玉米S1Fa-like 轉(zhuǎn)錄因子基因家族的鑒定與表達(dá)分析

趙東波，高建勝，郭建軍，李擁軍，薛 鑫，郭良海

（1.德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東 德州 253015;2.德州學(xué)院,山東 德州 253023）

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)激活或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的非生物脅迫耐受性。轉(zhuǎn)錄因子S1Fa 最早從菠菜中發(fā)現(xiàn)，是含有70 個(gè)氨基酸的小肽，負(fù)調(diào)控rps1 表達(dá)，其保守結(jié)構(gòu)域包含核定位信號(hào)和特定的DNA 結(jié)合位點(diǎn)，在雙子葉植物和單子葉植物之間高度保守，主要在根和黃化幼苗等組織中表達(dá)。S1Fa-like TFs（transcription factors）的數(shù)量在不同的植物種類中差異很大。大多數(shù)植物不超過(guò)5 個(gè)S1Fa-like 家族成員；然而花生基因組中含有126 個(gè)S1Fa-like 轉(zhuǎn)錄因子，且被鑒定為膜結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，S1Fa-lik TFs 響應(yīng)植物的非生物脅迫，如甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）中S1Fa-like響應(yīng)鹽脅迫刺激；棉花（Gossypium hirsutum）中S1FalikeTFs 大多數(shù)成員受非生物脅迫刺激表達(dá)量下調(diào)；楊樹(shù)（Populus trichocarpa）中PtS1Fa1 和PtS1Fa2 的表達(dá)受到干旱和鹽脅迫的抑制，且響應(yīng)ABA、MeJA、SA等激素刺激，其中PtS1Fa2 通過(guò)增加抗氧化劑活性，減少活性氧（ROS）積累，進(jìn)而增強(qiáng)楊樹(shù)的耐旱性。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必須應(yīng)對(duì)非生物脅迫，如土壤鹽度、干旱和極端溫度。然而，關(guān)于玉米S1Fa-like TFs 生物信息學(xué)、組織表達(dá)及脅迫調(diào)控表達(dá)模式的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)方法，分析玉米S1Fa-like TFs 基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、蛋白理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系及組織表達(dá)和脅迫表達(dá)模式，通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)玉米S1Fa-like TFs 受熱脅迫時(shí)的表達(dá)量，為深入解析玉米S1Fa-like TFs在響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因家族的鑒定、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

從PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）查詢S1Fa-like TFs 成員，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）對(duì)得到的蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。利用Expasy 中的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/)工具獲取蛋白質(zhì)理化性質(zhì)信息，Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析。

1.2 家族蛋白進(jìn)化和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

通過(guò)PlantTFDB 獲取單子葉植物（大麥、玉米、秈稻、粳稻、高粱、小麥、烏拉爾小麥）和雙子葉植物（獼猴桃、擬南芥、油菜、大豆、棉花、楊樹(shù)、菠菜）共14 種作物的S1Fa-like TFs 蛋白序列，利用MEGA7.0軟件中最大似然法（Maximum Likelihood，bootstrap=1000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用在線網(wǎng)站SOMPA（http://www.prabi.fr/）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 保守基序、基因結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)子分析

利用在線工具M(jìn)EME（http://memesuite.org/）對(duì)家族蛋白進(jìn)行motif 分析，預(yù)測(cè)基因家族成員的保守結(jié) 構(gòu) 域。使 用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線預(yù)測(cè)ZmS1Fas啟動(dòng)子區(qū)域(ATG 上游2 000 bp)順式調(diào)控元件。

1.4 基因組織表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

從MaizeGDB qTeller 數(shù)據(jù)庫(kù)下載正常組織部位的表達(dá)數(shù)據(jù)（登錄號(hào)PMC5808982），NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載受干旱脅迫根部位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號(hào)SRP052697）和不同玉米材料苗期受溫度脅迫地上部位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號(hào)SRP106663），利用TBtools軟件中HeatMap 進(jìn)行可視化處理。

1.5 qRT-PCR 檢測(cè)基因家族成員熱脅迫表達(dá)量

玉米自交系B73 和Oh43 材料，在16/8 h 光照培養(yǎng)室長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)至3 葉期（14 d）。玉米苗被置于42 ℃培養(yǎng)箱中處理4 h，對(duì)照則正常條件培養(yǎng)，每個(gè)樣本處理6 株幼苗。收集幼苗地上部分，液氮中研磨，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄之后以ZmActin1 為內(nèi)參，檢測(cè)ZmS1Fas 脅迫處理前后的相對(duì)表達(dá)量，并采用GraphPad Prism 軟件作圖。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR 引物

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmS1Fas 的鑒定、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位分析及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從PlantTFDB 獲取S1Fa-like 家族成員蛋白序列，經(jīng)Pfam 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖1-C），家族成員均含有S1FA 或S1FA superfamily 保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)染色體位置命名為ZmS1Fa1、ZmS1Fa2（圖2），ZmS1Fa1位于2 號(hào)染色體、ZmS1Fa2 位于10 號(hào)染色體。ZmS1Fas 共編碼5 個(gè)蛋白（4 種不同蛋白，表2），蛋白長(zhǎng)度為56～80 個(gè)氨基酸；分子量在6 310.77～8 867.10 Da 之間；等電點(diǎn)在9.82～10.25 之間，均為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)在33.18～37.49 之間，均小于40，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)在101.00～105.27 之間，具有良好的熱穩(wěn)定性；親水性系數(shù)在-0.049～0.070 之間，表明ZmS1Fas 家族成員親水性氨基酸和疏水性氨基酸基本持平；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ZmS1Fas 家族成員均定位在細(xì)胞核內(nèi)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明（表3），其α-螺旋、延長(zhǎng)鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在ZmS1Fas 基因家族成員中均有分布且占比差別不大。

圖1 ZmS1Fas 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（A）、保守基序（B）、保守結(jié)構(gòu)域（C）和基因結(jié)構(gòu)（D）

圖2 ZmS1Fas 基因染色體定位

表2 ZmS1Fas 蛋白理化性質(zhì)

表3 ZmS1Fas 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 ZmS1Fas 系統(tǒng)進(jìn)化、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

將單子葉和雙子葉植物共14 種作物的51 個(gè)S1Fa-like 蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，單子葉植物與雙子葉植物被分開(kāi)，說(shuō)明S1Fa-like 家族快速擴(kuò)增可能發(fā)生在單子葉植物與雙子葉植物分化之前。ZmS1Fas 和高粱S1Fa-like 家族成員具有較高的親緣關(guān)系。對(duì)ZmS1Fas 蛋白進(jìn)行motif 分析，結(jié)果（圖1-B）顯示：ZmS1Fas 保守基序較簡(jiǎn)單，均含有motif1（含50 個(gè)氨基酸），占ZmS1Fas 蛋白長(zhǎng)度的62.5%～89.3%，推測(cè)其為ZmS1Fas 基因家族成員的核心功能區(qū)域。ZmS1Fas 的基因結(jié)構(gòu)相對(duì)保守（圖1-D），均含有1～2 段外顯子，0～1 段內(nèi)含子，且均具有5'UTR 和3'UTR。

圖3 S1Fa-like 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 ZmS1Fas 順式作用元件分析

檢索ZmS1Fas 啟動(dòng)子上已知的激素和脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，結(jié)果顯示（圖4），ZmS1Fas 啟動(dòng)子區(qū)域含有豐富的激素（脫落酸、水楊酸、乙烯、茉莉酸、茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素、赤霉素等）和脅迫（如高溫、低溫、干旱、厭氧、損傷等）相關(guān)的響應(yīng)元件。尤其脫落酸響應(yīng)元件，ZmS1Fas 成員平均含有13.2 個(gè)；其次是茉莉酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，平均含有8.6 個(gè)。干旱響應(yīng)元件也很豐富，在ZmS1Fa1.1、ZmS1Fa1.2和ZmS1Fa2.3 的啟動(dòng)子區(qū)均含有10 個(gè)以上。

圖4 ZmS1Fas 啟動(dòng)子區(qū)域激素和脅迫相關(guān)順式作用元件的分布

2.4 ZmS1Fas 基因組織表達(dá)和脅迫表達(dá)分析

由圖5 可知，正常條件下，除B73 成熟花粉（B73 Mature Pollen），各組織均有ZmS1Fas 基因表達(dá)，且多數(shù)組織中ZmS1Fa2 的表達(dá)量均比ZmS1Fa1的表達(dá)量高。授粉12 d 的胚乳（Endosperm 12 DAP）中ZmS1Fa 基因的表達(dá)量均高于其他組織部位中的表達(dá)量，B73 成熟花粉中表達(dá)量均低于其他部位的表達(dá)量。ZmS1Fa2 在根皮層、授粉27 d 的果皮、6～7節(jié)間、花絲等部位表達(dá)量也較高。

圖5 正常條件下ZmS1Fas 表達(dá)模式分析

由組織表達(dá)模式可知，在根部位ZmS1Fas 表達(dá)量較高，選取根部位干旱脅迫表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示（圖6），受干旱脅迫，其ZmS1Fas 轉(zhuǎn)錄水平并未達(dá)到顯著上調(diào)或下調(diào)，推測(cè)ZmS1Fas 轉(zhuǎn)錄因子家族可能在蛋白質(zhì)水平響應(yīng)干旱脅迫。

圖6 受干旱脅迫ZmS1Fas 在根部位的表達(dá)

由圖7 可知，自交系Oh43 和雜交種Oh43×B73受高溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著上調(diào)表達(dá)；自交系PH207 受低溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著下調(diào)表達(dá)。不同玉米材料中，ZmS1Fas 響應(yīng)溫度脅迫模式不同，為選育耐高溫或低溫的玉米種質(zhì)提供了理論支持，為玉米遺傳改良提供潛在的基因資源。

圖7 不同玉米材料受溫度脅迫ZmS1Fas 的表達(dá)

2.5 ZmS1Fas 熱調(diào)控表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步明確ZmS1Fas 基因熱脅迫表達(dá)模式，以ZmActin1 為內(nèi)參，檢測(cè)自交系B73 和Oh43 熱脅迫表達(dá)量。設(shè)置正常條件下基因的相對(duì)表達(dá)量（CK）為1，結(jié)果（圖8）表明，ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 在B73中均受熱脅迫輕微下調(diào)表達(dá)；而在Oh43 中受熱脅迫顯著上調(diào)表達(dá)，受熱脅迫處理材料中ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 表達(dá)量約是正常生長(zhǎng)材料表達(dá)量的2 倍。與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，不同材料中ZmS1Fas 基因響應(yīng)熱脅迫模式不一致。筆者推測(cè)ZmS1Fas 在玉米響應(yīng)非生物脅迫方面具有潛在的功能。

圖8 熱脅迫條件下ZmS1Fas 的相對(duì)表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

目前，玉米中許多逆境脅迫相關(guān)基因家族已經(jīng)被鑒定和分析，如VOZ、GATA等基因，而關(guān)于S1Fa 基因的研究少之又少。本研究在玉米中共鑒定到2 個(gè)ZmS1Fas 基因，均含有S1FA 或S1FA superfamily 保守結(jié)構(gòu)域，共編碼5 個(gè)蛋白，長(zhǎng)度為56～80 個(gè)氨基酸；分子量在6 310.77～8 867.10 Da 之間；均為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，屬于穩(wěn)定蛋白，具有良好的熱穩(wěn)定性；α-螺旋、延長(zhǎng)鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)占比差別不大。ZmS1Fas 蛋白均定位在細(xì)胞核內(nèi)。將大麥、玉米、秈稻、粳稻、高粱、小麥、烏拉爾小麥、獼猴桃、擬南芥、油菜、大豆、棉花、楊樹(shù)、菠菜等14 種作物的51 個(gè)S1Fa-like 蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)單子葉植物和雙子葉植物的S1Fa-like 蛋白具有高度保守性。ZmS1Fas 保守序列較簡(jiǎn)單，motif1 是ZmS1Fas基因家族成員的核心功能區(qū)域。ZmS1Fas 均含有1～2 段外顯子，0～1 段內(nèi)含子，且均具有5'UTR 和3'UTR。ZmS1Fas 啟動(dòng)子區(qū)域含有豐富的與激素響應(yīng)和非生物脅迫相關(guān)的調(diào)控元件。筆者推測(cè)S1Fa 轉(zhuǎn)錄因子作用元件可能參與植物逆境脅迫的響應(yīng)，有利于植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

在正常生長(zhǎng)條件下，除B73 成熟花粉(B73 Mature Pollen)，各組織均有ZmS1Fas 基因表達(dá)，且多數(shù)組織中ZmS1Fa2 的表達(dá)量均比ZmS1Fa1 的表達(dá)量高。受到干旱脅迫時(shí)，ZmS1Fas 在轉(zhuǎn)錄水平與正常生長(zhǎng)材料中表達(dá)量差異不顯著。自交系Oh43 和雜交種Oh43×B73 受高溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著上調(diào)表達(dá)；自交系PH207 受低溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著下調(diào)表達(dá)。qRT-PCR 檢測(cè)了熱脅迫時(shí)ZmS1Fas 基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 在B73中均受熱脅迫輕微下調(diào)表達(dá)；而在Oh43 中受熱脅迫顯著上調(diào)表達(dá)，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的“ 不同玉米材料中ZmS1Fas 響應(yīng)溫度脅迫模式不同” 結(jié)果一致。這表明S1Fa 基因在復(fù)制后有可能發(fā)生功能分化，從而導(dǎo)致S1Fa 基因的功能多樣性，促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)調(diào)控和對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)，為進(jìn)一步解析ZmS1Fas在響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。