光照對(duì)壇紫菜生長(zhǎng)和無(wú)機(jī)碳利用的影響

徐琳杰，李夢(mèng)雅，許 凱，徐 燕，紀(jì)德華，王文磊，陳昌生，謝潮添

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

大型海藻主要分布在潮間帶，接受的光照強(qiáng)度和波長(zhǎng)會(huì)隨著混合層深度及海水透光性的變化而發(fā)生改變。因此，大型海藻必須具備光適應(yīng)機(jī)制，以滿(mǎn)足自身對(duì)光照的需求。壇紫菜由葉狀體(配子體)和絲狀體(孢子體)兩個(gè)世代構(gòu)成異形世代交替生活史，兩個(gè)世代在形態(tài)及生活環(huán)境等方面都差異顯著[7]。在自然環(huán)境中，絲狀體生長(zhǎng)在低潮區(qū)或潮下帶的貝殼等石灰?guī)r基質(zhì)的內(nèi)部，葉狀體附著在中高潮區(qū)的巖礁上生長(zhǎng)[8]。這種生活環(huán)境的差異表明壇紫菜的兩個(gè)世代對(duì)光強(qiáng)的要求可能不同[9]。為此，研究人員分析了光強(qiáng)對(duì)壇紫菜生長(zhǎng)的影響[10-12]：在50 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，壇紫菜葉狀體的生長(zhǎng)和光合速率都高于絲狀體；當(dāng)光強(qiáng)高于100 μmol·m-2·s-1時(shí)，壇紫菜絲狀體生長(zhǎng)受到抑制；而在550 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，葉狀體生長(zhǎng)速率沒(méi)有受到顯著抑制。

壇紫菜生長(zhǎng)的基礎(chǔ)是光合作用，即以光能為能量來(lái)源，吸收無(wú)機(jī)碳并合成有機(jī)物。理論上光與無(wú)機(jī)碳利用的關(guān)系非常緊密，但以往研究并不認(rèn)可這一點(diǎn)[13]。為此，本研究擬分析壇紫菜葉狀體及絲狀體在不同光照條件下生長(zhǎng)和無(wú)機(jī)碳利用上的差異。本研究擬通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分析在10，50，500 μmol·m-2·s-1三種光強(qiáng)下，壇紫菜光合速率、生長(zhǎng)、色素、無(wú)機(jī)碳吸收速率和碳酸酐酶活性等應(yīng)答光照強(qiáng)度的變化，有利于進(jìn)一步了解壇紫菜光合生理及無(wú)機(jī)碳利用的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為壇紫菜Z-61品系，由集美大學(xué)壇紫菜團(tuán)隊(duì)通過(guò)雜交方法選育獲得，以自由絲狀體形式保存在福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫(kù)。藻體培養(yǎng)溫度為21 ℃，光周期為12 L∶12 D，光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)液每2 d更換一次，以保證生長(zhǎng)過(guò)程中有充足的營(yíng)養(yǎng)鹽。葉狀體培養(yǎng)至15 cm 左右，剪成2～3 cm長(zhǎng)的片段。絲狀體用茶漏匙收集。藻體用無(wú)菌紗布吸干表面水分備用。將藻體分別放入1 L培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2 d(短期)和7 d(長(zhǎng)期)，設(shè)置10，50，500 μmol·m-2·s-1三種光強(qiáng)，每種處理設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 熒光參數(shù)的測(cè)定

將藻體放置于21 ℃溫度恒定的培養(yǎng)室內(nèi)，暗處理15 min，隨后用Diving-PAM(Walz,Germany)分別測(cè)定絲狀體和葉狀體的光系統(tǒng) Ⅱ 最大光化學(xué)效率Fv/Fm，其飽和脈沖光強(qiáng)為8000 μmol·m-2·s-1。

1.3 凈光合速率的測(cè)定

采用黑白瓶法測(cè)定凈光合放氧速率。用紗布輕壓絲狀體和葉狀體去除表面的水分，稱(chēng)量其鮮重(WF)。然后將藻體放入玻璃溶氧瓶中，以不加藻體的作為空白瓶。白瓶置于對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)光強(qiáng)下培養(yǎng)4 h。測(cè)定培養(yǎng)前后的溶解氧濃度。溶解氧測(cè)定方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 7489—1987)，用G20電位滴定儀(METTLER-TOLEDO)自動(dòng)檢測(cè)滴定終點(diǎn)并識(shí)別等當(dāng)點(diǎn)。白瓶和空白瓶的溶解氧差值用于計(jì)算凈光合速率。

1.4 CA的測(cè)定

參照Wilbur[14]的方法測(cè)定eCA及總碳酸酐酶(total CA)活性。取適量藻體稱(chēng)量鮮重(WF)，并用無(wú)碳海水沖洗三遍。無(wú)碳海水的配置方法：加入鹽酸使新鮮海水培養(yǎng)基的pH值小于3，在冰浴條件下，充氮?dú)?30 min，隨后加入Tris試劑使最終質(zhì)量濃度為6 g·L-1，繼續(xù)充氮?dú)?0 min，然后添加NaOH將海水pH值調(diào)整為8.1。將漂洗后的藻體放入5 mL無(wú)碳海水中，迅速加入2.5 mL CO2飽和海水，立即計(jì)時(shí)，記錄混合液pH值從8.1降到7.2的時(shí)間(T藻樣)。同時(shí)記錄不加藻體的無(wú)碳海水pH值下降時(shí)間(T空白)，并依照公式E(eCA)=(T空白÷T藻樣-1)÷WF計(jì)算eCA的活性E(eCA)。

對(duì)于總碳酸酐酶活性，取適量藻體，用2 mL無(wú)CO2海水研磨粉碎，將1 mL勻漿與4 mL無(wú)碳海水及2.5 mL CO2飽和海水迅速于燒杯中混合。記錄T藻樣和T空白，并依照公式E(total CA)=(T空白÷T藻樣-1)÷(0.5×WF)計(jì)算總碳酸酐酶的活性E(tatal CA)。

1.5 色素含量的測(cè)定

用紗布吸掉藻體表面水分，稱(chēng)其鮮重。取3份藻體置于55 ℃烘箱中烘2 h，稱(chēng)其干重(WD)。測(cè)定藻體的含水率(WC)。

參照J(rèn)ensen[15]的方法測(cè)定葉綠素a(Chla)含量。將藻體在4 ℃的90%(體積分?jǐn)?shù))丙酮中研磨粉碎，將組織勻漿放入50 mL(V)磨口瓶中。室溫下，遮光萃取24 h，離心后取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)定其在666 nm和730 nm處的吸光度值(A)。Chla質(zhì)量比(mg/g)的計(jì)算公式為：w(Chla)=(A666-A730)×10V÷890×[WF(1-WC)]。

參照高洪峰[16]的方法測(cè)定藻膽蛋白含量。將藻體在4 ℃的0.05 mol·L-1PBS(pH=6.8)緩沖液中研磨粉碎。將組織勻漿放入-20 ℃冰箱冷凍，待完全冷凍后取出放置在室溫下解凍，反復(fù)凍融6次，然后于4 ℃冰箱中過(guò)夜。離心后取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)定其在565,615，650，615，730 nm處的吸光度值(A)。每克藻體中藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)質(zhì)量比w(mg/g)的計(jì)算公式[16]為：

w(PE)=[0.123(A565-A730)-0.068(A615-A730)+0.015(A650-A730)]×V÷[WF(1-WC)],

w(PC)=[0.162(A615-A730)-0.001(A565-A730)-0.098(A650-A730)]×V÷[WF(1-WC)],

w(APC)=[0.171(A650-A730)-0.006(A565-A730)-0.004(A615-A730)]×V÷[WF(1-WC)]。

1.6 光合-無(wú)機(jī)碳響應(yīng)曲線(xiàn)(P-C曲線(xiàn))

配置不同無(wú)機(jī)碳濃度的海水：往無(wú)碳海水中加入NaHCO3，配制無(wú)機(jī)碳濃度為0,0.05,0.1,0.5,1,2,4,10 mmol·L-1的海水。取適量藻體置于不同無(wú)機(jī)碳濃度海水中，培養(yǎng)4 h，測(cè)量10,50,500 μmol·m-2·s-1三種光照強(qiáng)度下的放氧速率。通過(guò)Michaelis-Menten方程v=vmax×[s]/(Km+[s])，求得最大光合速率(vmax)。其中：[s]為無(wú)機(jī)碳濃度；v為該無(wú)機(jī)碳濃度下的凈光合速率；Km為最大光合速率一半時(shí)的無(wú)機(jī)碳濃度。

1.7 比生長(zhǎng)速率

用紗布吸干藻體表面水分，稱(chēng)量培養(yǎng)前后藻體鮮重，分別記為WF0、WFt。計(jì)算比生長(zhǎng)速率μ的公式為：μ=(lnWFt-lnWF0)÷t,其中t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和雙因素方差分析法，分析光強(qiáng)對(duì)壇紫菜兩個(gè)世代的影響和差異。設(shè)定顯著性差異為P<0.05，極顯著差異為P<0.001，所用軟件為SPSS statistics 22.0。

2 結(jié)果分析

2.1 光強(qiáng)對(duì)Fv/Fm的影響

三種光強(qiáng)下，葉狀體的Fv/Fm均明顯高于絲狀體(P<0.05，見(jiàn)圖1)。其中，在10 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，差異極顯著(P<0.001)。隨著光強(qiáng)的增加，絲狀體和葉狀體的Fv/Fm都明顯下降，即與光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)。在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，葉狀體與絲狀體的Fv/Fm降幅都超過(guò)了55%。

2.2 光強(qiáng)對(duì)光合效率的影響

培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，光強(qiáng)升高可以增大藻體的凈光合速率,并且葉狀體比絲狀體的增幅更大(見(jiàn)圖2)。與10 μmol·m-2·s-1相比，光強(qiáng)提高到500 μmol·m-2·s-1，葉狀體和絲狀體凈光合速率分別增加2.8和7.1以上。無(wú)論培養(yǎng)2 d或7 d，在10 μmol·m-2·s-1下，葉狀體與絲狀體的凈光合速率沒(méi)有明顯差異(P>0.05)；提高光強(qiáng)后，葉狀體凈光合速率均顯著高于絲狀體(P<0.05)。

2.3 光強(qiáng)及無(wú)機(jī)碳濃度對(duì)光合速率的影響

如圖3所示，壇紫菜葉狀體和絲狀體的光合放氧速率都先隨無(wú)機(jī)碳濃度(DIC)的升高而增加，趨近飽和后不再增加。無(wú)論培養(yǎng)2 d或7 d，光強(qiáng)為50,500 μmol·m-2·s-1時(shí)，葉狀體的凈光合速率總是極顯著高于絲狀體(P<0.001)。這說(shuō)明壇紫菜絲狀體的光補(bǔ)償點(diǎn)比葉狀體低，更容易達(dá)到飽和。

如表1所示，絲狀體和葉狀體的最大光合速率(vmax)隨光照強(qiáng)度顯著增加(P<0.001)，說(shuō)明光照強(qiáng)度可以影響壇紫菜的光合固碳能力。在50 μmol·m-2·s-1及500 μmol·m-2·s-1的光強(qiáng)下，無(wú)論培養(yǎng)2 d或7 d，絲狀體的vmax無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨光強(qiáng)的增加，葉狀體vmax逐漸大于絲狀體，尤其在500 μmol·m-2·s-1下，葉狀體的vmax極顯著高于絲狀體(P<0.001)，達(dá)到6倍以上，說(shuō)明壇紫菜不同世代對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用能力存在較大差異。

表1 三種光強(qiáng)下壇紫菜的

2.4 光強(qiáng)對(duì)色素含量的影響

不論培養(yǎng)2 d或7 d，絲狀體和葉狀體的Chla含量隨光照強(qiáng)度的增加而呈極顯著降低(P<0.001)。絲狀體和葉狀體中， PE含量在38～65 mg·g-1范圍內(nèi)，遠(yuǎn)高于其他色素。葉狀體PE含量隨光強(qiáng)的增加而降低(P<0.05)；但在絲狀體中，PE含量?jī)H在培養(yǎng)7 d下與光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。整體而言，光強(qiáng)對(duì)PC和APC含量的影響較小(P>0.05)。僅在培養(yǎng)7 d后，葉狀體中PC含量與光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

2.5 光強(qiáng)對(duì)碳酸酐酶活性的影響

由圖5所示，培養(yǎng)2 d或7 d，total CA和eCA活性均與光強(qiáng)呈正相關(guān)(P<0.001)。與10 μmol·m-2·s-1相比，在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，葉狀體和絲狀體的total CA和eCA活性增幅均超過(guò)40%。在10 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)7 d，total CA存在世代差異(P<0.05)，但在其他光照與培養(yǎng)時(shí)間下，壇紫菜的total CA和eCA均無(wú)顯著的世代差異(P>0.05)(見(jiàn)圖5)。

2.6 光強(qiáng)對(duì)生長(zhǎng)的影響

如圖6可見(jiàn)，壇紫菜絲狀體和葉狀體的生長(zhǎng)對(duì)光強(qiáng)的響應(yīng)存在差異。培養(yǎng)2 d或7 d，葉狀體生長(zhǎng)和光強(qiáng)均呈正相關(guān)，相比于10 μmol·m-2·s-1，在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下葉狀體的生長(zhǎng)增加670%以上(P<0.001)。而絲狀體截然相反，相比于10 μmol·m-2·s-1，在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)2 d，絲狀體的生長(zhǎng)降低了90%(P<0.001)。在50，500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)，壇紫菜的生長(zhǎng)存在明顯的世代差異(P<0.05)，尤其在500 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)2 d，葉狀體的比生長(zhǎng)速率μ比絲狀體高了近42倍。然而，在10 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)7 d，絲狀體μ比葉狀體高了近5倍。

3 討論

3.1 無(wú)機(jī)碳利用的世代差異對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答

藻體對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用會(huì)影響光合速率，因此最大光合速率vmax是判斷藻類(lèi)無(wú)機(jī)碳親和力的重要參數(shù)。本研究結(jié)果表明，隨著無(wú)機(jī)碳濃度的提高，壇紫菜絲狀體的vmax比葉狀體更容易達(dá)到峰值，表明葉狀體對(duì)無(wú)機(jī)碳利用能力更強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。此外，葉狀體與絲狀體的vmax均與光強(qiáng)呈正相關(guān)(見(jiàn)表1)，這與Takashi[20]在衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中的研究結(jié)果相一致，這表明光強(qiáng)可以影響CCM。凈光合速率是碳捕獲能力的最終體現(xiàn)。本研究中，相比于光強(qiáng)10 μmol·m-2·s-1，壇紫菜在光強(qiáng)500 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)2 d和7 d后，絲狀體和葉狀體的凈光合放氧速率提高至2.8倍和7.1倍(見(jiàn)圖2)。這些結(jié)果說(shuō)明光強(qiáng)的增加可以提高無(wú)機(jī)碳的利用能力，從而對(duì)壇紫菜的光合作用產(chǎn)生促進(jìn)效果。

綜上，壇紫菜兩個(gè)世代的無(wú)機(jī)碳利用對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答存在明顯差異。

3.2 光強(qiáng)對(duì)光合作用和生長(zhǎng)的影響及世代差異

光是影響大型海藻生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素之一，光強(qiáng)變化會(huì)影響藻類(lèi)的光合作用、色素合成、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累及生長(zhǎng)速率[21]。Fv/Fm是一種準(zhǔn)確、靈敏的光響應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)，能反映藻體受到光抑制的程度[22]。在強(qiáng)光下，能量過(guò)載和對(duì)PS Ⅱ的損傷是Fv/Fm降低的主要原因[23]。在本研究中，隨著光強(qiáng)的增加，壇紫菜的兩個(gè)世代Fv/Fm均逐漸降低，說(shuō)明強(qiáng)光對(duì)葉狀體和絲狀體的光合系統(tǒng)均產(chǎn)生抑制作用(見(jiàn)圖1)。高等植物會(huì)改變捕光色素的濃度和比例，在強(qiáng)光下減少色素含量以減弱光抑制，而在弱光下提高色素含量以提高捕光效率[23-24]。壇紫菜的捕光色素不僅有葉綠素，還有大分子藻膽蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照增加，壇紫菜Chla和PE含量顯著降低，但PC和APC含量沒(méi)有顯著變化(見(jiàn)圖4)。這說(shuō)明壇紫菜的色素對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答比高等植物更復(fù)雜。Harb等[25]發(fā)現(xiàn)，增加光強(qiáng)，紅藻擬雞毛菜(Pterocladiellacapillacea)的PC含量減少，但Chla和APC含量沒(méi)有明顯變化，而PE含量是先增加后減少。龍須菜(Gracilarialemaneiformis)隨光強(qiáng)的增加，PC和Chla含量不變，而PE及APC含量減少[26]。由此可知，壇紫菜、龍須菜和擬雞毛菜三種紅藻對(duì)光的響應(yīng)并不相同。

光合作用是光合生物干物質(zhì)積累的基礎(chǔ)，因此決定了經(jīng)濟(jì)海藻的產(chǎn)量[27]。但是不適宜的光強(qiáng)會(huì)抑制或減弱光合作用，從而抑制植株的生長(zhǎng)。趙振魯?shù)萚28]和Wang等[3]通過(guò)對(duì)蟲(chóng)黃藻(Symbiodiniumvoratum)、綠藻(Botryococcusbraunii)的研究發(fā)現(xiàn)，藻體生長(zhǎng)速率隨光強(qiáng)增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。研究[10-12，29]表明，壇紫菜葉狀體比絲狀體更喜強(qiáng)光，但兩個(gè)世代來(lái)自不同的品系。本研究中，通過(guò)比較來(lái)自同一品系的葉狀體和絲狀體，發(fā)現(xiàn)：相較于光強(qiáng)50 μmol·m-2·s-1，高光強(qiáng)500 μmol·m-2·s-1下絲狀體的生長(zhǎng)速率降低了90%，而葉狀體則升高了38%；低光強(qiáng)10 μmol·m-2·s-1下，絲狀體生長(zhǎng)速率下降了25%，葉狀體卻下降了85%(見(jiàn)圖6)。這說(shuō)明強(qiáng)光對(duì)壇紫菜葉狀體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但抑制絲狀體生長(zhǎng)；壇紫菜絲狀體更適應(yīng)低光，而葉狀體更適應(yīng)高光，兩個(gè)世代的光合作用和生長(zhǎng)，以及對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答存在明顯差異。

綜上所述，壇紫菜兩個(gè)世代對(duì)光強(qiáng)的應(yīng)答在無(wú)機(jī)碳利用、光合作用以及生長(zhǎng)上存在差異。壇紫菜的生長(zhǎng)速率不完全與光化學(xué)反應(yīng)和固碳效率相一致。因此，在壇紫菜高產(chǎn)新品系的選育與評(píng)估時(shí)，生長(zhǎng)速率才是衡量產(chǎn)量的重要指標(biāo)，凈光合速率只能作為輔助參考。在壇紫菜絲狀體育苗、葉狀體養(yǎng)殖以及種質(zhì)保存期間，應(yīng)選擇適宜的光照強(qiáng)度進(jìn)行培育以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。