 兩組TGF-β1/Smads 通路的變化Fig 1 Changes of TGF-β1/Smads pathway in the two groups

2.3 兩組滑膜組織中miR145-5p/Smads 通路基因表達(dá)

與正常組比較，模型組Smad3表達(dá)升高，miR145-5p、Smad7表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 兩組滑膜中miR145-5p/Smads 通路基因變化比較（n=6，xˉ±s）Tab 4 Comparison of changes in miR145-5p /Smads pathway genes in synovium（n=6，xˉ±s）

2.4 兩組巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物及miR145-5p 與TGF-β1/Smads 通路因子的相關(guān)性分析

通過Spearman 相關(guān)性分析得出，M1 巨噬細(xì)胞標(biāo) 志 物IL-8 與Smad3 呈 正 相 關(guān)（P＜0.01）、與Smad7 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 與Smad3 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）、與Smad7 呈正相關(guān)（P＜0.05），miR145-5p 與Smad3 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）、與Smad7 呈正相關(guān)（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果表明巨噬細(xì)胞M1/M2 失衡與Smad3、Smad7 相 關(guān)，Smad3、Smad7 表 達(dá) 受 到miR145-5p 調(diào)控，見表5。

表5 兩組巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物及miR145-5p 與TGF-β1/Smads 通路因子的相關(guān)性分析Tab 5 Analysis of macrophage polarization markers and correlation between miR145-5p and TGF-β1/Smads pathway factors

3 討論

RA 是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性關(guān)節(jié)炎癥，伴有骨侵蝕和破壞，常累及多器官系統(tǒng)受損［13］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并不能達(dá)到完全治愈疾病的效果，長期藥物治療的同時通常伴隨著嚴(yán)重的副作用［14］。因此，研究RA 進(jìn)展的關(guān)鍵在于闡明關(guān)節(jié)軟骨破壞和滑膜炎癥的發(fā)病機(jī)制，尋找控制RA 發(fā)展的新靶點(diǎn)。

研究表明巨噬細(xì)胞極化在RA 疾病進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［15］。極化的M1 型巨噬細(xì)胞招募炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，包括TNF-α、IL-1、IL-8 等，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，從而加劇關(guān)節(jié)炎癥，極化的M2 巨噬細(xì)胞可以分泌抗炎細(xì)胞因子，如Arg1、IL-10、VEGF、CD206 等，促進(jìn)組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)，從而消除炎癥反應(yīng)。RA 患者滑膜中的巨噬細(xì)胞極化程度反映了RA 的疾病程度，M1 巨噬細(xì)胞表達(dá)于高度活躍的RA 患者體內(nèi)，而在低活動的患者體內(nèi)主要表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞［16］。巨噬細(xì)胞極化向M1 型分化，細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α 和IL-6，除 加劇已有的炎癥反應(yīng)，還能通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞在分化后期凋亡等作用，加重骨侵蝕和關(guān)節(jié)損傷［17］。

RA 的發(fā)病機(jī)制與TGF-β1/Smads 信號通路的過激活有關(guān)［18］，TGF-β1 具有組織修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力，在RA 早期會大量聚集在炎癥局部，T細(xì)胞在其趨化作用下會被快速的募集到炎癥部位，使炎性細(xì)胞大量增殖出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，加重滑膜炎癥，加速RA 的病情進(jìn)程［19，20］。TGF-β1 能通過與跨膜受體激酶結(jié)合激活下游信號［21，22］，其主要的下游信號是Smad 家族（Smad1～Smad8）。Ⅰ型TGF-β受體（transforming growth factorβ receptor Ⅰ，TβRⅠ）被TGF-β1 激活后能磷酸化Smad3 蛋白，磷酸化Smad3 蛋白與Smad4 結(jié)合并易位到細(xì)胞核中，誘導(dǎo)多個靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致RA 關(guān)節(jié)炎癥，而Smad7 能 引 起TβR Ⅰ降 解，從 而 阻 斷Smad3 磷 酸化，抑制TGF-β1 傳導(dǎo)，阻止炎癥對關(guān)節(jié)持續(xù)造成損傷，延緩RA 疾病進(jìn)展。巨噬細(xì)胞在RA 免疫炎癥反應(yīng)過程中起識別、效應(yīng)作用［23］，既往研究表明，TGF-β1/Smads 信號通路過激活，致使M1/M2 型巨噬細(xì)胞平衡失調(diào)，巨噬細(xì)胞向M1 型分化，分泌更多促炎因子和炎性介質(zhì)，參與RA 炎癥反應(yīng)，加重骨破壞［24］。有 研究表明，TGF-β1/Smads 通路參與RA巨噬細(xì)胞極化可能與miR145-5p 相關(guān)［12］。

miRNA 是非編碼的單鏈RNA 家族，約22 個核苷酸，存在于人體多個組織與器官中［25］。miRNA既可以促進(jìn)炎癥發(fā)生，也可以通過負(fù)反饋回路起作用以限制炎癥，在RA 疾病過程中起到重要作用。RA 患者的滑膜及外周血中的miR-145-5p 表達(dá)異常，可能是通過影響相關(guān)信號通路的激活和炎癥因子的分泌，抑制RA 滑膜炎癥程度［26-28］。有研究運(yùn)用熒光素酶測定等方法［29］，驗(yàn)證miR-145-5p 的直接靶基因是Smad3，并且miR-145-5p 抑制了Smad3基因的表達(dá)；通過miR-145-5p 和Smad3 的相關(guān)性分析，結(jié)果表明miR-145-5p 與Smad3 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與Smad7 呈正相關(guān)，說明miR-145-5p 可能通過作用于Smad3 調(diào)控TGF-β1/Smads 信號通路。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化M1 標(biāo)志物IL- 8 與Smad3 呈正相關(guān)，與Smad7 呈負(fù)相關(guān)。M2 標(biāo)志物CD206 與Smad3 呈負(fù)相關(guān)，與Smad7 呈正相關(guān)，以上結(jié)果表明miR145-5p 通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，miR145-5p 可能通過調(diào)控Smad3 表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads 通路過激活，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，參與RA 疾病發(fā)展的過程。

作者貢獻(xiàn)度說明：

范文杰：進(jìn)行試驗(yàn)、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；諶曦：設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并對論文提出指導(dǎo)意見；萬磊、范海霞、劉天陽、李明、劉磊、葛瑤：參與實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及收集數(shù)據(jù)；王晴晴、費(fèi)陳晨、周倩：標(biāo)本采集。