丙型肝炎病毒感染者血清微小核糖核酸665和224 的表達及其對肝癌的診斷價值

趙婧 魏巍 李會平 杜曉溪 曹明 王楷翔

1 河北省唐山市中心血站檢驗科，唐山 063000；2 河北省唐山市人民醫(yī)院檢驗科，唐山 063000；3 河北省保定市人民醫(yī)院檢驗科，保定 071000

HCV 持續(xù)感染可導致慢性丙型肝炎（CHC）、肝硬化甚至是肝癌，嚴重影響人類生命健康[1]。 微小核糖核酸 （miR） 作為一類新型的基因調(diào)控分子，在HCV 感染發(fā)生發(fā)展的不同階段存在不同的異常表達， 研 究 發(fā)現(xiàn)，miR-665 及 miR-224 表 達 水 平 與HCV 的感染和致病密切相關(guān)[2-3]。本研究通過檢測丙型肝炎患者血清miR-665 及miR-224 表達水平，分析其對肝癌的診斷價值，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選取 2017年 1月至 2020年 5月保定市人民醫(yī)院收治的130例 HCV 感染患者， 其中男性72例，女性 58例，年齡（49.25±9.70）歲，范圍 28～68歲。 130例HCV 感染者根據(jù)疾病類型分為CHC 組54例，肝硬化組46例和肝癌組30例。納入標準：①符合《丙型肝炎防治指南》[4]中CHC、肝硬化和肝癌的診斷標準； ②患者均來源于HCV 感染。 排除標準：①其他類型感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾??；②妊娠、哺乳期女性。 另選擇同期健康體檢者共60 名作為對照組， 包括男性32 名， 女性28名，年齡（48.62±9.35）歲，范圍 30～65歲。 本研究經(jīng)保定市人民醫(yī)院倫理委員會審批通過 （倫理審批號：2017012），并與研究對象簽署知情同意書。

二、實驗室指標檢測

所有研究對象均于入院未治療時或體檢時采集空腹靜脈血5 mL 置于未加抗凝劑的離心管中，3 000 r/min（離心半徑12.5 cm）離心10 min 分離血清，使用SLAN96P 型熒光定量PCR 儀和試劑（上海宏石公司）檢測 HCV RNA、miR-665 及 miR-224。 根據(jù)HCV RNA 的檢測結(jié)果，＜103IU/mL 為低病毒載量，103～106IU/mL 為中病毒載量，＞106IU/mL 為高病毒載量。 miR-665 引物設(shè)計：上游：5'-GCTAGTCT GATCACTAGTAG-3'，下游：5'-AGCACTCATGCGTG TACG-3'；miR-224 引物設(shè)計：上游：5'-GCTACTCTG ATGACGAGTCG-3'，下游：5'-ACGATTCATGACTAT GTG-3'。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 15 μL：5 μL RNA 模板，3 μL U6 及 miR 特異性莖環(huán)引物，0.15 μL 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，1.50 μL反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μL RNase 抑制劑，4.16 μL 雙蒸水。 PCR 總反應(yīng)體系為 20 μL∶1 μL 引物及探針Mix，10 μL TaqMan 通用混合物溶液，1.33 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補 DNA，7.67 μL 雙蒸水； 擴增條件為：95 ℃變性 15 s、60 ℃退火 60 s、72 ℃延伸 60 s，進行 45 個循環(huán)。 以 U6 為內(nèi)參，每組樣本重復(fù) 3 次，采用 2-ΔΔCt法計算 miR-665 及 miR-224 水平。 使用貝克曼化學發(fā)光儀檢測肝纖維化四項 [Ⅲ型前膠原(PⅢNP)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層黏連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸酶(HA)]及甲胎蛋白（AFP）水平；貝克曼生化分析儀檢測ALT 及AST 水平。

三、肝臟組織病理檢查

患者平臥位或左側(cè)臥位，通過彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)引導， 經(jīng)皮穿刺獲取長度＞1 cm 的肝組織送檢。 肝纖維化程度采用Metavir 評分進行判斷，分為F0（無纖維化），F(xiàn)1（局限性匯管區(qū)纖維增生，竇周和小葉內(nèi)纖維化），F(xiàn)2 （纖維化擴大至匯管區(qū)周圍，肝小葉結(jié)構(gòu)保留），F(xiàn)3 （纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化），F(xiàn)4（早期肝硬化）。

四、統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。 計數(shù)資料采用例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗。 應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清 miR-224、miR-665 及 AFP水平診斷肝癌的價值，miR-224、miR-665 及 AFP 三項聯(lián)合診斷為并聯(lián)試驗（三項聯(lián)合檢測中有1 項為陽性即判定為陽性）。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、基本情況

CHC 組、肝硬化組、肝癌組和對照組間ALT 和AST 水平比較差異有統(tǒng)計學意義 （F=8.28 和7.79，P＜0.001），兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，肝癌組、肝硬化組和 CHC 組 ALT （q=12.37、14.15、10.32）及AST（q=11.81、13.62、8.73）水平均較高，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.001）。 四組間性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)及HCV RNA 差異均無統(tǒng)計學意義 （P 均>0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 CHC 組、肝硬化組、肝癌組和對照組基本情況比較

二、血清 miR-665、miR-224、AFP 及肝纖維化四項水平比較

CHC 組、 肝硬化組、 肝癌組和對照組的血清miR-665、miR-224、AFP 及肝纖維化四項 （PⅢNP、CⅣ、LN、HA） 水平比較差異均有統(tǒng)計值意義 （F=16.18、11.52、21.63、9.71、15.84、8.25 和 14.39，P 均＜0.001）。 與對照組比較，肝癌組、肝硬化組和 CHC 組血清 miR-665（q=17.39、13.84、10.25）、miR-224（q=10.29、12.65、12.85）、AFP（q=9.94、14.27、9.62） 及 肝纖維化四項 （PⅢNP、CⅣ、LN、HA）（肝癌組：q=15.98、9.81、9.41 和 33.63， 肝硬化組：q=9.51、8.80、18.42 和 11.14，CHC 組：q=8.71、16.41、10.24 和9.61）水平均較高（P 均<0.001），且肝癌組血清 miR-665、miR-224 及 AFP 水平均明顯高于 CHC 組（q=17.11、15.12 和 30.92） 和肝硬化組 （q=17.00、14.97 和28.74），差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.001）。 肝硬化組血清CⅣ和HA 水平明顯高于肝癌組（q=13.27 和16.94） 和 CHC 組 (q=11.53 和 18.15，P 均<0.001）。CHC 組和肝硬化組血清 miR-665、miR-224、AFP、PⅢNP 及 LN 水平均無統(tǒng)計學差異（P 均>0.05）。 具體結(jié)果見表2。

表2 不同組別患者血清miR-665、miR-224、AFP 及肝纖維化四項水平比較（）

表2 不同組別患者血清miR-665、miR-224、AFP 及肝纖維化四項水平比較（）

注：miR：微小核糖核酸；AFP：甲胎蛋白；CHC： 慢性丙型肝炎；PⅢNP：Ⅲ型前膠原；CⅣ：Ⅳ型膠原；LN：層黏連蛋白；HA：透明質(zhì)酸酶；與對照組比較，a：P<0.001；與 CHC 組比較，b：P<0.001；與肝硬化組比較，c：P<0.001

組別例數(shù)（例） miR-665 miR-224 AFP（ng/mL） PⅢNP（ng/mL） CⅣ（ng/mL） LN（ng/mL） HA（ng/mL）對照組 60 1.05±0.27 0.16±0.05 9.75±2.84 5.37±1.92 20.73±6.15 11.36±4.28 50.41±15.39 CHC 組 54 2.28±0.93a 0.85±0.26a 45.80±10.36a 10.74±5.26a 81.62±24.71a 38.62±10.24a 342.20±75.26a肝硬化組 46 2.33±0.96a 0.91±0.32a 51.72±11.45a 11.35±6.50a 166.74±68.20ab 42.73±15.20a 740.52±106.37ab肝癌組 30 6.74±1.52abc 1.95±0.84abc 364.28±35.70abc 12.38±8.52a 115.28±41.27abc 38.10±11.35a 529.16±87.40abc F 值 16.18 11.52 21.63 9.71 15.84 8.25 14.39 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

三、 不同特征HCV 感染患者血清miR-665 及miR-224 表達水平比較

表3 顯示， 不同病毒載量組別的血清miR-665及miR-224 表達水平差異有統(tǒng)計學意義 （F=14.83、8.71，P 均＜0.001），其中高病毒載量組血清 miR-665及miR-224 表達水平明顯高于中病毒載量組（q=16.37和 21.52）和低病毒載量組（q=10.37 和13.52），差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.001），且中病毒載量組血清miR-665 及miR-224 表達水平明顯高于低病毒載量組（q=11.24 和 8.53 ，P 均<0.001）。另外，不同肝纖維化分期組的血清miR-665 及miR-224 表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=17.62，11.18，P 均＜0.001），其中 F3～F4 期血清 miR-665 及 miR-224 表達水平明顯高于 F0 期 （q=24.638 和 14.413） 和 F1～F2 期（q=18.52 和 11.40）， 差異均有統(tǒng)計學意義 （P 均<0.001），F(xiàn)1～F2 期血清 miR-665 及 miR-224 表達水平明顯高于 F0 期（q=13.71 和 10.61，P 均<0.001）。 具體結(jié)果見表3。

表3 血清miR-665 及miR-224 在不同特征HCV 感染者中的表達水平（）

表3 血清miR-665 及miR-224 在不同特征HCV 感染者中的表達水平（）

注：miR：微小核糖核酸；HCV RNA<103 IU/mL 為低病毒載量；103~106 IU/mL 為中病毒載量；>106 IU/mL 為高病毒載量；與低病毒載量組比較，a：P <0.001；與中病毒載量組比較，b：P <0.001；與 F0 期比較，c：P <0.001；與 F1～F2 期比較，d：P <0.001

肝纖維化分期低（n=34） 中（n=57） 高（n=39） F 值 P 值 F0（n=29） F1～F2（n=56） F3～F4（n=45） F 值 P 值miR-665 1.82±0.61 2.75±0.94a 6.58±1.40ab 14.83 <0.001 1.51±0.48 2.90±0.96c 6.83±1.62cd 17.62 <0.001 miR-224 0.51±0.13 1.32±0.48a 2.05±0.86ab 8.71 <0.001 0.35±0.08 1.40±0.52c 2.36±0.90cd 11.18 <0.001項目 病毒載量

四、miR-665、miR-224 及 AFP 診斷肝癌的價值

miR-665、miR-224 及 AFP 三項聯(lián)合診斷肝癌的曲線下面積為0.963， 明顯高于單項miR-665、miR-224 及 AFP（0.851、0.815 及 0.920）；同時其靈敏度和特異性為99.2%和90.3%， 也優(yōu)于三項單項檢測結(jié)果（靈敏度和特異性：miR-665 分別為81.3%和 86.2%，miR-224 分別為 83.7%和 75.8%，AFP 分別為93.6%和87.5%）。 見表4。

表4 miR-665、miR-224 及 AFP 診斷肝癌的價值

討 論

miR 是一類小分子非編碼RNA，在CHC 發(fā)展、肝細胞再生和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用，與肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5]。 近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-665 及miR-224 表達水平在肝細胞癌中的表達與腫瘤細胞増殖、遷移、侵襲能力及預(yù)后相關(guān)，可促進肝癌細胞增殖、細胞周期和凋亡，有望作為肝癌診斷、預(yù)后預(yù)測的標志物和治療靶點[6-7]。 同時miR-665 及miR-224 具有穩(wěn)定性好、 特異性高、 易于檢測等優(yōu)點。 因此，本研究選擇miR-665 及 miR-224 作為研究指標，以期為肝癌的診斷及治療提供幫助。

一、血清miR-665 及miR-224 表達水平隨著丙型肝炎患者疾病進展而升高

本研究顯示，肝癌組、肝硬化組和CHC 組血清miR-665 及miR-224 表達水平均明顯高于對照組，且肝癌組血清miR-665 及miR-224 表達水平均明顯高于CHC 組和肝硬化組， 提示 miR-665 及miR-224 可能參與丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過程。An 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-224 通過調(diào)節(jié)多種信號通路在肝癌細胞的生長、增殖、侵襲和遷移中起到促進作用。 另有研究指出，miR-665 與肝癌患者的臨床病理特征和不良預(yù)后呈正相關(guān)，可能成為肝癌患者治療的新診斷標志物和靶點[9]。本研究顯示，血清miR-665 及miR-224 表達水平隨著肝纖維化分期的增高而逐漸升高， 說明它們與HCV 感染患者的病毒傳染性和肝纖維化程度密切相關(guān)。

二、血清 miR-665 和 miR-224 聯(lián)合 AFP 對肝癌有良好的診斷價值

AFP 是目前診斷原發(fā)性肝癌的經(jīng)典腫瘤標志物。 而據(jù) Mohamed 等[10]研究發(fā)現(xiàn) miR-665 對肝癌的診斷也具有較好的靈敏度和特異性，可作為肝癌診斷的一個有前途的生物標志物。 同時，Lin 等[11]也發(fā)現(xiàn)早期肝癌患者血清miR-224 水平明顯高于肝硬化、慢性肝炎和健康對照者，認為miR-224 是檢測早期肝癌的一個潛在的生物標志物。本研究ROC 曲線顯示，miR-665 及miR-224 對肝癌診斷均具有較好的價值， 聯(lián)合AFP 診斷肝癌的曲線下面積最大，說明miR-665 及miR-224 表達水平可診斷肝癌的生物學標志物，其聯(lián)合AFP 診斷肝癌的效能較高。

綜上所述， 隨著病情的進展，HCV 感染所致相關(guān)肝炎患者血清miR-665 及miR-224 表達水平明顯升高， 其聯(lián)合AFP 對診斷HCV 感染導致的肝癌具有較好的價值。 但本研究為單中心的臨床分析，影響HCV 感染及肝癌發(fā)生發(fā)展的混雜因素較多，其結(jié)果可能存在偏倚，未來仍需擴大樣本進行更深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明趙婧：論文撰寫和修改；魏巍、李會平、曹明：實驗結(jié)果的檢測及數(shù)據(jù)收集；杜曉溪：實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析；王楷翔：論文設(shè)計及實驗指導