乳酸菌發(fā)酵駝乳工藝優(yōu)化及抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的研究

買爾哈巴·艾合買提，曹 英，2，崔衛(wèi)東，陳鋼糧，侯新強(qiáng)，薛 杉，2，侯 敏

1 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，新疆烏魯木齊 8300912 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 8300523 新疆旺源生物科技集團(tuán)有限公司，新疆福海 836400

0 引言

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用，因胰島素分泌絕對或相對不足及細(xì)胞對胰島素敏感性降低等一系列代謝紊亂的臨床綜合征[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布的最新數(shù)據(jù)，2021年全球約5.37 億成年人患有糖尿病，我國是全球糖尿病第一大國，患者數(shù)高達(dá)1.298 億人，其中Ⅱ型糖尿病占比超過90%。目前Ⅱ型糖尿病的主要治療方法是口服降糖藥物、合理飲食控制體重、達(dá)到降低血糖的目的[2]。但多項研究顯示，長期使用降糖藥物會產(chǎn)生惡心、胃腸道不適等不良反應(yīng)[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此研發(fā)副作用小、兼顧治療并發(fā)癥的藥物，特別是天然物質(zhì)的開發(fā)利用，在治療糖尿病方面成為一種新的流行趨勢[4]。

發(fā)酵駝乳是以新鮮駝乳為原料，經(jīng)殺菌、接種發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品[5]。經(jīng)微生物發(fā)酵后的駝乳，大分子物質(zhì)被降解，產(chǎn)生游離氨基酸、多肽、游離脂肪等，有利于機(jī)體消化吸收，乳糖被分解轉(zhuǎn)化為乳酸、乙醇并生成醛、酮、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，賦予發(fā)酵乳特有的風(fēng)味和口感[6]。此外，駝乳在微生物的作用下也能產(chǎn)生一系列具有增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、降糖降脂的功能性物質(zhì)[7]。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)益生菌能顯著改善糖尿病大鼠的胰島抵抗，益生菌通過上調(diào)G蛋白偶聯(lián)受體43/41，觸發(fā)胰高血糖素樣肽-1分泌增強(qiáng)胰島素分泌，改善腸道屏障功能，降低大鼠的血糖水平。糖尿病長期發(fā)展會產(chǎn)生多種并發(fā)癥，造成多種器官、系統(tǒng)的損傷，而肝臟組織的受損會導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[9]。有研究報道，發(fā)酵駝乳能極顯著提高小鼠血清、腦組織和骨骼肌中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化活力，降低小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。目前對于發(fā)酵駝乳的研究多集中于發(fā)酵駝乳中微生物的多樣性、免疫活性肽的分離鑒定等，較少有對發(fā)酵駝乳體外降糖活性指標(biāo)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的測定及與抗氧化活性相關(guān)指標(biāo)的測定。

因此本研究將實驗室前期從駝乳中分離純化得到的副干酪乳桿菌和乳明串珠菌混合發(fā)酵駝乳，通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵駝乳的最優(yōu)工藝參數(shù)，得到發(fā)酵乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最大抑制率，通過測定發(fā)酵駝乳和牛乳在儲藏期間的一系列指標(biāo)，比較不同發(fā)酵乳的發(fā)酵性能和體外降糖活性，為將駝乳開發(fā)成具有輔助降血糖作用的發(fā)酵乳制品提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗與方法

1.1 材料與試劑

乳明串珠菌、副干酪乳桿菌，前期實驗室分離純化所得；新鮮駝乳，阿勒泰吉木乃萬駝園養(yǎng)駝戶提供；西域春滅菌牛乳；MRS肉湯培養(yǎng)基、α-淀粉酶、可溶性淀粉、DNS試劑、α-葡萄糖苷酶、對硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷、磷酸緩沖液，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計（METTLER TOLEDO型）、高速冷凍離心機(jī)（Presoo17型）、恒溫培養(yǎng)箱（ZWY型），上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD型），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型），上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-6550型），日本自動化設(shè)備公司；酶標(biāo)儀（SepectraMaxM5e型），MOLECULAR DEVICES，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

將乳酸菌發(fā)酵液按3%接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化傳代，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～18 h，活化培養(yǎng)三代。新鮮駝乳經(jīng)過4000 r/min，15 min離心后棄去脂肪層，95 ℃滅菌5 min，將滅菌駝乳冷卻至42 ℃左右，在超凈工作臺中接入3%的發(fā)酵液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后置于4 ℃冰箱中冷藏。

1.3.2 接種比例工藝優(yōu)化

將乳明串珠菌和副干酪乳桿菌分別以1∶2、2∶3、1∶1、3∶2和2∶1的比例，按照2%的接種量將發(fā)酵劑接種到滅菌的脫脂駝奶中，置于37 ℃下發(fā)酵24 h。測定發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選擇合適的接種比例。

1.3.3 接種量工藝優(yōu)化

在接種比例1∶1、發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，接種量分別按照1%、2%、3%、4%和5%，待發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選擇合適的接種量。

1.3.4 發(fā)酵溫度工藝優(yōu)化

在接種比例1∶1、接種量2%的條件下，將發(fā)酵溫度設(shè)置為35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃，待發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選擇合適的發(fā)酵溫度。

1.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以接種比例（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）為正交試驗的3 個因素，每個因素選擇3 個水平，采用L9（34）正交試驗確定發(fā)酵駝乳的最優(yōu)工藝參數(shù)，正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平表L9（34）

1.5 發(fā)酵乳指標(biāo)測定

根據(jù)正交試驗所得最優(yōu)參數(shù)制備發(fā)酵駝乳作為試驗組，同一條件下發(fā)酵牛乳作為CK1，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵駝乳作為CK2，3 份樣品發(fā)酵24 h后，取出后置于4 ℃下儲藏，并在不同儲藏時間（0 d、3 d、6 d、9 d、12 d）進(jìn)行采樣，測定以下指標(biāo)。

1.5.1 發(fā)酵乳pH值的測定

采用pH計測定3 次取平均值

1.5.2 發(fā)酵乳滴定酸度的測定

滴定酸度用吉爾涅爾度（oT）表示，參考《GB 5009.239—2016 乳和乳制品酸度的測定》。用吸管量取10 mL的樣品進(jìn)入三角瓶內(nèi)，用20 mL的蒸餾水稀釋，加入0.5 mL 0.5%的酚酞溶液，將混合物小心地?fù)u動均勻，用0.1 mol/L NaoH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，邊滴加邊轉(zhuǎn)動燒瓶，滴定至微紅色，在2 min內(nèi)不消失即達(dá)到滴定終點。

酸度（oT）=A×10

式中：A——到滴定終點時消耗0.1 mol/L NaoH溶液的用量（mL）

1.5.3 發(fā)酵乳活菌數(shù)的測定

稱取25 mL發(fā)酵乳置于225 mL滅菌蒸餾水中，充分搖勻后形成稀釋液，梯度稀釋合適的倍數(shù)，取100 μL的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況記錄菌落數(shù)，每個梯度重復(fù)3 次取平均值。

1.5.4 對α-淀粉酶抑制活性的測定

將制備的發(fā)酵乳取50 mL，在轉(zhuǎn)速為10000 r/min溫度為4 ℃的條件下離心30 min，取上清液于4 ℃冰箱中備用，用于后續(xù)指標(biāo)的測定用。

125 μL樣品溶液與1 mg /mL的α-淀粉酶溶液等體積混合，于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，然后將反應(yīng)液加入至37 ℃的250 μL的1.5%的可溶性淀粉溶液中，于37 ℃反應(yīng)15 min，再加入500 μL DNS溶液，沸水浴中反應(yīng)5 min后迅速冷卻至室溫，稀釋20 倍后靜置30 min，并于540 nm 處測定吸光值。用PBS溶液（0.1 mol /L，pH = 6.8）作為α-淀粉酶溶液和待測樣品的空白對照。

式中：A為樣品組，含有樣品溶液和α-淀粉酶溶液；B為樣品空白組，含有樣品溶液、不含α-淀粉酶溶液；C為對照組，不含樣品溶液、含α-淀粉酶溶液；D為空白組，不含樣品溶液、不含α-淀粉酶溶液。

1.5.5 對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

在50 μL的樣液中加入100 μL濃度為0.125 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，將混合物于37 ℃孵化10 min，繼續(xù)加入50 μL 濃度為5 mmol/L的PNPG溶液，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，最后加入50 μL濃度為0.2 mol/L Na2CO3作為反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，將全部反應(yīng)液于405 nm處測定吸光度值。用PBS 溶液（0.1 mol /L，pH = 6.8）作為α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的空白對照。

式中：A為樣品組，含有樣品溶液和α-葡萄糖苷酶溶液；B為樣品空白組，含有樣品溶液、不含α-葡萄糖苷酶溶液；C為對照組，不含樣品溶液、含α-葡萄糖苷酶溶液；D為空白組，不含樣品溶液、不含α-葡萄糖苷酶溶液。

1.5.6 羥自由基清除能力的測定

羥自由基是活性氧自由基的一種，體內(nèi)自由基的積累會破壞細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)、造成細(xì)胞功能喪失、基因突變引發(fā)人體高血壓、癌癥等一系列疾病[11]，因此清除過量自由基，可有效提高機(jī)體的免疫功能，加快機(jī)體新陳代謝。H2O2和Fe2+通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，水楊酸與產(chǎn)生的羥自由基反應(yīng)生成有色物質(zhì)2，3-二羥基苯甲酸，在510 nm處有最大吸收峰，加入具有清除能力的物質(zhì)后，有色物質(zhì)便會減少，從而根據(jù)吸光值的數(shù)值判斷樣品清除羥自由基的能力。

1.5.7 超氧陰離子自由基清除能力的測定

AP-TEMED系統(tǒng)[12]產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-，NO2-與對氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在530 nm處有特征峰，樣品對超氧陰離子的清除能力與530 nm的吸光值呈負(fù)相關(guān)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 22、Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析，Origin2021軟件繪制作圖。

2 試驗結(jié)果

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 接種比例對發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1為接種比例對發(fā)酵乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，由圖可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃，接種量為2%，接種比例為1∶1、1∶2、2∶3、2∶1、3∶2時，隨著接種比例的變化，發(fā)酵乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈先升高再降低的趨勢，當(dāng)接種比例為2∶3時抑制活性最高，因此選擇1∶1、1∶2、2∶3作為后續(xù)正交優(yōu)化條件。

圖1 接種比例對發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.1.2 接種量對發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖2為發(fā)酵劑接種量對發(fā)酵乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，由圖可以看出，當(dāng)發(fā)酵劑的接種比為2∶3、發(fā)酵溫度為37 ℃、接種量為1%、2%、3%、4%、5%時，隨著接種量的增大，發(fā)酵乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當(dāng)發(fā)酵劑的接種量為3%時，發(fā)酵乳對兩種酶的抑制活性最高，因此選擇2%、3%、4%作為后續(xù)正交優(yōu)化條件。

圖2 接種量對發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖3 為發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，由圖可以看出，當(dāng)接種比例為2∶3、接種量為2%、發(fā)酵溫度為35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃時，隨著溫度的升高，對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時，發(fā)酵乳對兩種酶的抑制活性最高，因此選擇37 ℃、39 ℃、41 ℃作為正交優(yōu)化條件。

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取接種比例（A）、發(fā)酵劑接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）3 個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗，試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗因素結(jié)果表

分別以α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，由極差分析得到各因素對兩種酶抑制率影響的主次順序為C＞B＞A，即發(fā)酵溫度對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響最大，其次是接種量，接種比例的影響最小。發(fā)酵乳中通過微生物的代謝作用產(chǎn)生各種活性因子達(dá)到抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的作用，適宜的溫度有利于促進(jìn)微生物新陳代謝，因此發(fā)酵溫度對抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性影響較大。通過正交試驗結(jié)果可知，最優(yōu)水平組合為A3B1C2，即接種比例2∶3、接種量2%、發(fā)酵溫度39 ℃，按照最佳參數(shù)得到的發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別達(dá)到87.20%和23.85%，與未優(yōu)化前相比，α-淀粉酶的抑制率提高14.10%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高4.4%。

2.3 發(fā)酵乳指標(biāo)測定結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵乳pH值的變化

由圖4可知，隨著儲藏時間的延長，三組發(fā)酵乳的pH值呈下降趨勢，且發(fā)酵駝乳的pH值顯著低于發(fā)酵牛乳，試驗組的pH由第0d的4.90下降到第12 d的4.20，下降了14.28%；CK1組pH值由起始的4.92下降到4.30，下降12.60%；CK2的pH值從發(fā)酵起始的4.91下降到第12 d時的4.22，下降了14.05%。三組發(fā)酵乳前期pH值降低較為緩慢，其原因可能是乳酸菌活菌數(shù)較少，活力相對較弱，隨著發(fā)酵時間的增加乳酸菌利用乳中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷分解乳糖產(chǎn)生乳酸，生長活力旺盛，開始大量繁殖，降低發(fā)酵乳的pH值。

圖4 不同儲藏時間發(fā)酵乳的pH值變化

2.3.2 發(fā)酵乳滴定酸度的變化

滴定酸度是發(fā)酵乳發(fā)酵過程中重要的理化指標(biāo)之一，從圖4和圖5可以看出，隨著儲藏時間的延長，三種發(fā)酵乳的滴定酸度均逐漸升高，與pH值變化趨勢相反。試驗組、CK1、CK2的起始發(fā)酵酸度分別為81oT、89oT、83oT，符合發(fā)酵乳的國標(biāo)規(guī)定數(shù)值≥70oT，隨著儲藏時間的延長，微生物數(shù)量逐漸增多，發(fā)酵酸度也逐漸增大。到發(fā)酵第12d時，試驗組和CK2發(fā)酵駝乳的酸度分別達(dá)到128oT和127oT，CK1發(fā)酵牛乳組的酸度為109oT。到儲藏第12 d時實驗組、CK1和CK2的酸度值同第0 d時分別增加了33.59%、25.68%、34.64%。酸度和pH值呈負(fù)相關(guān)，酸度值越大pH值越低，在冷藏期間乳酸菌不斷分解乳糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳的酸度不斷降低。

圖5 不同儲藏時間發(fā)酵乳的酸度變化

2.3.3 發(fā)酵乳活菌數(shù)變化

由圖6可以看出，三組發(fā)酵乳的活菌數(shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，發(fā)酵起始試驗組的活菌數(shù)為8.8×107CFU/mL，CK1和CK2的活菌數(shù)分別為1.23×108CFU/mL和8.2×107CFU/mL，均高于發(fā)酵駝乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的1×106CFU/mL。從圖6中可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，三組發(fā)酵乳的活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢，試驗組和CK2在第3 d時，活菌數(shù)最高分別達(dá)到2.71×108CFU/mL和1.41×108CFU/mL，到發(fā)酵第12 d，兩組發(fā)酵乳活菌數(shù)逐漸降低為9.8×107CFU/mL和7.6×107CFU/mL，但試驗組活菌數(shù)仍然高于發(fā)酵起始活菌數(shù)。CK1發(fā)酵乳最高活菌數(shù)在第9d時達(dá)到最大3.82×108CFU/mL，隨后降低為1.94×108CFU/mL，到發(fā)酵后期隨著發(fā)酵乳的酸度升高，過酸的環(huán)境不適合乳酸菌的生長，導(dǎo)致發(fā)酵乳的活菌數(shù)開始下降。

圖6 不同儲藏時間發(fā)酵乳的活菌數(shù)變化

2.3.4 對α-淀粉酶抑制率的變化

從圖7可以看出三組發(fā)酵乳對α-淀粉酶的抑制率隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，試驗組對α-淀粉酶抑制率從87.20%降低到78.37%，在第6d時，試驗組對α-淀粉酶抑制率達(dá)到最大90.39%，且試驗組對α-淀粉酶抑制率顯著高于對照組（P＜0.05）。在第3d時，CK1對α-淀粉酶抑制率最大為68.28%，隨著儲藏時間的延長，逐漸降低為20.84%，CK2對α-淀粉酶抑制率的最大值為75.72%，在第12 d時降低為18.71%。試驗組總體都保持較高的α-淀粉酶抑制率，是由于駝乳本身就含有降糖活性因子，經(jīng)過益生菌的發(fā)酵產(chǎn)生更多的降糖活性肽等。

圖7 不同儲藏時間發(fā)酵乳對α-淀粉酶抑制率的變化

2.3.5 對α-葡萄糖苷酶抑制率的變化

從圖8中可以看出，試驗組對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著儲藏時間的延長抑制率逐漸升高，而對照組對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，試驗組對α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著均高于對組（P＜0.05）。整個儲藏期間試驗組對α-葡萄糖苷酶的抑制率從20.85%升高至36.32%，提升了42.49%，CK1對α-葡萄糖苷酶的抑制率在第6 d時達(dá)到最高為24.45%，CK2對α-葡萄糖苷酶的抑制率在第9 d時達(dá)到最高30.97%。儲藏后期抑制率降低可能與發(fā)酵后期活菌數(shù)數(shù)量下降有關(guān)，由于發(fā)酵乳pH值降低，產(chǎn)生過多的乳酸影響菌體的生長，次級代謝產(chǎn)物的合成受到影響，對α-葡萄糖苷酶的抑制率降低。

圖8 不同儲藏時間發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶抑制率的變化

2.3.6 對羥自由基清除率的變化

三組發(fā)酵乳對羥自由基清除率的變化，由圖9可以看出，試驗組和CK2組對羥自由基的清除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，試驗組對羥自由基清除率顯著高于對照組（P＜0.05）。CK1對羥自由基的清除率隨著儲藏時間的延長逐漸升高，但始終低于試驗組對羥自由基的清除率。在第9d時，試驗組對羥自由基的清除率達(dá)到最大值94.41%，與第0d相比增加了16.2%，到發(fā)酵第12d，試驗組對羥自由基的清除率為87.61%，仍然保持較高的清除率。CK1對羥自由基的清除率從60.74%增加到73.23%，CK2對羥自由基的清除率最高為86.55%，在第12d降低為66.29%。

圖9 不同儲藏時間發(fā)酵乳對羥自由基清除率的變化

2.3.7 對超氧陰離子清除率的變化

發(fā)酵乳對超氧陰離子清除率的變化如圖10所示，從圖中可以看出，試驗組和CK2對超氧陰離子的清除率隨著儲藏時間的延長逐漸升高，試驗組從第0d的65.56%的清除率升高至第1 d的77.47%，增加了15.4%。CK1對超氧陰離子的清除率先升高后降低，最高清除率為68.88%，在第12d時，降低60.09%。CK2對超氧陰離子的清除率從54.01%升高到71.13%。試驗組在整個儲藏時期內(nèi)對超氧陰離子自由基的清除率顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖10 不同儲藏時間發(fā)酵乳對超氧陰離子自由基清除率的變化

3 討論與結(jié)論

隨著人們對乳酸菌益生功能的深入認(rèn)識，越來越多乳酸菌被用于發(fā)酵乳制品、飲料、保健食品等，發(fā)酵乳制品作為益生菌的載體，能充分發(fā)揮乳酸菌的益生作用[13]。通過添加功能性成分制作發(fā)酵乳制品，如富含寡糖的乳制品有助于維持血脂健康，乳中添加維生素D、膠原蛋白肽、牛初乳堿性蛋白等開發(fā)減緩中老年人骨質(zhì)流失及骨質(zhì)疏松癥的功能性乳制品[14]。因此在發(fā)酵乳中添加具有降血糖功能的功能物質(zhì)，不僅增加發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)價值，也為糖尿病患者提供一種新型、有輔助治療疾病的乳制品。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率被認(rèn)為是研究體外降糖活性的間接指標(biāo)，兩種酶抑制劑通過延緩體內(nèi)碳水化合物的消化吸收，降低餐后血糖水平的升高，因此抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性在防治糖尿病方面有巨大潛力[15]。發(fā)酵駝乳中益生菌通過分泌蛋白水解酶水解駝乳中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的生物活性肽、活性因子等，對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有普遍抑制作用[16]。Ayyash[17]等比較了發(fā)酵駝乳和牛乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率均高于發(fā)酵牛乳與本試驗的研究結(jié)果相一致，學(xué)者們認(rèn)為有兩種原因：一是發(fā)酵使用的益生菌本身分離自駝奶，因此對駝奶有更高的適應(yīng)性；二是駝奶中富含的胰島素、降糖活性因子等高于牛乳，因此發(fā)酵駝乳與牛乳相比表現(xiàn)出較高的抑制率和抗氧化活性[18]。

抗氧化活性是發(fā)酵乳制品重要的營養(yǎng)特性，乳制品經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用生成各種生物活性肽，對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性產(chǎn)生積極影響[19]。Hamed等[20]研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌發(fā)酵駝乳可通過清除體內(nèi)自由基和抑制活性氧的積累來防止體內(nèi)的氧化損傷，提高機(jī)體的抗氧化活性。Patel等[21]用植物乳桿菌發(fā)酵駝乳測定發(fā)酵乳的抗氧化活性，在37 ℃發(fā)酵48 h后，發(fā)酵乳對羥自由基和超氧陰離子自由基清除率分別達(dá)到61.52%和52.26%。EI-Sayed等[22]以不同的乳酸菌發(fā)酵駝乳，測定發(fā)酵駝乳在儲藏期間的抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)與市售的商業(yè)發(fā)酵劑相比益生菌發(fā)酵駝乳具有更高的抗氧化活性，與本試驗的研究結(jié)果相一致，試驗組的自由基清除率顯著高于對照組，他們認(rèn)為發(fā)酵菌株的來源、數(shù)量、蛋白質(zhì)的水解活性等因素都會影響發(fā)酵乳的抗氧化活性。

本試驗通過乳明串珠菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵駝乳以α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵駝乳的參數(shù)條件，通過正交試驗得到發(fā)酵駝乳的最佳工藝參數(shù)為乳明串珠菌:副干酪乳桿菌比例2∶3、接種量2%、發(fā)酵溫度39 ℃，發(fā)酵時間24 h，在此條件下測得發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別達(dá)到87.20%和23.85 %，與未優(yōu)化前相比，α-淀粉酶的抑制率提高14.10%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高4.4%。在4 ℃儲藏期間發(fā)酵駝乳對α-淀粉酶抑制率在第6d時最高為90.39%，對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為36.32%，抑制率顯著高于對照組。對羥自由基、超氧陰離子自由基清除率最高達(dá)到94.91 %和78.10%，均顯著高于對照組（P＜0.05）。