不同炮制方法的巴戟天寡糖對骨質(zhì)疏松模型雄性小鼠氧化應(yīng)激和股骨組織形態(tài)的影響

莊文德，鐘 誠，陳浩諺，王東平，郭浩華，丁 平，晉大祥，謝煒星*

不同炮制方法的巴戟天寡糖對骨質(zhì)疏松模型雄性小鼠氧化應(yīng)激和股骨組織形態(tài)的影響

莊文德1，鐘 誠1，陳浩諺2，王東平1，郭浩華1，丁 平3，晉大祥4，謝煒星4*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 511400 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510405

探討巴戟天寡糖對環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松雄性小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)和股骨組織形態(tài)的影響，并探析炮制工藝對巴戟天寡糖成分及效用的影響。對巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分進(jìn)行提取分離并驗證。將雄性昆明小鼠隨機分為對照組、模型組、維生素D3（5 μg/kg）組及巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組和酒巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組。除對照組外，其余小鼠連續(xù)15 d ig CTX（4.5 mg/kg）制備骨質(zhì)疏松模型，造模結(jié)束后，給予相應(yīng)藥物干預(yù)4周，測定各組小鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；采用Micro-CT對股骨遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；采用三點彎曲法測定骨生物力學(xué)參數(shù)；制片測量骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖的6種寡糖成分的含量不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量較酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-無水葡萄糖的含量更多。與模型組相比，巴戟天寡糖低劑量組小鼠股骨的骨密度顯著增加（＜0.01）；骨生物力學(xué)參數(shù)改善（＜0.05、0.01）；血清MDA水平降低（＜0.05）；松質(zhì)骨的骨小梁面積比（percentage of trabecular bone area，Tb.Ar）、熒光標(biāo)記周長比（percentage of fluorescent label perimeter，L.Pm）、骨礦化沉積率（mineral apposition rate，MAR）及骨形成率（bone formation rate to bone volume，BFR/BV）顯著升高（＜0.05、0.01），骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）和破骨細(xì)胞數(shù)目（number of osteoclast，OC.N）顯著降低（＜0.01）；皮質(zhì)骨的MAR顯著降低（＜0.05），BFR/BV顯著升高（＜0.01）。巴戟天寡糖高劑量組小鼠骨密度顯著增加（＜0.01）；血清中CAT活性顯著升高（＜0.01）；松質(zhì)骨組織中Tb.Ar顯著升高（＜0.05），Tb.Sp顯著降低（＜0.05）。酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠骨密度顯著增加（＜0.01）；骨生物力學(xué)參數(shù)改善（＜0.05）；血清GSH-Px活性升高（＜0.01）；松質(zhì)骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV顯著升高（＜0.05、0.01），Tb.Sp和OC.N顯著降低（＜0.05、0.01）；皮質(zhì)骨的MAR顯著降低（＜0.05），BFR/BV顯著升高（＜0.05）。酒巴戟天寡糖高劑量組小鼠血清中CAT活性顯著升高（＜0.01），對于骨結(jié)構(gòu)改變則無明顯影響作用。不同炮制工藝會影響巴戟天寡糖的成分含量。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均能不同程度地改善氧化應(yīng)激指標(biāo)，但低劑量的巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖對于改善CTX引起的骨質(zhì)疏松的作用更為顯著。

巴戟天寡糖；酒炙；-果糖；蔗糖；1-蔗果三糖；耐斯糖；1F-果呋喃糖基耐斯糖；(+)-無水葡萄糖；氧化應(yīng)激；骨質(zhì)疏松

隨著老年化社會的來臨，男性骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）的發(fā)病率也逐年升高。據(jù)報道，50歲以上的群體中男性O(shè)P患病率為6.0%，需要進(jìn)行防治的低骨量男性群體患病率高達(dá)46.9%[1]，而且伴隨年齡的增加，男性O(shè)P患者意外骨折后死亡率更高[2]，具有高危害性。現(xiàn)代研究表明人體衰老的發(fā)生發(fā)展與機體氧化應(yīng)激水平緊密聯(lián)系[3]，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致OP發(fā)病一大原因[4]。目前批準(zhǔn)用于治療男性O(shè)P藥物主要是雙膦酸鹽類、活性維生素D制劑以及降鈣素類藥物，長期使用會出現(xiàn)不良反應(yīng)，治療手段較局限[5-6]。根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》理論，人體的衰老、OP的發(fā)病均與腎陽虛衰有密切聯(lián)系。巴戟天How具有補腎陽、壯筋骨、祛風(fēng)濕的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老、抗氧化等多種生物活性，而且酒炙炮制后，其效應(yīng)會發(fā)生改變。此外，巴戟天寡糖作為巴戟天主要的藥效成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可占藥材干質(zhì)量的10%以上[7-12]?；诖?，本研究通過以巴戟天寡糖及酒制巴戟天寡糖干預(yù)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）致OP雄性小鼠，考察其氧化應(yīng)激指標(biāo)及股骨骨密度、骨微結(jié)構(gòu)變化，探究巴戟天寡糖抗OP作用及炮制工藝對巴戟天寡糖效應(yīng)的影響，以期為研究男性O(shè)P的治療及巴戟天寡糖的進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，4周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SYXK（粵）2018-0085。動物飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、濕度40%～60%的環(huán)境中，室內(nèi)照明以自然采光為主，通風(fēng)良好，環(huán)境較安靜。動物實驗符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

注射用CTX（批號9F312A）購自Baxter Oncology GmbH公司；維生素D3滴劑（批號20180401-1）購自杭州海王生物工程有限公司；巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院丁平教授提供；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號20191209）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號20191218）、過氧化氫酶（catalase，CAT）可見光試劑盒（批號20191214）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

Primaide高效液相色譜儀（日本日立高新技術(shù)公司）；UM5800型蒸發(fā)光散射檢測器（上海通微分析技術(shù)有限公司）；XR 205SM-DR型電子分析天平（瑞士Precisa公司）；DFT-200型高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；CQ-200型超聲波清洗器（上海音波聲電科技公司）；Eclipse TE2000-5型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；BC-2800Vet型全自動動物血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；1510型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CT14RD型低速冷凍離心機（天美科學(xué)儀器有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；SkyScan 1276 Micro-CT掃描儀（美國Bruker公司）。

2 方法

2.1 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分的驗證

2.1.1 樣品制備 分別取巴戟天寡糖、酒巴戟天寡糖各0.1 g，加入60%乙腈溶解并定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 色譜條件 Waters XBridgeTM Amide色譜柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相為0.2%三乙胺乙腈（A）-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，75%～70% A；10～20 min，70% A；20～45 min，70%～60% A；45～60 min，60% A；60～63 min，60%～75% A；63～75 min，75% A。體積流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）漂移管溫度為75 ℃；氮氣體積流量為2.0 L/min；柱溫為35 ℃。

2.2 動物分組、造模及給藥

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、維生素D3（5 μg/kg）組及巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組和酒巴戟天寡糖低、高劑量（50、200 mg/kg）組，每組13只。除對照組外，其余各組小鼠ig CTX（4.5 mg/kg）制備OP模型[13]，對照組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)15 d。造模結(jié)束后，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。觀察各組小鼠的運動狀態(tài)、精神狀態(tài)、毛發(fā)外觀等變化。

2.3 各組小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的檢測

給藥4周后，小鼠ip戊巴比妥鈉（1 mL/kg）后進(jìn)行腹主動脈采血，全血于室溫放置，分層后3500 r/min離心10 min，取上層血清，按試劑盒說明書測定血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平。

2.4 各組小鼠股骨Micro-CT檢測

給藥結(jié)束后，小鼠ip戊巴比妥鈉（1 mL/kg）安樂死，逐層分離骨組織肌肉，取右側(cè)股骨行Micro-CT連續(xù)掃描，掃描參數(shù)：電流100 μA；電壓80 kV；掃描厚度15 μm；濾片0.5 mm；掃描方向沿股骨長軸掃描股骨遠(yuǎn)端，最終獲取連續(xù)平面Micro-CT圖像。掃描完成后在主機上選出股骨遠(yuǎn)端1.5 mm的區(qū)域為感興趣區(qū)域（range of interests，ROI），在配套軟件上分析骨密度。

2.5 各組小鼠股骨生物力學(xué)性能的測定

用游標(biāo)卡尺測量小鼠股骨的長度、短軸寬度和長軸寬度，用萬能材料試驗機進(jìn)行三點彎曲試驗，測定骨骼的最大載荷、最大撓度、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變和能量吸收值。

2.6 各組小鼠松質(zhì)骨及皮質(zhì)骨形態(tài)計量學(xué)分析

取各組小鼠松質(zhì)骨及皮質(zhì)骨，制備不脫鈣骨組織塑料切片，并對組織切片進(jìn)行測量，進(jìn)行骨組織形態(tài)計量學(xué)分析。分別測量并計算骨小梁面積比（percentage of trabecular bone area，Tb.Ar）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、皮質(zhì)骨面積比（percentage of cortical bone area，Ct.Ar）、骨髓腔面積比（percentage of marrow-cavity area，Ma.Ar）、熒光標(biāo)記周長比（percentage of fluorescent label perimeter，L.Pm）、骨礦化沉積率（mineral apposition rate，MAR）、骨形成率（bone formation rate to bone volume，BFR/BV）和破骨細(xì)胞數(shù)目（number of osteoclast，OC.N）等參數(shù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖的成分分析

如圖1和表1所示，巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中6種寡糖的含量不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量較酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-無水葡萄糖的含量更多。

3.2 動物行為學(xué)觀察

與對照組比較，模型組小鼠毛發(fā)稀疏干枯，懶動思臥，精神狀態(tài)欠佳。與模型組比較，各給藥組小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)較光亮。對照組小鼠無死亡，模型組死亡2只，維生素D3組死亡1只，巴戟天寡糖低劑量組死亡2只，巴戟天寡糖高劑量組無死亡，酒巴戟天寡糖低劑量組無死亡，酒巴戟天寡糖高劑量組死亡3只。

1-D-果糖 2-D(+)-無水葡萄糖 3-蔗糖 4-1-蔗果三糖 5-耐斯糖 6-1F-果呋喃糖基耐斯糖

表1 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中6種寡糖成分

Table 1 Six oligosaccharides in M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides

組別質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g?1) D-果糖D(+)-無水葡萄糖蔗糖1-蔗果三糖耐斯糖1F-果呋喃糖基耐斯糖 巴戟天寡糖62.0206.39573.93064.869100.854148.458 酒巴戟天寡糖56.22925.09767.92239.45088.319141.863

3.3 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中GSH-Px和CAT活性均顯著降低（＜0.05、0.01），MDA水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，維生素D3組小鼠血清中GSH-Px和CAT活性均顯著升高（＜0.05），MDA水平顯著降低（＜0.05）；巴戟天寡糖低劑量組小鼠血清中MDA水平顯著降低（＜0.05）；巴戟天寡糖高劑量組小鼠血清中CAT活性顯著升高（＜0.01）；酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠血清中GSH-Px活性顯著升高（＜0.01）；酒巴戟天寡糖高劑量組小鼠血清中CAT活性顯著升高（＜0.01）。

表2 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的影響()

Table 2 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on GSH-Px, CAT activities and MDA level in serum of OP mice ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只GSH-Px/(μmol·L?1)CAT/(U·mL?1)MDA/(nmol·mL?1) 對照—13629.05±92.997.89±1.954.31±2.32 模型—11553.54±68.21#3.38±0.64##7.84±4.79# 維生素D3—12658.01±50.99*7.38±0.75*4.03±2.56* 巴戟天寡糖5011610.29±72.195.49±2.255.69±2.26* 20013604.98±58.337.37±2.44**6.16±2.88 酒巴戟天寡糖5013707.23±97.83**6.31±2.757.28±1.87 20010563.70±126.208.57±1.88**6.80±2.18

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.4 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠皮質(zhì)骨變薄，骨髓腔增大，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化，呈現(xiàn)出明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞。與模型組比較，各給藥組小鼠皮質(zhì)骨面積增加，骨髓腔縮小，骨小梁數(shù)量、寬度、長度、形態(tài)部分恢復(fù)，密度和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聯(lián)結(jié)性增加。其中，巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組基本達(dá)到對照組水平，與維生素D3組基本一致。

圖2 各組小鼠股骨遠(yuǎn)端Micro-CT X-Y三維剖面圖

3.5 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨骨密度的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠股骨骨密度顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，除酒巴戟天寡糖高劑量組外，其余各給藥組小鼠股骨骨密度均顯著升高（＜0.01）。

表3 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨骨密度的影響()

Table 3 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on femoral bone density of OP mice ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只骨密度/(g·cm?2) 對照—130.098±0.009 模型—110.054±0.005## 維生素D3—120.076±0.005** 巴戟天寡糖50110.097±0.013** 200130.081±0.010** 酒巴戟天寡糖50130.093±0.018** 200100.056±0.018

3.6 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨生物力學(xué)性能的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠股骨的最大載荷、最大應(yīng)力及最大應(yīng)變均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組相比，維生素D3組、巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠股骨的最大應(yīng)力及最大應(yīng)變均顯著升高（＜0.05、0.01）；巴戟天寡糖低劑量組小鼠股骨的最大載荷顯著升高（＜0.05）。

3.7 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的影響

如表5所示，與對照組比較，模型組小鼠松質(zhì)骨組織中Tb.Th無顯著變化，但Tb.Ar、Tb.N、L.Pm、MAR和BFR/BV均顯著降低（＜0.01），Tb.Sp和OC.N顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，維生素D3組、巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠松質(zhì)骨組織中Tb.Ar、L.Pm、MAR、BFR/BV顯著升高（＜0.05、0.01），Tb.Sp和OC.N顯著降低（＜0.05、0.01）；巴戟天寡糖高劑量組小鼠松質(zhì)骨組織中Tb.Ar顯著升高（＜0.05），Tb.Sp顯著降低（＜0.05）。

表4 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖對OP小鼠股骨生物力學(xué)性能的影響()

Table 4 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on biomechanical properties of femurs in OP mice ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只最大載荷/N最大撓度/mm最大應(yīng)力/MPa最大應(yīng)變/%能量吸收值/J 對照—13135.5±20.21.05±0.46103.5±26.14.52±0.650.075±0.018 模型—1199.5±15.3#0.93±0.1283.0±18.5#2.23±0.23##0.058±0.012 維生素D3—12113.2±17.51.03±0.38102.5±16.7*4.32±0.31**0.065±0.015 巴戟天寡糖5011123.9±19.3*1.04±0.44101.8±14.9*4.21±0.32**0.064±0.017 20013110.3±14.80.94±0.1694.6±0.02.51±0.260.059±0.016 酒巴戟天寡糖5013116.8±16.71.00±0.33102.8±14.9*3.94±0.37*0.064±0.011 20010101.6±13.60.82±0.1586.7±20.12.66±0.940.060±0.012

表5 各組小鼠松質(zhì)骨靜態(tài)和動態(tài)參數(shù)的變化()

Table 5 Changes of static and dynamic parameters in cancellous bone of mice in each group ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只 Tb.Ar/%Tb.Th/μmTb.N/mm?1Tb.Sp/μmL.Pm/%MAR/(μm·d?1)BFR/BV/%OC.N/mm2 對照—13 20.5±7.352.5±12.33.1±0.9286.4±28.518.0±5.48.5±0.2276.2±35.64.0±1.5 模型—11 5.5±1.2##49.6±15.60.9±0.1##470.9±63.6##9.5±3.6##4.5±0.1##123.1±20.5##19.5±3.6## 維生素D3—12 8.6±1.3*50.6±11.31.0±0.3305.8±31.4**15.2±3.7*6.5±0.3*256.8±10.3**10.2±2.0** 巴戟天寡糖5011 10.5±2.3**52.5±18.21.0±0.4310.3±32.1**16.3±5.5*6.3±0.2*256.5±20.6**10.0±1.9** 20013 9.5±1.6*48.5±14.60.9±0.1350.1±37.6*10.1±4.84.7±0.1166.5±20.418.3±1.3 酒巴戟天寡糖5013 11.5±2.4**53.6±16.41.0±0.3365.7±26.1*16.2±5.5*6.4±0.2*242.9±31.3**11.7±2.6** 20010 5.9±1.449.7±12.40.8±0.1471.0±94.510.7±2.54.6±0.2155.9±29.217.0±2.3

如表6所示，與對照組比較，模型組小鼠皮質(zhì)骨中Ct.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV均顯著降低（＜0.05、0.01），Ma.Ar顯著增加（＜0.01），提示CTX誘導(dǎo)雄性小鼠皮質(zhì)骨變薄，骨量丟失，生成速度減慢。與模型組比較，維生素D3組、巴戟天寡糖低劑量組和酒巴戟天寡糖低劑量組小鼠皮質(zhì)骨組織中Ma.Ar顯著降低（＜0.05），BFR/BV顯著升高（＜0.05、0.01）。

表6 各組小鼠皮質(zhì)骨靜態(tài)和動態(tài)參數(shù)的變化()

Table 6 Changes of static and dynamic parameters in cortical bone of mice in each group ()

組別劑量/(mg·kg?1)n/只Ct.Ar/%Ma.Ar/%L.Pm/%MAR/(μm·d?1)BFR/BV/% 對照—1370.5±7.320.6±4.333.5±3.64.4±0.573.1±10.5 模型—1155.5±11.4#29.6±5.6##25.2±5.4#2.8±0.1#56.4±5.6## 維生素D3—1256.8±8.323.6±5.3*26.0±3.03.1±0.364.8±5.3* 巴戟天寡糖501156.5±9.323.5±4.2*26.3±5.23.1±0.269.5±4.2** 2001359.5±8.628.5±4.625.1±4.72.9±0.156.5±6.2 酒巴戟天寡糖501357.5±10.424.6±6.4*27.3±3.33.0±0.262.9±4.6* 2001058.4±8.429.7±2.426.7±2.62.4±0.254.9±6.3

4 討論

《素問·上古天真論》曾言“丈夫······六八陽氣衰竭于上，面焦，發(fā)鬢頒白。七八肝氣衰，筋不能動。八八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極，則齒發(fā)去”。男性在生長發(fā)育以及衰老過程中需要耗損大量陽氣，其中又以腎陽耗損最重[14]?！端貑枴り庩杽e論篇》中云：“陽氣虛，則為偏枯。陽虛而不能養(yǎng)筋，則為痿”。腎陽虛衰，無以溫煦濡養(yǎng)筋脈骨骼，甚則骨枯髓減，進(jìn)展為“骨痿”。由此可見，運用補腎陽法干預(yù)男性O(shè)P的發(fā)病及進(jìn)展具有中醫(yī)理論上的依據(jù)。

現(xiàn)代研究表明，機體進(jìn)入衰老狀態(tài)后，骨微環(huán)境中增多的促炎性分泌蛋白會導(dǎo)致OP的發(fā)生[15]，而衰老是細(xì)胞內(nèi)成分累積性氧化損傷的結(jié)果，因此機體抗氧化系統(tǒng)對于延緩衰老及防治OP至關(guān)重要[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)CTX具有生殖毒性、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)，不少研究者利用CTX構(gòu)建與衰老、骨質(zhì)疏松、組織高氧化應(yīng)激狀態(tài)等相關(guān)小鼠模型[12,17]。因此，本研究利用CTX干預(yù)雄性昆明小鼠構(gòu)建OP模型，發(fā)現(xiàn)模型小鼠具有骨密度下降、骨量嚴(yán)重丟失、骨微結(jié)構(gòu)破壞、氧化應(yīng)激指標(biāo)升高等特點，可用于模擬男性O(shè)P機體狀態(tài)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)臨床上運用補腎陽法治療男性O(shè)P患者，能夠有效改善骨密度及骨代謝指標(biāo)[18]，但其具體機制尚不明確。目前，大量研究表明肉蓯蓉、淫羊藿、杜仲等補腎陽中藥能夠提高雄性實驗鼠體內(nèi)組織中GSH-Px活性，降低MDA水平，延緩或逆轉(zhuǎn)其組織的氧化損傷，還能夠提高骨骼質(zhì)量、骨密度，改善骨小梁結(jié)構(gòu)等[19-24]，更進(jìn)一步地揭示了男性O(shè)P的發(fā)病與氧化應(yīng)激具有一定聯(lián)系，但目前從氧化應(yīng)激角度探討男性O(shè)P的發(fā)病及治療的研究仍相對較少。因此，本研究使用巴戟天寡糖干預(yù)CTX致OP的雄性小鼠，發(fā)現(xiàn)其可以有效改善實驗小鼠的骨密度、持續(xù)骨丟失及骨微結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，同時調(diào)節(jié)血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平。本研究還發(fā)現(xiàn)與維生素D3相比，巴戟天寡糖在改善骨密度上效果更明顯，在改善其余OP及氧化應(yīng)激指標(biāo)上則作用相近，表明巴戟天寡糖具有較好的抗OP及改善氧化應(yīng)激作用，而且可能通過調(diào)節(jié)雄性實驗鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)揮抗OP作用，但這仍需進(jìn)一步實驗證實。

研究發(fā)現(xiàn)，炮制后的巴戟天化學(xué)成分與作用效果發(fā)生改變，巴戟天酒炙后在機體能量代謝上具有與鹽炙相似的炮制增效作用，且作用較鹽炙更優(yōu)；巴戟天酒炙后寡糖對生精障礙雄性小鼠生殖氧化應(yīng)激作用明顯優(yōu)于生巴戟天寡糖[12,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)巴戟天寡糖與酒巴戟天寡糖在6種寡糖成分的含量上均有不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量較酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-無水葡萄糖的含量更多。

本研究結(jié)果顯示，巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均有較好的抗OP及改善氧化應(yīng)激作用，但巴戟天寡糖改善血清MDA水平更顯著，酒巴戟天寡糖在改善GSH-Px指標(biāo)上更為明顯。低劑量的巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖能夠升高CTX致OP小鼠松質(zhì)骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR和BFR/BV，顯著降低Tb.Sp和OC.N，一定程度上恢復(fù)變薄的皮質(zhì)骨，減少皮質(zhì)骨量丟失，增加皮質(zhì)骨生成速度，與維生素D3作用相近，具有較好的抗OP作用。這可能是巴戟天寡糖調(diào)控骨保護素/核因子κB受體活化因子配體/核因子κB受體活化因子（osteoprotegerin/ receptor activator of nuclear factor-κB/receptor activator of nuclear factor κB ligand，OPG/RANK/ RANKL）通路從而發(fā)揮抗OP的作用[27]，但炮制后巴戟天寡糖的寡糖成分含量發(fā)生改變和劑量的不同，也影響其效用發(fā)揮，目前相關(guān)研究較少，其潛在機制尚不明確，這也提示可以進(jìn)一步探討巴戟天寡糖中不同寡糖成分的作用及效應(yīng)機制，以明確巴戟天抗骨質(zhì)疏松的有效成分及具體機制。

目前，臨床上尚無針對男性O(shè)P的專門用藥，且許多含有補腎陽藥的抗OP藥物服用周期往往較長，一般為3～6個月，患者容易出現(xiàn)口干、便秘、面紅等不良反應(yīng)，無法長期服用[28]。同時，中藥飲片質(zhì)量良莠不齊，便攜性差，也影響了其推廣與使用[29]。巴戟天寡糖具有低熱、穩(wěn)定、安全無毒等良好理化性質(zhì)，并且已有中成藥制劑應(yīng)用于臨床[30]，在抗OP方面具有較好的應(yīng)用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofoligosaccharides concocted by different methods on oxidative stress and femoral tissue morphology in osteoporotic male mice

ZHUANG Wen-de1, ZHONG Cheng1, CHEN Hao-yan2, WANG Dong-ping1, GUO Hao-hua1, DING Ping3, JIN Da-xiang4, XIE Wei-xing4

1. The First Clinical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. School of Materials Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 511400, China 3. School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 4. Department of Spinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China

To investigate the effects ofoligosaccharides (MO) on oxidative stress indexes and femoral tissue morphology in male mice with cyclophosphamide (CTX)-induced osteoporosis, and explore the effects of processing technology on the composition and efficacy of MO.The components in MO and wineoligosaccharides (WMO) were extracted, separated and verified. Male Kunming mice were randomly divided into control group, model group, vitamin D3(5 μg/kg) group, MO low-and high-dose (50, 200 mg/kg) groups, WMO low-and high-dose (50, 200 mg/kg) groups. Except for control group, the other mice were continuously ig CTX (4.5 mg/kg) for 15 d to establish osteoporosis models. After the modeling, mice were given corresponding drug for 4-week intervention, glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activities and malondialdehyde (MDA) level in serum of mice in each group was measured; Micro-CT was used to analyze distal femur bone microstructure; Three-point bending method was used to determine bone biomechanical parameters; Slices were used to measure bone histomorphometric parameters.MO and WMO had different contents of six kinds of oligosaccharides. Contents of-fructose, sucrose, 1-fructose, nystose and 1F-fructofuranosylnystose in MO was higher than that of WMO, while content of(+)-anhydroglucose was higher in WMO. Compared with model group, bone mineral density of femur of mice in WO low-dose group was significantly increased (< 0.01), bone biomechanical parameters were improved (< 0.05, 0.01), MDA level in serum was decreased (< 0.05); Percentage of trabecular bone area (Tb.Ar), percentage of fluorescent label perimeter (L.Pm), mineral apposition rate (MAR) and bone formation rate to bone volume (BFR/BV) in cancellous bone were significantly increased (< 0.05, 0.01), trabecular separation (Tb.Sp) and number of osteoclasts (OC.N) were significantly decreased (< 0.01); MAR in cortical bone was significantly decreased (< 0.05), and BFR/BV was significantly increased (< 0.01). Bone mineral density of mice in MO high-dose group was significantly increased (< 0.01), CAT activity in serum was significantly increased (< 0.01), Tb.Ar in cancellous bone tissue was significantly increased (< 0.05), Tb.Sp was decreased (< 0.05). Bone mineral density in WMO low-dose group was significantly increased (< 0.01), bone biomechanical parameters were improved (< 0.05), GSH-Px activity in serum was increased (< 0.01); Tb.Ar, L.Pm, MAR and BFR/BV in cancellous bone were significantly increased (< 0.05, 0.01), Tb.Sp and OC.N were significantly decreased (< 0.05, 0.01); MAR in cortical bone was significantly decreased (< 0.05), BFR/BV was significantly increased (< 0.05). CAT activity in serum of mice in WMO high-dose group was significantly increased (< 0.01), but had no significant effect on the changes of bone structure.Different processing techniques can affect the content of MO. MO and WMO can improve oxidative stress indicators to varying degrees, but effect of low dose MO and WMO on improving CTX-induced osteoporosis are more significant.

oligosaccharides; wine process;-fructose; sucrose; 1-fructose; nystose; 1F-fructofuranosylnystose;(+)-anhydroglucose; oxidative stress; osteoporosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5409 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.017

2022-04-22

國家自然科學(xué)基金資助項目（82074007）

莊文德，碩士研究生，研究方向為中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松。Tel: 15768884884 E-mail: 20201120142@stu.gzucm.edu.cn

謝煒星，副主任醫(yī)師，研究方向為脊柱外科及骨質(zhì)疏松防治。Tel: 13560079199 E-mail: xwx841211@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]