產(chǎn)地加工炮制一體化與傳統(tǒng)何首烏飲片化學(xué)成分的比較研究

黃孟秋，孫連娜，董志穎，屠 燕，邱 實(shí)

產(chǎn)地加工炮制一體化與傳統(tǒng)何首烏飲片化學(xué)成分的比較研究

黃孟秋，孫連娜，董志穎，屠 燕，邱 實(shí)*

上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

全面表征何首烏的化學(xué)成分，對產(chǎn)地加工炮制一體化何首烏飲片與傳統(tǒng)加工何首烏飲片的化學(xué)成分進(jìn)行比較。采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)表征何首烏中的化學(xué)成分；運(yùn)用代謝組學(xué)方法比較產(chǎn)地加工炮制一體化何首烏飲片與傳統(tǒng)飲片中成分差異。根據(jù)對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律、保留時(shí)間、色譜峰的精確相對分子質(zhì)量、碎片離子等信息結(jié)合MS-FINDER軟件從何首烏中鑒定出了69個(gè)化學(xué)成分；運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析比較產(chǎn)地加工炮制一體化飲片與傳統(tǒng)飲片的化學(xué)成分，整體化學(xué)輪廓存在相似性，但大黃素、二苯乙烯苷、大黃素-8--β--葡萄糖苷等游離蒽醌類成分存在差異。產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)具有簡化炮制步驟，提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)，但是在推廣產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)的過程中，還應(yīng)考慮到游離蒽醌類成分的影響。

何首烏；產(chǎn)地加工炮制一體化；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜；化學(xué)成分；代謝組學(xué)；大黃素；二苯乙烯苷；大黃素-8--β--葡萄糖苷

何首烏為蓼科（Polygonaceae）植物何首烏Thunb. 的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的作用[1]。何首烏中的主要成分包括二苯乙烯苷類、蒽醌類、黃酮類、磷脂等化合物[2-6]，具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化，神經(jīng)保護(hù)等作用[7]。

飲片生產(chǎn)需要經(jīng)過產(chǎn)地加工和中藥炮制2個(gè)重要環(huán)節(jié)，產(chǎn)地加工主要包括凈制、修整切制及干燥等步驟制成中藥材，部分藥材在產(chǎn)地還需要蒸或煮以保存藥效[8]；中藥炮制指將中藥材洗凈、潤透、切制、炮制后干燥的過程，最終得到傳統(tǒng)飲片。在產(chǎn)地加工及飲片炮制過程中需要經(jīng)過回潤以及多次干燥的過程，步驟繁瑣易造成有效成分的損失。因此，20世紀(jì)以來，就不斷有專家提出將飲片生產(chǎn)線前移，在產(chǎn)地進(jìn)行飲片炮制，推廣產(chǎn)地加工炮制一體化的概念[9-10]。

目前產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)已經(jīng)取得一定進(jìn)展?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)香薷、天麻、紋黨參等藥材產(chǎn)地加工炮制一體化飲片對保留藥材中有效成分具有積極意義。而何首烏的加工炮制一體化研究也顯示產(chǎn)地加工炮制一體化飲片（簡稱“產(chǎn)地片”）中二苯乙烯苷類、蒽醌類及多糖等成分含量與傳統(tǒng)飲片（簡稱“潤切片”）相比無顯著差異[11-13]。但是目前對產(chǎn)地片與潤切片之間的化學(xué)成分差異研究集中在大黃素、大黃素甲醚、二苯乙烯苷等質(zhì)控指標(biāo)成分上。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，能夠更全面的比較產(chǎn)地片與潤切片中的化學(xué)成分，有助于了解產(chǎn)地加工對飲片化學(xué)成分的影響，從而為何首烏產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)的實(shí)施及推廣提供參考。因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法對2種飲片的化學(xué)差異進(jìn)行表征，并對指標(biāo)性成分含量進(jìn)行考察，以期更全面地分析產(chǎn)地片與潤切片中的化學(xué)成分差異，為何首烏產(chǎn)地加工的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜、Waters Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜（美國Waters公司），Masslynx V 4.2工作站（美國Thermo Fisher公司）；MS-DIAL v 4.20；Agilent 1200液相色譜儀；SK7200H超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；BSA124S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）；MiniSpin plus型離心機(jī)（德國eppendolf公司）；MSE3.6P-0CE-DM型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 對照品及試劑

反式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--葡萄糖苷（簡稱“二苯乙烯苷”）為本實(shí)驗(yàn)室分離得到（批號200125）；大黃素對照品（批號B20240）購于上海源葉生物科技有限公司；大黃素甲醚（批號3987）、原花青素B1（批號7861）、原花青素C1（批號6980）、大黃素-8--β--葡萄糖苷（批號7823）、大黃素甲醚-8--β--葡萄糖苷（批號6658）和蘆薈大黃素（批號6530）等對照品購于上海詩丹德生物科技有限公司。各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，美國Fisher公司），純水為自制。

1.3 樣品采集及飲片制備

新鮮何首烏于2019年采集于廣東德慶市及貴州省丹寨縣，市售何首烏飲片（相同批次產(chǎn)地片及潤切片）收集于上海地區(qū)，飲片產(chǎn)地包括廣東、貴州、云南、河南等地，以上樣品均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院孫連娜副教授鑒定為蓼科植物何首烏Thunb.，自制飲片及市售飲片具體樣品信息見表1。

飲片制備采收新鮮何首烏，除去泥土，須根，削去兩端，切成塊后干燥，干燥品為何首烏藥材。取何首烏藥材，除雜、稍潤，切厚片干燥得到傳統(tǒng)何首烏飲片。新鮮何首烏，除去泥土，須根，削去兩端，稍加干燥后直接切厚片，干燥即得產(chǎn)地片。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取何首烏粉末（過四號篩）0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇25 mL，超聲處理（50 kHz、功率760 W）1 h，取出，放冷，用70%甲醇補(bǔ)失質(zhì)量，搖勻，14 000 r/min離心15 min，取上清液即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取大黃素、原花青素B1、原花青素C1、大黃素-8--β--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--β--葡萄糖苷、蘆薈大黃素，二苯乙烯苷對照品適量，分別加入甲醇溶解制成含大黃素0.22 mg/mL、原花青素B1 0.56 mg/mL、原花青素C1 0.49 mg/mL、大黃素-8-β--葡萄糖苷0.21 mg/mL、大黃素甲醚-8--β--葡萄糖苷0.19 mg/mL、蘆薈大黃素0.14 mg/mL和二苯乙烯苷0.55 mg/mL的對照品儲備液。分別移取各儲備制成對照品溶液，加甲醇稀釋成每種對照品質(zhì)量濃度約為0.05 mg/mL，用于定性分析。

2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，T3，Waters公司，美國）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），洗脫梯度：0～2 min，5% B；2～15 min，5%～40% B；15～17 min，40%～55% B；17～23 min，55%～95% B；23～30 min，95% B；后運(yùn)行4 min；柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μL，體積流量0.4 mL/min。

表1 何首烏飲片信息

Table 1 Information of P. multiflorum

潤切片產(chǎn)地片產(chǎn)地飲片來源 樣品編號批號樣品編號批號 S1-1HSW-GD-201901-RS1-2HSW-GD-201901-X廣東上海地區(qū)購買 S2-1HSW-GD-201902-RS2-2HSW-GD-201902-X廣東上海地區(qū)購買 S3-1HSW-GD-201903-RS3-2HSW-GD-201903-X廣東上海地區(qū)購買 S4-1HSW-GD-201904-RS4-2HSW-GD-201904-X廣東上海地區(qū)購買 S5-1HSW-GZ-201901-RS5-2HSW-GZ-201901-X貴州上海地區(qū)購買 S6-1HSW-GZ-201902-RS6-2HSW-GZ-201902-X貴州上海地區(qū)購買 S7-1HSW-GZ-201903-RS7-2HSW-GZ-201903-X貴州上海地區(qū)購買 S8-1HSW-GZ-201904-RS8-2HSW-GZ-201904-X貴州上海地區(qū)購買 S9-1HSW-HN-201901-RS9-2HSW-HN-201901-X河南上海地區(qū)購買 S10-1HSW-HN-201902-RS10-2HSW-HN-201902-X河南上海地區(qū)購買 S11-1HSW-HN-201903-RS11-2HSW-HN-201903-X河南上海地區(qū)購買 S12-1HSW-HN-201904-RS12-2HSW-HN-201904-X河南上海地區(qū)購買 S13-1HSW-YN-201901-RS13-2HSW-YN-201901-X云南上海地區(qū)購買 S14-1HSW-YN-201902-RS14-2HSW-YN-201902-X云南上海地區(qū)購買 S15-1HSW-YN-201903-RS15-2HSW-YN-201903-X云南上海地區(qū)購買 S16-1HSW-YN-201904-RS16-2HSW-YN-201904-X云南上海地區(qū)購買 S17-1XSWMC19041-RS17-2XSWMC19041-X廣東德慶自制 S18-1XSWMC19042-RS18-2XSWMC19042-X廣東德慶自制 S19-1XSWMC19043-RS19-2XSWMC19043-X廣東德慶自制 S20-1XSWMC19044-RS20-2XSWMC19044-X廣東德慶自制 S21-1XSWGZ19011-RS21-2XSWGZ19011-X貴州丹寨自制 S22-1XSWGZ19012-RS22-2XSWGZ19012-X貴州丹寨自制 S23-1XSWGZ19013-RS23-2XSWGZ19013-X貴州丹寨自制 S24-1XSWGZ19014-RS24-2XSWGZ19014-X貴州丹寨自制

2.3 質(zhì)譜條件

在負(fù)模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，ESI源參數(shù)設(shè)置如下：樣品錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；去溶劑化氣流溫度450 ℃；錐形氣體流量50 L/h；去溶劑化氣體流量600 L/h；毛細(xì)管電壓2.5 kV。質(zhì)譜檢測質(zhì)量范圍為/100～1500，掃描時(shí)間為0.35 s，低能量掃描時(shí)傳輸碰撞能量設(shè)定為6 eV，高能量掃描時(shí)傳輸碰撞能量為15～30 eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)構(gòu)鑒定

采集樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在MassLynx作站中得到化合物的保留時(shí)間、離子碎片、加和離子、精確相對分子質(zhì)量等信息，通過對照品及文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行鑒定。文獻(xiàn)中未有分離及鑒定報(bào)道的成分，用MS-FINDER軟件進(jìn)行鑒定，MS-FINDER軟件中使用到的用于結(jié)構(gòu)鑒定的公共數(shù)據(jù)庫包括KNApSAcK、PlantCyc、HMDB、LipidMaps、NANPDB以及UNPD。

將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MS-DIAL軟件進(jìn)行峰對齊、峰提取及歸一化等數(shù)據(jù)處理。處理后數(shù)據(jù)可導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），根據(jù)PCA模型、OPLS-DA模型以及VIP值等信息找出產(chǎn)地片和潤切片中的主要差異成分；還可以直接用于半定量分析，結(jié)合SPSS 22.0軟件采用單因素方差分析法考察產(chǎn)地炮制方式對飲片中有效成分含量的影響情況。

3 結(jié)果

3.1 何首烏化學(xué)成分分析

采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)，在負(fù)離子模式下采集不同批次何首烏飲片的總離子流圖進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)無論是自制飲片還是市售飲片，其同一批次的產(chǎn)地片與潤切片在特征峰響應(yīng)強(qiáng)度方面均存在差異（以色譜峰強(qiáng)度較高的市售飲片S13和自制飲片S22為例，見圖1）。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及公共數(shù)據(jù)庫查找的方式對總離子流圖進(jìn)行分析，共鑒定了69個(gè)可以代表何首烏質(zhì)譜指紋圖譜輪廓的成分（表2），其中以二苯乙烯苷類、游離蒽醌類以及結(jié)合蒽醌類為主。在69個(gè)成分中，有54個(gè)鑒定來源于文獻(xiàn)報(bào)道，15個(gè)來源于公共數(shù)據(jù)庫，其中何首烏中特征性的化合物用對照品進(jìn)行了確認(rèn)。分別對主要類型舉例說明鑒定過程。

3.1.1 二苯乙烯苷類 化合物31分子離子峰為/405.119 9 [M－H]?，與對照品的出峰時(shí)間及離子裂解規(guī)律（圖2-a）判斷該成分為二苯乙烯苷，在二級碎片離子中31丟失1分子葡萄糖生成碎片離子/243.065 3 [M－H－glu]?。25與31號化合物裂解規(guī)律一致僅出峰時(shí)間不同，為該成分的同分異構(gòu)體。34分子離子峰為/375.108 6 [M－H]?，丟失1分子木糖苷生成/243.065 3 [M－H－xyl]?，后續(xù)裂解過程與31一致結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道判斷該成分為2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--木糖苷。33、36、41分子離子峰相同，且裂解規(guī)律相近，/557.13 [M－H]?。丟失1分子沒食子?；笊?405.11 [M－H－C7H4O4]?，后續(xù)裂解規(guī)律與31一致，判斷3個(gè)化合物均為31號化合物在不同部位連接乙?；纬赏之悩?gòu)體。同理可知37、46和47分別為31號連接了乙?；?，香豆?；约鞍⑽乎；?。28及35分子離子峰為/693.18 [M－H]?，裂解規(guī)律相近為同分異構(gòu)體，丟失1分子葡萄糖形成/531.12 [M－H－glu]?，丟失C15H12O6形成/405.11 [M－H－C15H12O6]?，丟失C20H22O9形成/289.06 [M－H－C20H22O9]?，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道判斷2個(gè)成分分別為polygonflavanol A和polygonflavanol B。

圖1 負(fù)離子模式下何首烏飲片的總離子流圖

表2 負(fù)離子模式下何首烏中成分鑒定結(jié)果

Table 2 Identification results of P. multiflorum in negative ion mode

序號tR/min化合物分子式離子理論值(m/z)測定值(m/z)碎片離子 (m/z)誤差(×10?6) 10.82蔗糖C12H22O11[M－H]?341.108 4341.108 9262.056 5, 179.055 41.30 20.87檸檬酸C6H8O7[M－H]?191.019 5191.020 1128.034 4, 111.008 03.26 31.55沒食子酸[14]C7H6O5[M－H]?169.013 7169.014 5125.023 4, 107.012 71.40 41.64(2S,2′S)-pyrosaccharopineC11H18N2O5[M－H]?257.114 3257.114 6239.102 8, 213.123 62.30 51.74未知C19H26O14[M－H]?477.125 0477.124 7439.124 0, 329.134 21.80 62.26gamma-L-glutamyl-L-pipecolic-acidC11H18N2O5[M－H]?257.114 3257.114 8213.123 2, 195.112 82.30 72.43isomer gamma-L-glutamyl-L-pipecolic-acidC11H18N2O5[M－H]?257.114 3257.114 8213.123 5, 195.112 13.08 83.16(?)-表沒食子兒茶素[15]C15H14O7[M－H]?305.066 2305.066 8179.033 9, 125.023 90.40 93.93gamma-glutamylisoleucineC11H20N2O5[M－H]?259.129 9259.130 4241.118 6, 197.128 41.70 104.433-羥基苯甲酸[16]C7H6O3[M－H]?137.023 9137.024 7108.020 92.00 114.83原花青素B1*[2]C30H26O12[M－H]?577.134 6577.135 0425.080 6, 407.076 8, 289.070 8?0.30 124.972-vinyl-1H-indole-3-carboxylic acid[17]C11H9NO2[M－H]?186.055 5186.056 4142.065 51.90 134.97刺桐堿[17]C14H18N2O2[M－H]?245.129 0245.128 6142.065 30.90 145.11原花青素B2[2]C30H26O12[M－H]?577.134 6577.134 2425.086 7, 407.075 6, 289.071 9?1.70 155.37兒茶素[15]C15H14O6[M－H]?289.071 2289.072 2245.080 5, 203.070 01.40 165.59原花青素C1*[18]C45H38O18[M－H]?865.198 5865.196 0577.133 9, 451.102 6, 289.068 3?1.10 175.93對羥基苯甲醛[19]C7H6O2[M－H]?122.037 0121.029 7 1.70 186.04polygonumoside E[20]C19H22O9[M－H]?393.118 6393.119 0231.065 1?0.20 196.04原花青素B1（isomer）[2]C30H26O12[M－H]?577.134 6577.134 2425.086 4, 407.075 9,289.070 3?1.60 206.39isomer polygonimitin C[21]C26H32O14[M－H＋HCOO]?567.171 4613.176 9405.112 6, 243.061 8?0.80 216.51表兒茶素[15]C15H14O6[M－H]?289.071 2289.072 0245.080 9, 203.712 00.80 226.703-O-galloyl-procyanidin B[2]C37H30O16[M－H]?729.145 6729.144 9577.128 9, 289.071 8?1.70 237.01isomer 3-O-galloyl-procyanidin B[2]C37H30O16[M－H]?729.145 6729.145 6577.136 4, 407.075 8?0.70 247.00isomer polygonimitin C[21]C26H32O14[M－H＋HCOO]?567.171 4613.177 0405.116 7, 243.065 0?0.70 257.23順式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷[22]C20H22O9[M－H]?405.118 6405.119 6243.066 5, 225.053 71.20 267.54(+)-lyoniresinol-3α-O-β-D-glucopyranoside[14]C28H38O13[M－H＋HCOO]?581.223 4627.228 8521.211 5, 289.068 3?1.00 277.72polygonimitin C[21]C26H32O14[M－H]?567.171 4567.171 6405.115 2, 243.064 4?0.60 287.96polygonflavanol A[23-24]C35H34O15[M－H]?693.182 5693.181 1541.136 3, 405.118 9, 289.068 3, 243.065 0, 169.014 11.28 298.053,3′-di-O-galloyl-procyanidin B2[2]C44H34O20[M－H]?881.156 5881.154 4729.139 6, 591.113 6, 289.068 3?3.00 308.13polydatin[3]C20H22O8[M－H＋HCOO]?389.123 7435.129 4227.070 2?0.50 318.38二苯乙烯苷*[2]C20H22O9[M－H]?405.118 6405.119 9243.065 32.00 328.63未知C42H38O19[M－H]?845.193 5845.190 4804.153 80.06

續(xù)表2

續(xù)表2

序號tR/min化合物分子式離子理論值 (m/z)測定值 (m/z)碎片離子 (m/z)誤差(×10?6) 6117.95polygonumnolide E[35]C37H34O13[M－H]?685.192 2685.190 9458.123 6, 254.060 9?2.60 6218.22大黃素*[34]C15H10O5[M－H]?269.045 0269.046 2241.045 1, 225.053 82.50 6318.90gingerglycolipid BC33H58O14[M－H＋HCOO]?677.347 8723.379 5677.374 0, 397.134 01.26 6419.09未知C35H43N5O2[M－H]?564.334 4564.330 3504.308 46.89 6519.331-palmitoylglycerophosphoinositolC25H49O12P[M－H]?571.288 9571.288 5311.168 53.99 6619.39大黃素二蒽酮[4]C30H22O8[M－H]?509.123 7509.12 4479.059 0, 254.057 5?0.40 6719.82大黃素二蒽酮同分異構(gòu)體[4]C30H22O8[M－H]?509.124 5509.123 4479.057 9, 254.058 00.60 6819.831-oleoylglycerophosphoinositolC27H51O12P[M－H]?597.304 5597.304 4555.287 3, 325.183 71.06 6921.96pentadecanalC15H30O[M－H＋HCOO]?225.221 8271.228 3 1.18

*通過對照品對比確認(rèn)

*identified by comparing with reference standard

3.1.2 蒽醌類 何首烏中的蒽醌類成分分為游離蒽醌、結(jié)合蒽醌及蒽酮類等，游離蒽醌以化合物58為例，準(zhǔn)分子離子峰在負(fù)離子模式下/269.046 2 [M－H]?，二級質(zhì)譜中性丟失CO生成/241.045 1 [M－H－CO]?的碎片離子，還可再丟失1個(gè)O形成/225.054 4 [M－H－CO2]?的碎片離子，與對照品出峰時(shí)間及裂解規(guī)律一致（圖2-b），判斷該化合物分別為大黃素，化合物56二級質(zhì)譜圖與58一致，但出峰時(shí)間不同，結(jié)合對照品判斷為蘆薈大黃素。結(jié)合蒽醌多為游離蒽醌與糖結(jié)合形成的化合物。以化合物49/431.098 8 [M－H]?為例，在二級質(zhì)譜中母離子丟失葡萄糖生成/269.044 5 [M－H－glu]?，再丟失CO2生成/225.053 7 [M－H－glu－CO2]?，與對照品裂解規(guī)律一致（圖2-c），判斷化合物49為大黃素-8--β--葡萄糖苷?；衔?2質(zhì)譜信號/445.114 5 [M－H]?，在二級碎片中易丟失糖基生成/283.060 7 [M－H－glu]?，再丟失1分子CO及1個(gè)甲基形成碎片/240.041 4 [M－H－glu－CO－CH3]?，結(jié)合對照品裂解規(guī)律判斷化合物52為大黃素甲醚-8--β--葡萄糖苷。何首烏中報(bào)道的二蒽酮以化合物62、63為例，二級質(zhì)譜中丟失C15H13O4形成/254.05 [M－H－C15H13O4]?，還可丟失2個(gè)甲基形成/479.059 0 [M－H－2CH3]?。

3.1.3 黃酮類 化合物11、14及19的分子離子峰均為/577.13 [M－H]?，二級質(zhì)譜中易產(chǎn)生RDA裂解丟失C8H8O3形成/425.08 [M－H－C8H8O3]?，再丟失C7H5O3形成/289.07 [M－H－C8H8O3－C7H5O3]?，結(jié)合對照品（圖2-d）判斷11為原花青素B1，14及19為原花青素B1的同分異構(gòu)體?；衔?6丟失C15H13O6形成/577.133 9 [M－H－C15H13O6]?，再丟失C6H6O3形成/451.102 6 [M－H－C21H19O9]?，結(jié)合對照品判斷該化合物為原花青素C1?；衔?5和21為/289.07 [M－H]?，丟失C2H3OH，形成/245.08 [M－H－C2H3OH]?，還可丟失C7H6O3形成/203.07 [M－H－C7H6O3]?，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道判斷2個(gè)成分分別為兒茶素及表兒茶素。

3.1.4 其他類 化合物48丟失1分子葡萄糖生成/245.081 2 [M－H－glu]?，再丟失1分子CH3生成/230.058 1 [M－H－glu－CH3]?，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道判斷該成分為決明酮-8--β--吡喃葡萄糖苷，化合物51離子峰為/449.145 5 [M－H]?，二級質(zhì)譜為/230.058 1、215.032 9。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道推斷該成分為決明酮-8--(6′--乙?；?-β--吡喃葡萄糖苷。

3.2 產(chǎn)地片與潤切片對比

3.2.1 PCA 采用MS-DIAL V 4.20軟件對UPLC- QTOF-MS/MS的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取和歸一化處理，將已鑒定的69個(gè)主要成分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件建立PCA模型（圖3），分別建立了市售飲片及自制飲片的PCA模型（R＝0.951，R＝0.751），結(jié)果顯示產(chǎn)地片與潤切片分布相近，但具有一定的分離趨勢。

a-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 b-大黃素 c-大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷 d-原花青素B1

3.2.2 OPLS-DA 建立OPLS-DA模型，通過Scores Plot圖觀察產(chǎn)地片與潤切片的分布情況，按照VIP值對差異成分進(jìn)行初步篩選。OPLS-DA分析中產(chǎn)地片與潤切片明顯分為2個(gè)區(qū)域（圖4），說明二者化學(xué)成分在差異，經(jīng)過VIP結(jié)果篩選出3個(gè)主要的差異成分（表3）。

圖3 產(chǎn)地片與潤切片的PCA得分圖

圖4 自制飲片與市售飲片的OPLS-DA圖 (A)、置換檢驗(yàn)(n= 200, B) 和因子載荷圖(C)

3.2.3 成分含量比較 采用半定量分析更全面地考察已鑒定成分的含量變化，并將鑒定成分按照結(jié)構(gòu)類型分為結(jié)合蒽醌、游離蒽醌、二苯乙烯苷及其他4類，每類化合物的相對含量以該類中各化合物半定量分析結(jié)果的加和進(jìn)行計(jì)算，從而進(jìn)一步考察不同種類化合物在炮制過程中整體含量變化。本實(shí)驗(yàn)首先對產(chǎn)地片與潤切片中的差異成分進(jìn)行考察（圖5-a、b），潤切片中大黃素含量顯著高于產(chǎn)地片；再考察不同種類化合物在炮制過程中含量變化情況（圖5-c、d），檢驗(yàn)結(jié)果同樣顯示潤切片中游離蒽醌含量顯著高于產(chǎn)地片，其他成分含量無顯著性區(qū)別；此外還按照產(chǎn)地因素對4類化合物含量進(jìn)行考察（圖5-e、f），并進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示產(chǎn)地因素對何首烏中總二苯乙烯苷、結(jié)合蒽醌及游離蒽醌類成分均有影響，自制飲片中二苯乙烯苷類及其他類成分含量受產(chǎn)地因素影響；市售飲片中結(jié)合蒽醌及游離蒽醌含量受產(chǎn)地影響，均呈現(xiàn)顯著性差異。

表3 產(chǎn)地片與潤切片的差異化學(xué)成分

Table 3 Differential chemical makers of fresh-cut and moisturized-cut slices

序號化合物精確相對分子質(zhì)量分子式VIP值 62大黃素269.046 2C15H10O54.93 31二苯乙烯苷405.118 6C20H22O93.22 49大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷431.098 8C21H20O103.04

a-自制何首烏差異成分相對含量比較 b-市售何首烏差異成分相對含量比較 c-自制飲片產(chǎn)地片及潤切片不同類型化合物相對含量差異 d-市售飲片產(chǎn)地片及潤切片不同類型化合物相對含量差異 e-自制飲片不同產(chǎn)地樣品化學(xué)成分相對含量差異 f-市售飲片不同產(chǎn)地樣品化學(xué)成分相對含量差異；*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對何首烏中化學(xué)成分進(jìn)行快速表征，共鑒定出了69個(gè)成分，其中二苯乙烯苷類成分16個(gè)、蒽醌類成分19個(gè)、其他成分34個(gè)。采用非監(jiān)督式PCA對產(chǎn)地片與潤切片中化學(xué)成分進(jìn)行初步比較，二者具有一定分離趨勢。建立OPLS-DA模型進(jìn)一步考察兩種飲片成分差異，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地片與潤切片中二苯乙烯苷、大黃素- 8-β-葡萄糖苷等指標(biāo)性成分以及大黃素VIP＞2，進(jìn)一步通過半定量分析及檢驗(yàn)確定大黃素為產(chǎn)地片與潤切片中的主要差異成分。

本實(shí)驗(yàn)在前期工作中按照藥典方法對產(chǎn)地片及潤切片中二苯乙烯苷，結(jié)合蒽醌及游離蒽醌類成分含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示產(chǎn)地片中游離蒽醌含量呈現(xiàn)低于潤切片的趨勢。在本實(shí)驗(yàn)中按照化合物種類對產(chǎn)地片與潤切片中的不同化合物進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與含量測定結(jié)果相近，進(jìn)一步證明產(chǎn)地加工可能會(huì)對飲片中游離蒽醌含量造成影響。推測潤藥和干燥過程可能會(huì)促進(jìn)結(jié)合蒽醌的水解，使?jié)櫱衅杏坞x蒽醌含量升高。

圖2自制飲品PCA圖中產(chǎn)地片與潤切片有明顯分離趨勢，而市售飲片中二者差異不明顯，說明產(chǎn)地因素對飲片中成分影響較明顯，掩蓋了產(chǎn)地片與潤切片之間的差異。由圖5-d、f可以看到不同產(chǎn)地自制飲片及市售飲片中二苯乙烯苷類成分游離蒽醌及結(jié)合蒽醌類成分均有明顯區(qū)別，進(jìn)一步說明產(chǎn)地是影響飲片質(zhì)量的重要因素之一。

《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)對何首烏飲片中二苯乙烯苷和結(jié)合蒽醌含量進(jìn)行控制，沒有關(guān)注游離蒽醌類成分，但在實(shí)驗(yàn)過程中本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地片與潤切片中以大黃素為代表的游離蒽醌類成分可能存在差異。文獻(xiàn)報(bào)道中游離蒽醌具有抗炎、抗菌等作用[36]，可能與生首烏解毒、截瘧等作用存在一定關(guān)聯(lián)[37]，因此在推廣和應(yīng)用產(chǎn)地片的過程中，建議進(jìn)一步關(guān)注游離蒽醌成分，以保證飲片質(zhì)量穩(wěn)定可控。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on chemical components ofbetween integrated processing and traditional processing

HUANG Meng-qiu, SUN Lian-na, DONG Zhi-ying, TU Yan, QIU Shi

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

To analyze and identify the chemical components from Heshouwu () and compare the differences of chemical components between integrated processed and traditional processed slices by metabolomics.The chemical components ofwere characterized by ultra performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS), and the metabolomics approach was used to compare the differences of components between integrated processed and traditional processed slices.A total of 69 components were identified fromby MS-FINDER software based on the information of the reference standards, accurate molecular weight of chromatographic peaks, fragmentation patterns and other information. Multivariate statistical analysis was applied to compare the differences of chemical components between the integrated pieces and the traditional slices. The results showed that no significant differences were observed in the overall chemical profile, whereas there were differences in free anthraquinones such as emodin, stilbene glucoside and emodin-8--β--glucoside.The integrated technology of origin producing and processing is more advantageous than the traditional processing in simplifying processing steps and improving production efficiency. However, in the process of promoting the integrated processing method, the influence of free anthraquinones should be considered.

Thunb.; processing in producing areas; UPLC-QTOF-MS; chemical composition; metabolomics; emodin; stilbene glycoside; emodin-8--β--glucoside

R284.1

A

0253 - 2670(2022)17 - 5293 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.005

2021-12-27

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81903745）；上海市浦江人才計(jì)劃（19PJ1409300）

黃孟秋（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴巶鹘y(tǒng)炮制技術(shù)與中藥材特性研究。Tel: 19121701397 E-mail: huangmengqiu2020@163.com

邱 實(shí)。Tel: 18844160246 E-mail: davidhugh@msn.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]