一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材及制劑雷公藤多苷片中7個(gè)質(zhì)控成分

姬翔宇，張子雯，陳姿伊，周斌鋮，葉春穎，計(jì)燕萍*，詹淑玉*

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材及制劑雷公藤多苷片中7個(gè)質(zhì)控成分

姬翔宇1, 2，張子雯2，陳姿伊2，周斌鋮2，葉春穎2，計(jì)燕萍2*，詹淑玉2*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311403 2. 嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001

為提高雷公藤質(zhì)量控制水平，建立同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材及制劑雷公藤多苷片中7個(gè)成分的一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS）方法。采用HPLC法，以雷酚內(nèi)酯為參照物，計(jì)算其它6種成分雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的相對(duì)校正因子（f/s），并對(duì)f/s進(jìn)行耐用性考察。搜集不同產(chǎn)地、廠家及不同批號(hào)的9批雷公藤藥材和10批雷公藤多苷片，分別采用外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定7個(gè)成分含量，比較兩者的差異。各個(gè)成分的f/s重復(fù)性良好，對(duì)19批樣品運(yùn)用QAMS法和外標(biāo)法得到的各成分含量無(wú)顯著性差異（相對(duì)平均偏差＜3%）；不同廠家、不同批號(hào)及不同產(chǎn)地來(lái)源的雷公藤多苷片及雷公藤藥材中7個(gè)成分含量均存在較大差異，說(shuō)明應(yīng)提高雷公藤中藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。所建立的QAMS法準(zhǔn)確性高，可用于雷公藤藥材及其相關(guān)制劑的多成分同時(shí)定量分析，為雷公藤中藥的全面質(zhì)量控制提供方法參考。

一測(cè)多評(píng)法；雷公藤；雷公藤多苷片；質(zhì)量控制；雷酚內(nèi)酯；雷公藤甲素；雷公藤內(nèi)酯酮；雷公藤晉堿；雷公藤次堿；雷公藤紅素；雷公藤內(nèi)酯甲；相對(duì)校正因子

雷公藤來(lái)源于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Hook. f.的干燥根，產(chǎn)于浙江、安徽、福建、云南、廣西等地，具有清熱解毒、消腫止痛、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血、殺蟲(chóng)止血等功效[1]，主要含有二萜類、三萜類、生物堿和倍半萜類等多種活性成分[2]。雷公藤多苷（polyglycoside）是從雷公藤藥材中提取的總苷混合物，為我國(guó)首先研究利用的抗炎免疫調(diào)節(jié)中藥提取物，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病腎病、紫癜性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等難治性或頑固性疾病療效顯著，有“中草藥激素”之稱[3-7]。雷公藤多苷中的主要成分如雷公藤紅素、雷公藤晉堿和雷公藤次堿等既是有效成分也是毒性成分，由其導(dǎo)致的不良反應(yīng)多發(fā)[8-10]，在一定程度上限制了中藥雷公藤的臨床應(yīng)用。

目前，市場(chǎng)上雷公藤藥材及雷公藤多苷片（polyglycosides Tablets，TWPT）魚(yú)目混雜，不同來(lái)源的藥材及制劑中主要成分含量往往差異較大，而多數(shù)僅以雷公藤甲素或雷公藤紅素為單一評(píng)價(jià)指標(biāo)[11-14]，質(zhì)量控制水平不足是雷公藤藥材及其制劑產(chǎn)生不良反應(yīng)的主要原因之一。雷公藤藥材及TWPT定性分析研究[15-18]已經(jīng)廣泛開(kāi)展，而對(duì)其多成分的定量研究還很有限，現(xiàn)有方法主要基于HPLC，采用常規(guī)的外標(biāo)法測(cè)定了雷公藤藥材或TWPT中幾種含量較高、且對(duì)照品易得的成分[19-20]，還無(wú)法全面控制雷公藤藥材及其制劑的質(zhì)量，特別是對(duì)于一些對(duì)照品難以獲取、價(jià)格昂貴的成分，對(duì)其進(jìn)行定量分析還存在較多限制。

一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi- components with a single-marker，QAMS）法是近年來(lái)在中藥研究領(lǐng)域內(nèi)普遍認(rèn)可、應(yīng)用較廣泛的中藥質(zhì)量控制模式，它是利用中藥各有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系（相對(duì)校對(duì)因子，f/s），通過(guò)只測(cè)定某一典型組分的含量，來(lái)實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)成分的同步測(cè)定[21]。目前，在中藥質(zhì)量控制中QAMS的研究方法體系日益完善，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大[22-25]。雖然已有關(guān)于雷公藤提取物QAMS法的研究報(bào)道[26]，但還存在著測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)、方法普適性不高及分析樣本量不足等問(wèn)題，另外還未見(jiàn)有關(guān)雷公藤制劑的QAMS法含量測(cè)定。因此，本研究基于優(yōu)化的HPLC色譜條件，采用QAMS法對(duì)不同產(chǎn)地、來(lái)源的9批雷公藤藥材以及不同廠家、批號(hào)的10批TWPT樣品中的7個(gè)質(zhì)控成分進(jìn)行定量分析。以雷酚內(nèi)酯為參照物，計(jì)算雷公藤藥材及多苷片中其他6種成分雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的f/s，并對(duì)f/s進(jìn)行耐用性考察，在此基礎(chǔ)上對(duì)19批樣品采用QAMS法進(jìn)行了多成分含量測(cè)定，并與外標(biāo)法的結(jié)果進(jìn)行比較，證明了QAMS法的可行性。本研究基于QAMS法開(kāi)展雷公藤藥材及制劑TWPT的多指標(biāo)含量分析，以期為雷公藤藥材及制劑的全面質(zhì)量控制提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；XS105DualRange型十萬(wàn)分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；QE-500型粉碎機(jī)，江陰市中恒元機(jī)械制造有限公司；HC-1014型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Merck Millipore Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，美國(guó)默克密理博公司。

1.2 試藥

對(duì)照品雷公藤甲素（批號(hào)7675）、雷公藤紅素（批號(hào)5664）、雷公藤內(nèi)酯酮（批號(hào)4648），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98.0%，購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；對(duì)照品雷酚內(nèi)酯（批號(hào)C16O8G45829，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、雷公藤內(nèi)酯甲（批號(hào)KA0809CB14，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品雷公藤次堿（批號(hào)DST200819-078，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、雷公藤晉堿（批號(hào)DST201101-080，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA公司），磷酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），三氯甲烷（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

1.3 藥材及制劑

收集不同廠家共10批TWPT及不同產(chǎn)地和來(lái)源共9批雷公藤藥材進(jìn)行含量測(cè)定，9批藥材經(jīng)嘉興學(xué)院詹淑玉教授鑒定，均為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Hook. f.的干燥根。樣品信息見(jiàn)表1、2。

表1 TWPT樣品信息

Table 1 Sources of TWPT

編號(hào)批號(hào)生產(chǎn)廠家 S120200502遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司 S220200402遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司 S320201101遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司 S420200903湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司 S52012112B浙江得恩德制藥股份有限公司 S620200902湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司 S720201101湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司 S820200503湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司 S92012115B浙江得恩德制藥股份有限公司 S10201003上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司

表2 雷公藤藥材樣品信息

Table 2 Sources of T. wilfordii

編號(hào)產(chǎn)地來(lái)源 Y1浙江浙江中醫(yī)藥中藥飲片有限公司 Y2湖北十堰亳州京皖中藥飲片廠 Y3云南臨滄江蘇誠(chéng)信藥業(yè)有限公司 Y4浙江農(nóng)副產(chǎn)品1 Y5安徽亳州市麗春堂藥業(yè)有限公司 Y6浙江農(nóng)副產(chǎn)品2 Y7浙江紹興震元中藥飲片有限公司 Y8浙江杭州華東中藥飲片有限公司 Y9安徽嘉興東方國(guó)藥飲片有限公司

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters SunFire?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.02%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～10 min，15%～25%乙腈；10～20 min，25%～35%乙腈；20～40 min，35%～40%乙腈；40～60 min，40%～55%乙腈；60～75 min，55%～80%乙腈；75～90 min，80%～88%乙腈；90～100 min，88%～98%乙腈；100～101 min，98%～15%乙腈；101～116 min，15%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～65 min，230 nm；65～116 min，210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖如圖1。

1-雷公藤甲素 2-雷公藤內(nèi)酯酮 3-雷酚內(nèi)酯 4-雷公藤晉堿 5-雷公藤次堿 6-雷公藤紅素 7-雷公藤內(nèi)酯甲

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤紅素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為2.19、1.49、1.19、4.45、1.87 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱取雷公藤次堿、雷公藤內(nèi)脂甲對(duì)照品適量，加氯仿溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為6.00、15.20 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過(guò)15 d。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 TWPT供試品溶液 精密稱取TWPT粉末0.36 g（約含50 mg雷公藤多苷），置50 mL具塞錐形瓶中，加入12 mL甲醇，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾渣用2 mL甲醇洗滌，洗滌液并入濾液后于50 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)? mL氯仿-甲醇（1∶9）混合溶劑超聲溶解，所得溶液于10 000 r/min離心（離心半徑5.9 cm）5 min，取上清液適量，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得TWPT供試品溶液。

2.3.2 雷公藤藥材供試品溶液 取雷公藤藥材粉末（過(guò)20目篩）約5.00 g，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，加入100 mL氯仿，浸泡過(guò)夜后加熱回流提取2 h，放冷后濾過(guò)，采用15 mL氯仿分次洗滌殘?jiān)礈煲翰⑷霝V液后于50 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)? mL氯仿-甲醇（1∶9）混合溶劑超聲溶解，所得溶液于10 000 r/min離心（離心半徑5.9 cm）5 min，取上清液適量，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得雷公藤藥材供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量混合，加甲醇制成雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲質(zhì)量濃度分別為172.0、94.5、219.5、5 078.9、537.3、839.8、1 887.3 μg/mL的混合對(duì)照品溶液I。精密吸取混合對(duì)照品溶液I適量，依次用甲醇稀釋2、3、6、15、30、45倍，分別作為混合對(duì)照品溶液II、III、IV、V、VI、VII。精密吸取I～VII混合對(duì)照品溶液各20 μL，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（2）分別為雷公藤甲素＝24.689－9.563 5，2＝0.999 6，3.82～172.00 μg/mL；雷公藤內(nèi)酯酮＝22.729－4.052 4，2＝0.999 6，2.10～94.50 μg/mL；雷酚內(nèi)酯＝58.866－25.106，2＝0.999 5，4.88～219.50 μg/mL；雷公藤晉堿＝8.125 7＋526.7，2＝0.997 4，112.86～5 078.90 μg/mL；雷公藤次堿＝33.515－37.597，2＝0.999 5，11.94～537.30 μg/mL；雷公藤紅素＝40.583－106.55，2＝0.999 6，18.66～839.80 μg/mL；雷公藤內(nèi)酯甲＝4.5726＋14.157，2＝0.999 7，41.94～1 887.30 μg/mL。結(jié)果顯示，7種成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液II適量，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD值。結(jié)果雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲峰面積的RSD分別為3.45%、3.59%、3.68%、3.50%、3.56%、3.75%、3.40%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取TWPT樣品（S8）和雷公藤藥材樣品（Y7）各6份，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液。以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算7種質(zhì)控成分平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD值。結(jié)果TWPT樣品中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為173.12、106.06、660.82、11 259.99、 1 030.63、884.53、2 591.14 μg/g，RSD分別為1.99%、2.25%、2.82%、2.41%、3.60%、2.53%、2.81%；雷公藤藥材樣品中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.63、1.07、2.19、625.15、4.60、171.67、184.40 μg/g，RSD分別為1.85%、3.02%、3.62%、2.78%、2.56%、3.38%、3.22%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取TWPT（S8）和雷公藤藥材（Y7）供試品溶液各適量，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的峰面積，計(jì)算其RSD值。結(jié)果TWPT中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲峰面積的RSD分別為2.34%、2.00%、1.09%、1.01%、2.12%、1.89%、1.69%；雷公藤藥材中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲峰面積的RSD分別為4.01%、3.06%、1.19%、3.63%、3.20%、3.17%、4.95%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取0.18 g TWPT樣品（S8）6份，精密稱定，分別精密加入另行配制的混合對(duì)照品溶液1 mL（雷公藤甲素57.32 μg/mL、雷公藤內(nèi)酯酮31.50 μg/mL、雷酚內(nèi)酯73.16 μg/mL、雷公藤晉堿3 385.90 μg/mL、雷公藤次堿179.09 μg/mL、雷公藤紅素279.92 μg/mL、雷公藤內(nèi)酯甲629.10 μg/mL），另精密稱取2.50 g雷公藤藥材樣品（Y7）6份，精密稱定，分別精密加入另行配制的混合對(duì)照品溶液2 mL（雷公藤甲素11.46 μg/mL、雷公藤內(nèi)酯酮2.10 μg/mL、雷酚內(nèi)酯4.88 μg/mL、雷公藤晉堿677.20 μg/mL、雷公藤次堿11.94 μg/mL、雷公藤紅素279.92 μg/mL、雷公藤內(nèi)酯甲629.10 μg/mL），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各成分質(zhì)量濃度，并計(jì)算加樣回收率和RSD值。結(jié)果TWPT樣品中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的平均加樣回收率分別為105.2%、103.8%、103.4%、102.1%、108.9%、110.3%、100.6%，RSD值分別為2.29%、2.54%、2.88%、3.26%、2.61%、3.42%、3.23%；雷公藤藥材樣品中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的平均加樣回收率分別為98.6%、87.7%、91.2%、101.1%、99.1%、101.3%、104.4%，RSD值分別為3.13%、2.75%、3.60%、2.23%、2.90%、2.98%、2.17%。

2.5 fk/s測(cè)定

精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下各混合對(duì)照品溶液適量，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積，以雷酚內(nèi)酯為參照物，按下列公式分別計(jì)算雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的f/s，結(jié)果見(jiàn)表3。

f/s＝f/s＝CAs/(sA)

C為待測(cè)成分質(zhì)量濃度，A為待測(cè)成分峰面積，s為參照物質(zhì)量濃度，s為參照物峰面積

2.6 fk/s的耐用性考察

2.6.1 不同儀器和不同色譜柱對(duì)f/s的影響 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，參照“2.5”項(xiàng)下方法求算各成分f/s，分別考察不同儀器包括Agilent 1260、Agilent 1200、ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色譜儀及不同色譜柱包括Agilent Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters SunFire? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)f/s的影響，結(jié)果如表4所示，各成分f/s的RSD值均小于3%，表明更換儀器或色譜柱對(duì)各成分的f/s無(wú)顯著影響，適用性良好。

表3 雷酚內(nèi)酯對(duì)各成分的fk/s

Table 3 fk/s of triptophenolide to various constituents

混合對(duì)照品溶液fk/s 雷公藤甲素雷公藤內(nèi)酯酮雷公藤晉堿雷公藤次堿雷公藤紅素雷公藤內(nèi)酯甲 I1.635 02.385 73.877 71.229 31.236 64.745 5 II1.591 92.363 83.865 41.277 81.245 94.664 2 III1.619 12.430 53.831 81.188 01.288 84.710 1 IV1.610 12.416 13.737 31.198 11.281 94.486 0 V1.661 02.313 73.697 21.183 11.343 84.425 0 VI1.655 02.421 43.625 21.176 71.281 64.634 5 VII1.705 42.396 13.783 81.219 11.304 34.461 0 平均值1.639 72.389 63.774 11.210 31.283 34.589 5 RSD/%2.311.702.472.922.792.82

2.6.2 不同體積流量對(duì)f/s的影響 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，參照“2.5”項(xiàng)下方法求算各成分f/s，考察3個(gè)體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）對(duì)f/s的影響，結(jié)果如表5所示，各成分f/s的RSD均小于3%，表明不同體積流量對(duì)各成分f/s無(wú)顯著影響。

2.6.3 不同柱溫對(duì)f/s的影響 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，參照“2.5”項(xiàng)下方法求算各成分f/s，考察3個(gè)柱溫（25、30、35 ℃）對(duì)f/s的影響，結(jié)果如表6所示，各成分的RSD均小于3%，表明不同柱溫對(duì)各成分f/s無(wú)顯著影響。

2.7 待測(cè)成分色譜峰定位

精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別計(jì)算雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)參照物雷酚內(nèi)酯的相對(duì)保留時(shí)間（R），對(duì)各成分進(jìn)行色譜峰定位。結(jié)果如表7所示，各成分R的RSD均小于5%，表明可利用R對(duì)各成分進(jìn)行定位。

2.8 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

對(duì)表1、2來(lái)自不同廠家、批號(hào)和不同產(chǎn)地和來(lái)源的TWPT和雷公藤藥材，分別以“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算含量。結(jié)果如表8所示，2種方法測(cè)定的各成分含量無(wú)明顯差異，相對(duì)平均偏差（RAD，RAD＝平均偏差/平均值，其中平均偏差即2組測(cè)量值與其平均值的差值取絕對(duì)值后求和，再除以2）均小于3.0%。

表4 不同儀器、不同色譜柱對(duì)fk/s的影響

Table 4 Effects of different instruments and chromatographic columns on fk/s

儀器色譜柱fk/s 雷公藤甲素雷公藤內(nèi)酯酮雷公藤晉堿雷公藤次堿雷公藤紅素雷公藤內(nèi)酯甲 Agilent 1200Waters C181.619 72.399 73.909 21.278 41.239 94.692 8 Agilent C181.586 62.365 93.867 41.273 51.222 54.653 3 Welch C181.623 52.403 23.936 11.280 31.249 24.767 5 Kromasil C181.611 12.383 73.911 81.273 01.225 94.702 5 Agilent 1260Waters C181.591 72.350 33.830 81.282 41.220 14.441 5 Agilent C181.563 72.329 23.794 81.285 31.222 14.428 5 Welch C181.602 12.366 13.854 71.287 51.215 74.475 8 Kromasil C181.585 72.342 73.829 11.285 31.216 34.422 1 UltiMate 3000Waters C181.602 62.345 93.872 21.301 11.212 54.700 0 Agilent C181.564 92.315 63.810 21.289 81.205 14.603 9 Welch C181.641 82.357 33.873 81.292 01.216 84.654 8 Kromasil C181.584 52.346 73.864 61.298 41.226 94.626 0 平均值 1.598 22.358 93.862 91.285 61.222 74.597 4 RSD/% 1.461.131.100.690.982.67

表5 不同體積流量對(duì)fk/s的影響

Table 5 Effects of different volume flow rates on fk/s

體積流量/(mL?min?1)fk/s 雷公藤甲素雷公藤內(nèi)酯酮雷公藤晉堿雷公藤次堿雷公藤紅素雷公藤內(nèi)酯甲 0.81.603 12.383 83.905 61.278 01.249 04.696 3 1.01.586 62.365 93.867 41.273 51.222 54.653 3 1.21.573 82.351 93.843 21.275 31.228 54.665 5 平均值1.587 92.367 23.872 11.275 61.233 34.671 7 RSD/%0.930.680.810.181.130.48

表6 不同柱溫對(duì)fk/s的影響

Table 6 Effects of different column temperatures on fk/s

柱溫/℃fk/s 雷公藤甲素雷公藤內(nèi)酯酮雷公藤晉堿雷公藤次堿雷公藤紅素雷公藤內(nèi)酯甲 251.585 12.361 63.872 71.276 61.239 04.666 6 301.586 62.365 93.867 41.273 51.222 54.876 3 351.579 92.350 43.862 41.276 81.232 24.662 1 平均值1.583 92.359 33.867 51.275 61.231 24.735 0 RSD/%0.220.340.130.150.672.58

3 討論

3.1 供試品溶液制備

為篩選最優(yōu)的TWPT及雷公藤藥材供試品溶液制備方法，本研究分別對(duì)樣品預(yù)處理、提取溶劑和提取方法等進(jìn)行了考察。

表7 不同儀器、不同色譜柱對(duì)tR的影響

Table 7 Effects of different instruments and chromatographic columns on tR values

儀器色譜柱tR 雷公藤甲素雷公藤內(nèi)酯酮雷公藤晉堿雷公藤次堿雷公藤紅素雷公藤內(nèi)酯甲 Agilent 1200Waters C180.409 00.707 81.060 71.108 81.433 61.512 7 Agilent C180.382 40.653 51.050 21.122 61.511 51.597 0 Welch C180.412 20.707 81.063 51.107 31.444 31.522 4 Kromasil C180.405 00.697 91.063 21.110 01.457 11.537 7 Agilent 1260Waters C180.407 00.705 31.061 51.109 31.432 41.511 2 Agilent C180.380 80.650 01.050 81.124 21.513 31.598 7 Welch C180.412 10.707 91.062 91.107 01.441 01.517 7 Kromasil C180.404 90.696 21.061 61.109 71.452 41.531 4 UltiMate 3000Waters C180.403 70.706 31.054 91.106 01.416 71.493 7 Agilent C180.378 30.650 51.048 01.122 11.497 61.581 8 Welch C180.408 90.709 21.058 91.104 61.427 61.503 6 Kromasil C180.402 40.698 51.057 81.106 81.437 91.516 3 平均值 0.400 60.690 91.057 81.111 51.455 41.535 4 RSD/% 3.123.510.520.642.292.38

表8 各成分測(cè)定結(jié)果

Table 8 Results of content determination of various constituents

樣品雷酚內(nèi)酯/(μg?g?1)雷公藤甲素/(μg?g?1)雷公藤內(nèi)酯酮/(μg?g?1)雷公藤晉堿/(μg?g?1) 外標(biāo)法外標(biāo)法QAMSRAD/%外標(biāo)法QAMSRAD/%外標(biāo)法QAMSRAD/% S1252.9317.2516.901.016.155.931.853 833.143 793.380.52 S2288.2412.1211.622.1015.2515.200.163 460.313 424.870.51 S3253.9231.1331.160.0529.4930.111.054 119.284 073.920.55 S4402.99164.66164.130.1664.8364.510.248 523.748 344.831.06 S537.4687.2388.190.5416.3916.370.051 658.611 664.160.17 S6463.97234.59234.500.0288.0189.130.639 112.148 913.911.10 S7365.37199.91199.910.00104.49106.070.7512 729.4112 444.381.13 S8636.44170.44169.630.24100.40101.560.5811 121.3710 843.301.27 S929.36326.13331.260.78210.53220.162.241 427.351 444.390.59 S1033.19145.87145.880.0036.3836.580.273 418.253 375.490.63 Y112.702.412.311.9824.3424.871.07132.04130.280.67 Y25.451.911.841.895.235.280.50137.19137.550.13 Y36.671.721.642.508.258.320.45123.76123.460.12 Y42.621.581.551.041.361.370.65124.23128.531.70 Y52.361.941.940.051.281.310.8687.8691.562.06 Y610.242.182.092.1213.9113.591.15119.10117.880.52 Y72.257.988.151.041.111.130.70648.50667.151.42 Y85.392.522.461.0611.4711.660.82177.38177.800.12 Y97.142.422.341.5211.6511.760.48173.93173.160.22

續(xù)表8

對(duì)于TWPT，采用簡(jiǎn)單的超聲提取方法[27]對(duì)比了不同提取溶劑甲醇、乙醇、氯仿及醋酸乙酯對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇超聲提取30 min，各待測(cè)成分溶出度較高，且各成分色譜峰之間分離度和峰形良好，故選擇甲醇超聲提取作為T(mén)WPT供試品溶液制備方法。

對(duì)于雷公藤藥材，分別對(duì)比了樣品是否浸泡預(yù)處理、不同提取溶劑（甲醇、乙醇及氯仿）、不同提取方法（超聲提取和加熱回流提?。┮约疤崛∥锸欠窠?jīng)固相萃取等對(duì)制備效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將藥材浸泡過(guò)夜、氯仿為提取溶劑、加熱回流提取2h可以使各成分獲得較優(yōu)的提取效率，同時(shí)各成分色譜峰之間分離度和峰形均較好；而采用固相萃取處理與未采用相比，各成分分離度和色譜峰峰形未有明顯改善，且固相萃取后目標(biāo)成分有一定量的損失，故對(duì)藥材提取物不采用固相萃取處理。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

雷公藤藥材及TWPT成分復(fù)雜，多數(shù)成分含量較低，為了使多成分達(dá)到較好的分離效果，對(duì)流動(dòng)相的組成和比例進(jìn)行了考察，首先比較了水相分別添加甲酸、醋酸、磷酸和磷酸-三乙胺對(duì)梯度洗脫分離效果的影響，結(jié)果顯示水相中加入少量磷酸可顯著改善各成分色譜峰峰形。進(jìn)一步考察了不同體積分?jǐn)?shù)（0.02%、0.05%、0.10%）磷酸水對(duì)色譜行為的影響，結(jié)果顯示水相中添加0.02%磷酸時(shí)，各成分色譜峰的分離度和峰形最優(yōu)，故以0.02%磷酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相。

雷公藤各成分具有不同的最大紫外吸收波長(zhǎng)，為了使各成分獲得較高的檢測(cè)靈敏度，需要采用不同波長(zhǎng)分段檢測(cè)。參照文獻(xiàn)報(bào)道[1,3,28-29]對(duì)7個(gè)成分分別在210、218、230、267、425 nm波長(zhǎng)下的響應(yīng)進(jìn)行了考察，篩選最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)。綜合考慮各成分的含量、紫外響應(yīng)值、出峰時(shí)間及檢測(cè)波長(zhǎng)的簡(jiǎn)單性，最后選擇雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿和雷公藤次堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，檢測(cè)時(shí)間段為0～65 min；雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，檢測(cè)時(shí)間段為65～116 min。

3.3 指標(biāo)成分和參照物的選擇

雷公藤中主要含有二萜類、三萜類和生物堿等生物活性成分，這些成分共同構(gòu)成雷公藤的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。為有助于雷公藤藥材及其制劑的全面質(zhì)量控制，我們分別選擇了活性明確、含量較高的各類代表性成分作為QAMS法含量測(cè)定的指標(biāo)成分，主要包括二萜類成分雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚內(nèi)酯，三萜類成分雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲以及生物堿類成分雷公藤晉堿和雷公藤次堿。從各成分含量測(cè)定結(jié)果和各成分色譜分離情況看，雷酚內(nèi)酯含量適中，與其它成分分開(kāi)明顯，在譜圖中較易識(shí)別，其保留時(shí)間約為56 min，處于色譜圖的中位，利于其它成分色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算和色譜峰的識(shí)別，且雷酚內(nèi)酯性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉易得，因此，本研究選擇雷酚內(nèi)酯作為QAMS法含量測(cè)定的參照物。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果及QAMS法的準(zhǔn)確性

本研究搜集了10批不同廠家和批號(hào)的TWPT制劑以及9批不同來(lái)源或產(chǎn)地的雷公藤藥材進(jìn)行了7個(gè)指標(biāo)性成分的含量測(cè)定，結(jié)果顯示，10批制劑中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.62～331.26、5.93～220.16、29.36～636.44、1 427.35～12 729.41、35.68～978.06、74.41～2 052.93、1 753.99～2 994.06 μg/g；9批藥材中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.55～8.15、1.11～24.87、2.25～12.70、87.86～667.15、3.19～9.69、11.53～179.07、33.11～199.84 μg/g。不同廠家、不同批號(hào)及不同產(chǎn)地來(lái)源的TWPT及雷公藤藥材中7種成分含量均存在較大差異，這種差異可能與藥材來(lái)源和質(zhì)量、生產(chǎn)過(guò)程和工藝控制水平等諸多因素有關(guān)，因此，還應(yīng)提高雷公藤中藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

本研究建立QAMS法用于同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材及制劑中7種成分含量，以雷酚內(nèi)酯為參照物，對(duì)其它6種成分的f/s進(jìn)行了包括儀器、色譜柱、柱溫、體積流量以及色譜峰定位的耐用性考察，說(shuō)明QAMS法具有良好的重現(xiàn)性。對(duì)19批樣品分別采用外標(biāo)法和QAMS法求算7種成分含量，結(jié)果表明2種方法測(cè)定的含量無(wú)顯著性差異，證明了QAMS法的準(zhǔn)確性。

本研究所建立方法可用于雷公藤及其相關(guān)制劑的多成分定量分析，為雷公藤中藥的全面質(zhì)量控制提供新的方法參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Simultaneous quantitative determination of seven components inherbs and preparations ofpolyglycosides Tablets by QAMS method

JI Xiang-yu1, 2, ZHANG Zi-wen2, CHEN Zi-yi2, ZHOU Bin-cheng2, YE Chun-ying2, JI Yan-ping2, ZHAN Shu-yu2

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311403, China 2. Medical College of Jiaxing University, Jiaxing 314001, China

To improve quality control level of Leigongteng (), a traditional Chinese medicine, the method of quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) was established to simultaneously determine seven components inherbs (TWH) and preparations ofpolyglycosides Tablets (TWPT).Using triptophenolide as the reference, the relative correction factors (f/s) of other components of triptolide, triptonide, wilforgine, wilforine, tripterine and wilforlide were calculated by HPLC, and then the durability off/swas investigated. Nine samples of TWH and 10 samples of TWPT from different origins, manufacturers and batch numbers were collected and their components were determined using the external standard method (ESM) and QAMS method, respectively. The determination results of sevem components in 19 samples using ESM and QAMS method were compared.The repeatability off/sfor each component was good. There was no significant difference (RAD < 3%) between the measured values of QAMS method and ESM. The components contents in TWH from different origins and TWPT from different manufacturers and batch numbers were both greatly different. The results demonstrated quality control standard ofshould be improved.The established QAMS method has high accuracy and it can be used for the simultaneous quantitative determination of multiple components in TWH and preparations of.. This method will provide a method reference for the comprehensive quality control of..

QAMS;Hook. f.;polyglycosides Tablets; quality control; triptophenolide; triptonide; triptonide; wilforgine; wilforine; tripterine; wilforlide; relative correction factors

R286.02

A

0253 - 2670(2022)17 - 5338 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.010

2022-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81503338）；浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃項(xiàng)目（LGF22H280004）；嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020AY10022）；嘉興學(xué)院重點(diǎn)SRT資助項(xiàng)目

姬翔宇，碩士研究生，研究方向中藥質(zhì)量控制。E-mail: jxy912912@163.com

詹淑玉，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)與中藥藥動(dòng)學(xué)。E-mail: zhansy2000@163.com

計(jì)燕萍，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)和中藥藥理學(xué)。E-mail: 623220865@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]