第一例栽培種花生花藥培養(yǎng)單倍體植株的創(chuàng)制

謝永平，鄭運(yùn)歡，郭英鐸，陳肇聰

（汕頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 汕頭，515041）

花生（Arachis hypogaeaL.），是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物。目前花生特異種質(zhì)資源的匱乏成為其育種的瓶頸，因此種質(zhì)的創(chuàng)新工作成為花生育種中亟待解決的問題[1]。

花藥培養(yǎng)是20 世紀(jì)60 年代以來發(fā)展起來的一項生物技術(shù)，旨在誘導(dǎo)出單倍體花粉植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇，是把發(fā)育到一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)小孢子由正常的配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，而后通過愈傷組織或胚狀體再生單倍體植株的過程[2]?；ㄋ幣囵B(yǎng)對于基礎(chǔ)和育種研究都有重大意義，用雜種一代（F1）的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，育出的單倍體使染色體加倍，得到純合的個體，易于鑒定和選擇，省時省工，大大提高選種效率[3]。利用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用到28 科68 屬170 多種植物上，其中23 科52 屬約300 種高等植物的花藥培養(yǎng)獲得成功?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)在植物育種上具有縮短育種年限、提高育種效率、創(chuàng)建新種質(zhì)資源等優(yōu)點(diǎn)?；ㄉㄋ幣囵B(yǎng)研究最早報道始于1981 年，Bajaj 等用A.hypogaea和A.glabrata及A.villosa的單核后期的花藥為外植體，經(jīng)愈傷組織獲得少量再生植株[4]。國內(nèi)花生花藥培養(yǎng)研究始于20 世紀(jì)70 年代初，但一直處于條件摸索和優(yōu)化階段，袁美等較系統(tǒng)地研究了基本培養(yǎng)基、基因型和蔗糖濃度等因素在花生花藥愈傷組織誘導(dǎo)中的作用，以及幾種激素組合在誘導(dǎo)愈傷組織及分化形成體胚中的作用[5]；張景景等對不同發(fā)育時期的花藥進(jìn)行固體培養(yǎng)，對誘導(dǎo)愈傷和愈傷分化的培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選[6]；但兩項研究均未獲得完整再生植株。

本研究以栽培種花生為材料，在花生單倍體育種工作進(jìn)行前沿性探索試驗。自2017 年3 月開始，通過比較滅菌時間、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基和植株再生培養(yǎng)條件等試驗，篩選較為適合花生的花藥愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基、植株再生培養(yǎng)條件，同時，對再生植株進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，探討橋梁品種對再生植株創(chuàng)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用花生材料見表1。2017 年3 月，在汕頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所官塘基地種植F3株系50份，在汕頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所花生育種基地種植F1組合14個，共64 份材料；5 月選取健康花生植株摘取未開放花蕾，花蕾淡綠色，花蕾規(guī)格約0.5 cm～0.7 cm，約在小孢子單核靠邊期，每個株系（組合）取3～5 個花蕾。

表1 供試材料Table 1 Peanut materials used in the study

摘取花蕾次日，花蕾先用自來水沖洗20 min，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30 s，接著放入1%NaClO（每100 mL 消毒液加1～2 滴表面活性劑Twenn-20）中消毒，設(shè)置三個處理時間：分別為7 min、9 min、11 min，然后用無菌水沖洗5～6 次，最后置于滅菌濾紙上吸干表面水分，剪除萼片，將花藥塊從花蕾中擠壓出來，剔除花瓣、花柱。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

設(shè)置誘導(dǎo)培養(yǎng)基4 種，分別為B5D1、B3D1、B5N1、B3N1（表2），培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH 5.5～5.8。使用直徑5 cm 廣口玻璃瓶，每瓶倒入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基30 mL，經(jīng)高壓濕熱滅菌、冷凝后接入已經(jīng)消毒滅菌處理的花藥，溫度26±2℃黑暗培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計花藥的污染數(shù)、死亡數(shù)和愈傷組織數(shù)。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Tabel 2 Media for calli induction

愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織花藥數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%

1.3 愈傷組織分化培養(yǎng)

設(shè)置分化培養(yǎng)基3 種，分別為B5N1-1、B5N1-2、B5N1-3（表3），培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH 5.5～5.8。使用直徑5 cm 廣口玻璃瓶，每瓶倒入培養(yǎng)基30 mL，經(jīng)高壓濕熱滅菌、冷凝后接入嫩綠色的愈傷組織，置于溫度26±2℃、光照（2000 lux）8 h/d環(huán)境下培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計愈傷組織分化率。

表3 分化培養(yǎng)基Tabel 3 Media for shoot induction

愈傷組織分化率=（能分化出幼芽的愈傷組織塊數(shù)/轉(zhuǎn)移愈傷組織塊數(shù)）×100%

1.4 植株再生培養(yǎng)

將已分化出根、莖、葉的幼苗（高約4～6 cm，具有2～3 節(jié)間）接入CM 培養(yǎng)基、SG 培養(yǎng)基（表4，包含蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L，pH 5.5～5.8），置于溫度26±2℃、光照（2800 lux）10 h/d 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，15 d后記錄再生苗的根數(shù)和葉數(shù)、再生植株數(shù)量。

表4 再生苗培養(yǎng)基Tabel 4 Media for intact plant regeneration

再生苗率=（再生苗數(shù)/接種已分化出幼芽的愈傷組織塊數(shù)）×100%

再生植株率=（完整再生植株數(shù)/接種已分化出幼芽的愈傷組織塊數(shù)）×100%

1.5 煉苗移栽

2018 年9 月，將兩株再生植株（編號：15B8-6）帶玻璃瓶放入煉苗棚進(jìn)行自然光照培養(yǎng)30 d，株高約7～8 cm、莖基直徑約0.2 cm、根5條或以上的小苗洗凈晾干，置入1.5 寸（栽培基質(zhì)為細(xì)沙∶珍珠巖=1∶1）塑料杯中，28±2℃、75%遮蔭自然光下栽培。

2020 年10 月，以汕油121 為砧木、以再生植株（編號15B8-8）為接穗，嫁接部位為上胚軸，嫁接后用薄膜封閉并保持高濕度管理33 d，撤除薄膜煉苗15 d，嫁接成活后移植至田間，并搭建小拱棚覆蓋薄膜保溫栽培。

1.6 染色體鑒定方法

2020年11月，委托河南省作物分子育種研究院進(jìn)行花生花藥培養(yǎng)植株（編號：15B8-8）的染色體數(shù)目鑒定。

（1）花生根尖前處理：將根長1～1.5 cm 的主根及側(cè)根根尖，放置于2 mmol/L 8-羥基喹啉（配置方法：0.029 g 8-羥基喹啉加入100 mL蒸餾水）中25°C處理3 h；將根尖取出用乙醇-冰醋酸（3:1）固定液（配置方法：30 mL 乙醇:10 mL 冰醋酸）進(jìn)行固定，置于室溫下約6 h后置于-20°C冰箱保存約12 h。

（2）染色體制片：采用根尖壓片法。

（3）熒光原位雜交染色：花生A 和B 基因組特異探針[7]，A 基因組標(biāo)記綠色，B 基因組標(biāo)記紅色；利用A 和B 基因組特異探針對15B8-8 根尖染色體進(jìn)行熒光原位雜交染色。

（4）圖片獲取及分析：利用高分辨率熒光正置顯微鏡對雜交后片子照相，圖片處理和染色體分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時間對污染率、死亡率和誘導(dǎo)率的影響

花蕾經(jīng)過1% NaClO 消毒處理，花藥培養(yǎng)20 d后，出現(xiàn)三種情形：污染、死亡、誘導(dǎo)形成愈傷組織。由表5 可知，滅菌時間為7 min 時，污染率最高（11.5%）；消毒時間為9 min，死亡率降低、誘導(dǎo)率最高；消毒時間為11 min 時，污染率最低、死亡率最高、誘導(dǎo)率最低。因此，花藥的消毒時間對愈傷組織誘導(dǎo)率有著較大影響，綜合來看，1% NaClO 消毒時間9 min效果較好。

表5 外植體消毒時間對花藥污染率、死亡率和愈傷誘導(dǎo)率的影響Table 5 Effect of disinfection period on rate of contamination，death and calli induction of anthers

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

花藥經(jīng)過培養(yǎng)20 d 后（圖1A），統(tǒng)計愈傷組織數(shù)。由表6 可知，B5N1、B3N1 培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別達(dá)到81.3%、77.3%。因此B5N1、B3N1 培養(yǎng)基較B5D1、B3D1 培養(yǎng)基更適合花生花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)。

表6 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Table 6 Effect of induction media on rate of calli induction

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)（A）和幼芽形成（B）Fig.1 Calli induction(A)and shoot formation(B)

2.3 分化培養(yǎng)基對芽分化的影響

愈傷組織接入B5N1-1、B5N1-2、B5N1-3培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d 后調(diào)查分化率。由表7 可知，B5N1-2 培養(yǎng)基上的愈傷組織分化帶幼芽組織數(shù)量較多（圖1B），達(dá)到6個，分化率達(dá)4.26%，葉片和根形態(tài)更為明顯、完整，較為適合花生花藥愈傷組織再分化培養(yǎng)。

表7 分化培養(yǎng)基對分化率的影響Table 7 Effect of differation media on rate of shoot induction

2.4 再生培養(yǎng)基對再生苗生長的影響

將已分化出幼芽的愈傷組織塊接入CM 培養(yǎng)基、SG培養(yǎng)基15 d后，少數(shù)能繼續(xù)生根生葉，且根葉形態(tài)趨于正常（圖2）。由表8可知，兩種培養(yǎng)基上的再生苗根數(shù)、葉數(shù)差異很小，SG 培養(yǎng)基的再生苗全部出根，CM 培養(yǎng)基的再生苗出現(xiàn)了有葉無根的不良生長效果，因此，SG培養(yǎng)基比CM培養(yǎng)基更適合再生苗根葉生長。

圖2 再生植株生長情況Fig.2 Status of regenerated plants

表8 再生培養(yǎng)基對再生苗生長的影響Table 8 Effect of regeneration media on growth of shoots

2.5 外植體世代對再生植株創(chuàng)制的影響

由表9 可知，試驗共培養(yǎng)64 份材料，其中F1世代有14份，F(xiàn)3世代有50份材料。F1世代材料的愈傷組織誘導(dǎo)率為69.8%，芽分化率為2.27%，獲得再生苗1株，無再生植株，再生苗率和再生植株率分別為50%、0；F3世代材料的愈傷組織誘導(dǎo)率為70.7%，芽分化率為2.99%，獲得再生苗5 株、再生植株4 株，再生苗率和再生植株率分別為50%、40%。綜上所述，在愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化和再生苗方面，F(xiàn)1世代與F3世代之間差異很??；從F1世代只獲得1 株再生苗，與F3世代比較再生植株率，由于樣本太小存在較大誤差，不具備可比性。

表9 供體植株世代對再生植株創(chuàng)制的影響Table 9 Effect of generation of donor plants on establishment of plant regeneration

2.6 基因型對再生植株創(chuàng)制的影響

由表10 可知，試驗共有64 個株系（組合）進(jìn)行花藥培養(yǎng)，其中有23 個株系（組合）親本包含汕油52，愈傷組織誘導(dǎo)率69.2%、芽分化率5.56%，獲得再生苗5 株、再生植株4 株，再生苗率71.4%、再生植株率57.1%；另外，有41 個株系（組合）親本未包含汕油52，愈傷組織誘導(dǎo)率71.1%、芽分化率1.68%，獲得再生苗1 株、再生植株0 株，再生苗率20.0%、再生植株率為0。

表10 基因型對再生植株率的影響Table 10 Effect of genotype on rate of plant regeneration

由表11 可知，試驗獲得再生苗6 株，其中株系15B5-7、15B8-6、15B8-8 分別為1 株、2 株、2 株，組合16B13 為1 株；獲得再生植株4 株，15B8-6、15B8-8 等二個株系各2 株。其余株系（組合）的花藥愈傷組織均未出現(xiàn)分化。獲得再生苗的4個株系（組合）中3 個株系（組合）的親本包含汕油52；有2 個株系獲得再生植株，均為15B8 組合（粵油256/汕油52）F3世代株系，汕油52是父本。

表11 再生植株的統(tǒng)計Table 11 Description of regenerated plants

綜合對比可以發(fā)現(xiàn)，汕油52 花生品種，無論是作為父本、母本，世代數(shù)在F1、F3，都具有較強(qiáng)的花藥培養(yǎng)力。

2.7 移栽結(jié)果

2018 年移栽過程中，由于環(huán)境變化劇烈導(dǎo)致2株再生植株（編號15B8-6）死亡；2020 年嫁接成活后，1 株再生植株（編號15B8-8）成功移植田間栽培（圖3）。

圖3 再生苗的嫁接（A）、煉苗（B）和田間移植（C）Fig.3 Grafting(A),acclimation(B)and transplanting(C)of regeneration shoot

2.8 染色體鑒定結(jié)果

結(jié)果如圖4。依據(jù)熒光原位雜交染色結(jié)果可以看出，花生花藥培養(yǎng)材料染色體總數(shù)為20，A基因組（綠色）染色體條數(shù)為9，B基因組（紅色）染色體條數(shù)為11條?；ㄉ耘喾N染色體條數(shù)為40，與栽培種相比較來看，該材料為單倍體。

圖4 花藥單株的倍性鑒定FISH檢測圖：有絲分裂中期（A）和前期（B）Fig.4 Haploid identification of plants from anther culture by FISH:metaphase(A)and prophase(B)of mitosis

3 討論

Mroginski 和Ternandez 在1980 年曾報道用花藥培養(yǎng)得到兩個二倍體野生種幼苗，但在花生栽培種上尚未見成功的報道［8］。國內(nèi)有關(guān)花生花藥培養(yǎng)的報道極少，只有山東省花生研究所的袁美等與河北農(nóng)業(yè)大學(xué)的張景景等進(jìn)行過研究報道，但均未獲得完整再生植株[5，6]，2012 年以來，國內(nèi)未見花生花藥培養(yǎng)的報道。由此看來,由花生花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株十分困難[5]。

本研究中，花生花藥愈傷組織誘導(dǎo)率為56.0%～81.3%，愈傷組織分化率為1.42%～4.26%，再生苗率20.0%～100%，再生植株率0%～100%。綜合來看，1%NaClO 消毒滅菌時間9 min，誘導(dǎo)培養(yǎng)采用B5N1、B3N1 培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)采用B5N1-2 培養(yǎng)基，再生苗生長采用SG 培養(yǎng)基，從接種花藥到獲得再生植株，成功的概率為0.67%。

編號為15B8-8（F3）的再生植株，經(jīng)根尖染色體鑒定，具有9 條A 染色體、11 條B 染色體，而不是理論上的10 條A 染色體、10 條B 染色體，推測分裂期間可能進(jìn)行了染色體交換，確切原因尚有待進(jìn)一步探討。此外，由于完整再生植株數(shù)量極少，暫時沒有條件做其他染色體鑒定方法，待植株擴(kuò)繁足夠多，可以采用細(xì)胞流氏儀進(jìn)行倍性鑒定。

需要說明的是，本研究自2017 年3 月開始，進(jìn)行多次花生花藥培養(yǎng)，除了2017年春季試驗獲得完整再生植株，其他試驗均沒有獲得再生植株，花生花藥培養(yǎng)技術(shù)體系仍不完善，還需進(jìn)一步優(yōu)化。究其原因，一是后來的試驗取樣共50 朵花蕾左右，規(guī)模太?。欢钦n題組沒有專職試驗人員，無法長期堅持高強(qiáng)度研究；三是卡在最為關(guān)鍵的再分化培養(yǎng)環(huán)節(jié)。

在花藥培養(yǎng)力較強(qiáng)的基因型上，花藥培養(yǎng)方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括手續(xù)簡便、效率高和集約化等。某一特定的品種，它本身的花粉植株的誘導(dǎo)率并不高，但是當(dāng)它作為雜交親本之一時，雜種一代的花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率都相當(dāng)高，這樣的品種通常稱為花藥培養(yǎng)的“橋梁品種”[9]。

綜合對比可以發(fā)現(xiàn)，汕油52 花生品種，無論是作為父本、母本，世代數(shù)在F1、F3，都具有較強(qiáng)的花藥培養(yǎng)力，因為只有一次試驗，能否成為花生花藥培養(yǎng)的“橋梁品種”，尚有待進(jìn)一步探討。

移栽過程中，由于環(huán)境變化劇烈導(dǎo)致15B8-6的兩株完整再生植株死亡，未能開展后續(xù)研究。此后，課題組采用嫁接的方法，15B8-8 單倍體植株成功移栽在室外。

4 結(jié)論

此次研究在花生花藥培養(yǎng)方面取得突破性進(jìn)展，首次在花生學(xué)科領(lǐng)域花生栽培種上獲得單倍體植株，編號為15B8-8 的完整再生植株，經(jīng)根尖染色體鑒定，具有9 條A 染色體、11 條B 染色體，是第一例栽培種花生花藥培養(yǎng)單倍體植株。利用花藥培養(yǎng)單倍體植株構(gòu)建成的DH 群體，是遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和進(jìn)行QTL 定位等方面研究的理想群體，可以為花生基因定位和功能基因的發(fā)掘奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，為花生研究與育種提供了新的思路和途徑。

致謝：感謝山東花生研究所袁美博士在文章修改和倍性鑒定方面的指導(dǎo)、感謝汕頭大學(xué)鐘名其博士在培養(yǎng)基選擇方面的指導(dǎo)、感謝河南省作物分子育種研究院杜培博士在倍性鑒定方面的協(xié)助！