多囊卵巢綜合征患者腸道菌群分布特點(diǎn)及其與IR、內(nèi)分泌代謝失調(diào)的相關(guān)性研究

程麗琴，吳巧珠，謝海珊，張慧芬

中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院(深圳福田)婦科，廣東 深圳 518033

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種因內(nèi)分泌異常引起的婦科疾病，臨床上以排卵功能紊亂和高雄激素血癥為特征，多表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、痤瘡和多毛等，是導(dǎo)致育齡女性不孕不育的主要原因之一[1]。研究認(rèn)為，PCOS 是一種多基因遺傳疾病，其發(fā)病機(jī)制可能與代謝紊亂、炎癥和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[2]。腸道菌群是人體代謝系統(tǒng)的重要組成部分，有學(xué)者認(rèn)為腸道菌群失調(diào)會(huì)破壞腸道上皮細(xì)胞間的連接，增加腸壁黏膜通透性，使脂多糖進(jìn)入血液后，通過炎癥反應(yīng)誘發(fā)IR，影響卵泡發(fā)育，最終表現(xiàn)為PCOS[3-4]。當(dāng)前，國內(nèi)有關(guān)PCOS 患者腸道菌群分布的研究多集中在與臨床癥狀的關(guān)系方面，陳方元等[5]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者Bacteroides、Prevotella和Faecalibacteruim菌群相對豐度較健康人群顯著變化，并與患者的痤瘡皮損特征相關(guān)，有關(guān)其與患者內(nèi)分泌代謝失調(diào)的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究旨在分析PCOS患者的腸道菌群分布特點(diǎn)，探究其與IR、內(nèi)分泌代謝失調(diào)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年12月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院門診收治的PCOS患者40例納入觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床檢查符合PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)：排卵稀發(fā)或無排卵；超聲提示卵巢多囊改變(一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑為2～9 mm的卵泡數(shù)≥12 個(gè)，和/或卵巢體積≥10 mL)；雄激素的臨床表現(xiàn)和/或高雄激素血癥；以上條件中符合2 條，并排除其他疾病引起的排卵異常[6]。②患者年齡25～35 歲；③一般臨床資料完整；④患者知情同意，均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、重要臟器功能障礙患者；②合并慢性消耗性疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病患者；③合并急慢性胃腸炎、接受胃腸道手術(shù)患者；④近期存在類固醇激素、影響脂質(zhì)代謝或腸道菌群等藥物服用史患者；⑤處于哺乳期或妊娠期患者。另選取同期月經(jīng)規(guī)律的健康女性40例作為對照組。兩組受檢者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、收縮壓和舒張壓等一般臨床資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組受檢者的一般臨床資料比較(±s)

表1 兩組受檢者的一般臨床資料比較(±s)

注：1 mmHg=0.133 kPa。

組別觀察組對照組t值P值例數(shù)40 40年齡(歲)26.78±2.81 25.84±3.02 1.441 0.154 BMI(kg/m2)24.43±2.76 24.21±3.15 0.332 0.741 WHR 0.72±0.20 0.74±0.23 0.415 0.679收縮壓(mmHg)112.63±10.26 109.25±8.67 1.591 0.116舒張壓(mmHg)76.48±9.24 75.61±6.37 0.490 0.625

1.2 研究方法

1.2.1 IR 檢測 取受試者空腹靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min后分離血清。采用免疫分析系統(tǒng)(UniCel DxI 800，美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測空腹胰島素(fast insulin，F(xiàn)INS)水平，全自動(dòng)生化分析儀(Modular P800，瑞士羅氏有限公司)檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平，據(jù)此計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(Homa-Insulin resistance，Homa-IR)。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5，以HOMA-IR≥2.5為IR[7]。

1.2.2 內(nèi)分泌代謝指標(biāo)檢測 取受試者血液標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化分析儀(Modular P800，瑞士羅氏有限公司)檢測內(nèi)分泌學(xué)和代謝指標(biāo)。其中內(nèi)分泌學(xué)指標(biāo)包括：雌激素(estrogen，E2)、睪酮(testosterone，T)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)；代謝指標(biāo)包括：FPG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.2.3 腸道菌群分布特點(diǎn)分析 ①樣本DNA 提取及PCR 擴(kuò)增：取受檢者清晨自然排出的新鮮糞便(約300 mg)為研究標(biāo)本，采用糞便DNA 提取試劑盒(Qubit?dsDNA HS Assay Kit)提取糞便樣本中的細(xì)菌基因組DNA，檢測DNA 濃度并調(diào)整至10 ng/μL。根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)V3區(qū)通用引物，引物序列為上游引物：5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'；下游引物：5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'。采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳法(PCR-DGGE)進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性5 s，57℃退火90 s，72℃延伸10 s(24 cycles)，產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。②生物信息學(xué)分析：I-sanger 線上平臺(tái)(www.i-sanger.com，上海美吉生物醫(yī)藥)完成生物信息學(xué)分析。上機(jī)對測序所得的序列進(jìn)行篩選、拼接、嵌合體序列清除后，所得結(jié)果用于操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)的聚類分析。VSEARCH(1.9.6)軟件行聚類分析，比對Silva 32數(shù)據(jù)庫；檢出OTU數(shù)和Shannon 指數(shù)用以表示菌群的Alpha指數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組受檢者的腸道菌群分布特點(diǎn)；②比較兩組受檢者的胰島素指標(biāo)、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)；③分析腸道菌群分布與IR、內(nèi)分泌代謝失調(diào)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較行χ2檢驗(yàn)；菌群豐度的組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；采用Spearman 法分析PCOS 患者腸道菌群和IR、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的胰島素指標(biāo)、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)水平比較 觀察組患者的FINS、HOMA-IR、T、LH、TG和LDL-C 水平均高于對照組，E2、FSH、TC水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩組的FPG、HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 兩組受檢者的胰島素指標(biāo)、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)水平比較(±s)

表2 兩組受檢者的胰島素指標(biāo)、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)水平比較(±s)

指標(biāo)FINS(mIU/L)HOMA-IR E2(pmol/mL)T(nmol/L)FSH(IU/L)LH(IU/L)FPG(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)觀察組(n=40)9.64±2.03 2.10±0.61 178.63±43.29 1.28±0.38 5.73±0.93 7.21±2.14 4.89±0.96 2.03±0.58 1.67±0.55 2.06±0.41 2.41±0.39對照組(n=40)6.67±1.89 1.54±0.39 243.46±35.58 0.67±0.21 6.42±1.07 3.26±0.43 5.21±1.18 3.89±0.61 0.81±0.25 2.18±0.37 1.62±0.75 t值6.772 4.892 7.317 8.984 2.097 11.445 1.330 13.976 9.003 1.374 5.911 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.039 0.001 0.187 0.001 0.001 0.173 0.001

2.2 兩組受檢者腸道菌群OTU的Venn圖分析 兩組受檢者腸道菌群經(jīng)聚類分析后共得到OTU代表序列298個(gè)。其中，觀察組特有OTU序列48個(gè)，對照組特有OTU序列72個(gè)，兩組共有OTU序列89個(gè)，見圖1。

圖1 兩組受檢者腸道菌群OTU的Venn圖

2.3 兩組受檢者的腸道菌群多樣性 Alpha 多樣性分析結(jié)果顯示，觀察組患者的OTU 總數(shù)、Shannon 指數(shù)明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 腸道菌群多樣性分析

2.4 兩組受檢者的腸道菌群組成比較 觀察組患者門水平上厚壁菌門的相對豐度高于對照組，擬桿菌門的相對豐度低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩組的變形菌門相對豐度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。觀察組屬水平上布勞特菌屬、擬桿菌屬和糞便桿菌屬的相對豐度低于對照組，霍氏真桿菌高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩組的埃希菌-志賀菌屬相對豐度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表3 兩組受檢者門水平上腸道菌群相對豐度比較(±s)

表3 兩組受檢者門水平上腸道菌群相對豐度比較(±s)

組別觀察組對照組Z值P值例數(shù)40 40厚壁菌門0.41±0.12 0.37±0.08 2.193 0.031擬桿菌門0.52±0.11 0.78±0.13 9.656 0.001變形菌門0.08±0.03 0.07±0.02 1.754 0.083

表4 兩組受檢者屬水平上腸道菌群相對豐度比較(±s)

表4 兩組受檢者屬水平上腸道菌群相對豐度比較(±s)

組別觀察組對照組Z值P值例數(shù)40 40布勞特菌屬0.13±0.04 0.28±0.07 11.769 0.001擬桿菌屬0.35±0.09 0.63±0.12 11.806 0.001霍氏真桿菌0.16±0.03 0.12±0.04 5.060 0.001糞便桿菌屬0.15±0.06 0.26±0.08 6.957 0.001埃希菌-志賀菌屬0.13±0.04 0.15±0.05 1.975 0.052

2.5 PCOS 患者屬水平腸道菌群與IR、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，擬桿菌屬與HOMA-IR、T、LH、TG呈正相關(guān)，與E2、TC呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；糞便桿菌屬與E2、TC呈正相關(guān)，與HOMA-IR、T、LH、TG呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，見表5。

表5 PCOS患者屬水平腸道菌群與IR、內(nèi)分泌代謝指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

PCOS 作為一種復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，與慢性炎癥反應(yīng)、IR 等密切相關(guān)，而腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、IR 發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[8-9]。羅瓊秀等[10]分析了不同BMI 的PCOS 患者的腸道菌群分布特征，發(fā)現(xiàn)PCOS患者存在腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，且BMI≥25 kg/m2的患者，其腸道菌群與炎癥狀態(tài)、IR密切相關(guān)。但目前就PCOS患者腸道菌群分布特征與內(nèi)分泌代謝失調(diào)的相關(guān)性臨床分析仍較少。

本研究對比了PCOS患者與健康女性的腸道菌群分布特征、胰島素指標(biāo)和內(nèi)分泌代謝指標(biāo)的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，觀察組的FINS、HOMA-IR、T、LH、TG 和LDL-C 水平高于對照組，E2、FSH、TC 水平低于對照組，與既往研究[11]結(jié)果一致，提示PCOS 患者存在IR 和內(nèi)分泌代謝失調(diào)的現(xiàn)象，內(nèi)分泌代謝失調(diào)和IR 可能影響PCOS 發(fā)生發(fā)展過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者與健康人群之間的腸道菌群分布存在差異，腸道菌群的物種豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性(α多樣性)與PCOS 有關(guān)，特定菌群豐度的改變，會(huì)使機(jī)體處于慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，影響屏障完整性與免疫力，從而促進(jìn)PCOS 的發(fā)生發(fā)展[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患者的OTU總數(shù)、Shannon指數(shù)明顯低于對照組，且觀察組患者厚壁菌門的相對豐度較對照組升高，擬桿菌門相對豐度較對照組下降。厚壁菌門和擬桿菌門是影響能量代謝平衡的主要菌群，兩者占腸道菌群的50%～75%。安潔等[13]分析了PCOS患者與健康人群腸道菌群的差異性，也發(fā)現(xiàn)PCOS 患者腸道菌群門水平上厚壁菌門的序列數(shù)更高，擬桿菌門序列數(shù)更低，認(rèn)為厚壁菌門和擬桿菌門比例與機(jī)體糖脂代謝異常有關(guān)。PCOS患者多合并肥胖、糖脂代謝紊亂等現(xiàn)象，雄激素水平偏高，而雄激素過多會(huì)導(dǎo)致患者腸道微生物種類發(fā)生改變，進(jìn)而影響厚壁菌門、擬桿菌門相關(guān)細(xì)菌的豐度[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組布勞特菌屬、擬桿菌屬和糞便桿菌屬的相對豐度低于對照組，霍氏真桿菌高于對照組；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，擬桿菌屬、糞便桿菌屬與HOMA-IR、T、LH、TG、E2、TC等內(nèi)分泌代謝指標(biāo)呈正(負(fù))相關(guān)，進(jìn)一步表明PCOS患者存在腸道菌失調(diào)情況，并與PCOS患者的IR、內(nèi)分泌代謝失調(diào)存在密切相關(guān)性。ANNA等[15]研究了腸道微生物對心臟代謝紊亂的影響，發(fā)現(xiàn)主要以厚壁菌門(49.26%)和擬桿菌門(44.46%)為主，而總膽固醇升高者腸道擬桿菌屬、糞桿菌屬豐度明顯降低，認(rèn)為擬桿菌屬主要通過其在脂質(zhì)代謝中的作用影響心臟代謝紊亂。PCOS患者的擬桿菌屬相關(guān)細(xì)菌豐度升高、糞便桿菌屬相關(guān)細(xì)菌豐度下降，可能影響短鏈脂肪酸水平，從而導(dǎo)致內(nèi)分泌激素水平發(fā)生變化[16]。此外，腸道菌群失調(diào)引發(fā)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對胰島素敏感性降低，使血清胰島素水平升高，從而導(dǎo)致HOMA-IR升高。因此，臨床或可考慮將調(diào)節(jié)擬桿菌屬、糞便桿菌屬豐度作為治療和緩解PCOS臨床癥狀的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，PCOS患者存在腸道菌失調(diào)情況，腸道菌群紊亂可能會(huì)加劇PCOS 患者IR 和內(nèi)分泌代謝失調(diào)。本研究納入對象較少，未排除PCOS 患者中肥胖個(gè)體，未進(jìn)一步對不同BMI患者的腸道菌群分布特點(diǎn)進(jìn)行分析，也未分析腸道菌群功能特征，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量，探討腸道菌群對PCOS 患者腸道菌群相關(guān)信號(hào)通路及代謝途徑的影響。