苔蘚植物醇提液對細菌的體外抑菌作用

張 春，駱 強，馮 圖

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700）

苔蘚植物(Bryophytes)喜歡陰暗潮濕的環(huán)境，通常生長在裸露的石壁、潮濕的森林和沼澤等地。[1]苔蘚植物即使在含有大量微生物的土壤或腐殖質(zhì)上生長，也不容易被細菌或真菌感染[2]。研究表明，苔蘚植物通過次生代謝可以產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、黃酮類、脂肪酸以及一些生物活性物質(zhì)，是潛在的天然活性產(chǎn)物寶庫[3]。目前，已有多種苔蘚植物被證明具有抑制微生物活性的作用[4]，博雷克（Borelc）等研究了地衣的抑菌物質(zhì)[5]。巴茲爾（Basilea）等從4種苔蘚植物中提取出牡荊葡基黃酮和黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物對8種細菌有較強的抗菌性[6]。范·霍夫（Van Hoof）研究了20種苔蘚植物提取液抗細菌和抗真菌活性[7]。沙偉等利用濾紙片法對9種苔蘚植物抑菌能力進行研究，發(fā)現(xiàn)9種苔蘚植物中多數(shù)種類對目的菌株具有一定的抑制作用[8]。沙偉還對16種苔蘚植物對植物病原菌的抑菌性進行了研究[9]，表明多數(shù)苔蘚植物提取物對4種植物病原菌的生長表現(xiàn)出抑制作用。程輝彩[10]等研究了24種蘚類的乙醇提取物對病原真菌的抑制作用，陳錫雄[11]等對尖葉提燈蘚的抑菌性進行了初步研究，吳昆對貴州省4種蘚類植物抑菌性做了比較[12]。全世界苔蘚植物約23000種，現(xiàn)已研究了抑菌性的苔蘚植物種類還非常少，對苔蘚植物抑菌性的研究還有很大的空間。

本研究通過對8種苔蘚植物的抑菌性實驗，探究苔蘚植物不同種之間抑菌性的差異，從而為苔蘚植物的種間差異、資源保護和篩選藥用苔蘚植物及進一步開發(fā)利用等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

11種供試細菌為：表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、銅綠假單孢菌（Pseudomonas aerugi-nosa）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi-B），均來源于上海魯微科技公司。

供試材料為8種苔蘚植物，詳見表1。

表1 標本名稱及采集地點

1.2 研究方法

1.2.1 供試樣品處理

苔蘚植物提取液制備：從野外采集全株苔蘚植物樣品，反復(fù)用自來水沖洗，然后用去離子水清洗3次，放入烘箱中，50℃恒溫條件下烘干24小時，用電動粉碎機將苔蘚植物體粉碎。取樣品粉末2.0g，置于具橡膠塞的三角瓶中，加無水乙醇20ml，搖床上振蕩提取20h，以1500 r/min離心10min，收集上清液，將殘渣再用無水乙醇重復(fù)提取2次，方法同上。合并3次的提取液于小燒杯中，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

根據(jù)實驗所需培養(yǎng)基類型配置液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配置：蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，將稱好的藥品置于燒杯中，加入少量蒸餾水，用玻璃棒攪拌，加熱溶解，待全部藥品溶解后，加水至所需體積1000mL，利用0.5mol/L NaOH將pH調(diào)制7.2～7.4，之后過濾、分裝、滅菌，最后將配置好的培養(yǎng)基放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。固體培養(yǎng)基的配置是蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂粉15g，除無需過濾外，其余步驟同液體培養(yǎng)基制備。

1.2.3 菌懸液的制備

取供試細菌菌株，用接種環(huán)各取菌苔少許接種至牛肉膏、蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h活化，然后將活化后的菌株接一環(huán)于5mL液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器中37℃下培養(yǎng)6～8h，即制成菌懸液。

1.2.4 濾紙片法測定抑菌作用

取直徑12mm的滅菌濾紙片放入上述苔蘚植物提取液中浸泡過夜，將菌懸液各取0.5 mL與相應(yīng)的固體培養(yǎng)基制成含菌平板，用無菌鑷子取含浸出液的濾紙片貼在含菌平板上，每皿貼4片，每菌做3次重復(fù)，且用無水乙醇浸泡濾紙片作空白對照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標卡尺以十字交叉法測定抑菌圈直徑[13]。

1.2.5 實驗數(shù)據(jù)處理

由于8種苔蘚植物抑菌活性物質(zhì)均用無水乙醇提取，無水乙醇的抑菌直徑均值為對照組。采用系統(tǒng)聚類法首先將各樣本看成一類，有抑菌性記為1，無抑菌性記為0，使用IBM SPSS Statistics 23分析軟件對數(shù)據(jù)進行整理和分析，利用歐式距離計算樣品間距離，用最短距離法計算類群間距離，按系統(tǒng)聚類分析方法對其進行聚類分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單種苔蘚植物醇提液抑菌性分析

首先比較苔蘚植物抑菌圈直徑與對照組無水乙醇抑菌圈直徑，大于無水乙醇抑菌圈直徑的為有抑菌性，小于等于無水乙醇抑菌圈直徑的視為無抑菌性，有抑菌性的苔蘚植物，其抑菌圈直徑再與對照組無水乙醇抑菌圈直徑做獨立樣本t檢驗，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。結(jié)果見表2。

表2 8種苔蘚植物提取液對11種細菌抑菌圈直徑/mm

從表2可見，金發(fā)蘚、泥炭蘚、粗葉青毛蘚、節(jié)莖曲柄蘚和檜葉白發(fā)蘚醇提液有較強的抑菌廣泛性，金發(fā)蘚醇提液能有效抑制除枯草芽孢桿菌外的10種供試細菌，且對乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性與對照組相比有極顯著差異，對銅綠假單孢菌、化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌的抑菌性與對照組相比有顯著差異。泥炭蘚醇提液能有效抑制除副溶血性弧菌和白色葡萄球菌外的9種供試細菌，其中對銅綠假單孢菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌性與對照組相比有極顯著差異，對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌的抑菌性與對照組相比有顯著差異。粗葉青毛蘚醇提液能有效抑制除銅綠假單孢菌和大腸桿菌外的9種供試細菌，其中對乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌性與對照組相比有極顯著差異，對化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌的抑菌性與對照組相比有顯著差異。節(jié)莖曲柄蘚醇提液和檜葉白發(fā)蘚醇提液對副溶血性弧菌、白色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌無抑菌性，對其余8種供試細菌均有抑菌性。其中節(jié)莖曲柄蘚對乙型副傷寒沙門氏菌抑菌作用與對照組相比有極顯著差異，對銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性與對照組相比有顯著差異，檜葉白發(fā)蘚對乙型副傷寒沙門氏菌抑菌作用與對照組相比有顯著差異。

克什米爾曲尾蘚醇提液、尖葉扭口蘚醇提液和卵葉泥炭蘚醇提液分別對6種供試細菌有抑菌作用，克什米爾曲尾蘚醇提液對銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌有抑菌作用，其中對乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌性與對照組相比有極顯著差異，對化膿性鏈球菌的抑菌性與對照組相比有顯著差異。尖葉扭口蘚對表皮葡萄球菌、銅綠假單孢菌、肺炎克雷伯氏菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌具有抑菌作用，且對銅綠假單孢菌和乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌作用與對照組相比有顯著差異。卵葉泥炭蘚醇提液對表皮葡萄球菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌有抑菌作用，且對化膿性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌抑菌作用與對照組相比有極顯著差異，對傷寒沙門氏菌的抑菌作用與對照組相比有顯著差異。

2.2 單種細菌中不同苔蘚植物抑菌性分析

對8種苔蘚植物醇提液的抑菌性效果進行了獨立樣本t檢驗，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。在銅綠假單孢菌、傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌三種細菌中，苔蘚植物的抑菌作用表現(xiàn)出差異性，銅綠假單孢菌中泥炭蘚醇提液與克什米爾曲尾蘚醇提液、檜葉白發(fā)蘚醇提液、卵葉泥炭蘚醇提液的抑菌作用相比有顯著差異。傷寒沙門氏菌中泥炭蘚醇提液與檜葉白發(fā)蘚醇提液的抑菌作用相比有極顯著差異。乙型副傷寒沙門氏菌中克什米爾曲尾蘚醇提液、泥炭蘚醇提液、卵葉泥炭蘚醇提液與節(jié)莖曲柄蘚醇提液、檜葉白發(fā)蘚醇提液、尖葉扭口蘚醇提液抑菌作用相比有顯著差異。其余菌種中8種苔蘚植物醇提液抑菌性比較無差異。門氏菌抑菌性O(shè)：泥炭蘚醇提液對乙型副傷寒沙門氏菌抑菌性P：檜葉白發(fā)蘚醇提液對表皮葡萄球菌抑菌性

圖1 部分苔蘚植物抑菌活性照片

2.3 聚類分析

從聚類圖可見，T=2時，節(jié)莖曲柄蘚和檜葉白發(fā)蘚聚為一類，說明兩種苔蘚醇提液抑菌性具有極大的相似性。T=11時，克什米爾曲尾蘚和卵葉泥炭蘚聚為一類，T=13時，節(jié)莖曲柄蘚、檜葉白發(fā)蘚、金發(fā)蘚和泥炭蘚聚為一類，兩大類在T=16時聚為一類。尖葉扭口蘚和粗葉青毛蘚分別在T=23和T=25時與其他苔蘚聚為一類，說明在兩種苔蘚醇提液的抑菌性與其他6種苔蘚植物醇提液抑菌性有明顯差異。

圖2 8種苔蘚植物抑菌作用聚類圖

3 討論和結(jié)論

實驗結(jié)果表明，8種苔蘚植物均有廣泛的抑菌作用。通過對抑菌作用的比較發(fā)現(xiàn)，已明確有藥用功效的泥炭蘚醇提液和金發(fā)蘚醇提液對11種細菌的抑菌效果總體要強于其余6種苔蘚植物醇提液的抑菌效果。本實驗中還發(fā)現(xiàn)粗葉青毛蘚醇提液、節(jié)莖曲柄蘚醇提液具有廣泛的抑菌性，且粗葉青毛蘚醇提液對化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌抑菌效果明顯，節(jié)莖曲柄蘚醇提液對銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌抑菌效果明顯，但目前未將粗葉青毛蘚和節(jié)莖曲柄蘚列為藥用苔蘚植物[14-17]?？梢娺€需對苔蘚植物進行抗菌性篩查，以期找出既能廣泛抗菌且抗菌效果好的苔蘚植物，及時對這些苔蘚植物資源進行保護。

節(jié)莖曲柄蘚和檜葉白發(fā)蘚對11種細菌的抑菌性達到高度統(tǒng)一，說明它們的次生代謝產(chǎn)物有著很大的相似性，賈渝、何思也在2013年的《中國生物物種名錄》（第一卷苔蘚植物）中將曲柄蘚屬放在了白發(fā)蘚科中[18]。泥炭蘚和卵葉泥炭蘚同屬泥炭蘚屬，在供試的11種細菌中，它們對8種細菌是否有抑菌作用是統(tǒng)一的，可見它們的次生代謝產(chǎn)物種類既具相似性，但又有區(qū)別。

從8種苔蘚植物醇提液抑菌活性來看，與對照組相比有顯著差異的并不是大多數(shù)，只有一部分種類的醇提取液抑菌活性相對較強，此結(jié)果與王丹對67種苔蘚植物的抑菌活性研究有相似性[19]。11種細菌中，傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌對8種苔蘚植物醇提液最為敏感，8種苔蘚植物醇提液均對其有抑制作用。8種苔蘚植物醇提液對乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌效果最好，抑菌效果與對照組相比有顯著差異。

苔蘚植物有抑菌性的主要原因是能產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，蘚類的主要次生代謝產(chǎn)物為黃酮、三萜、甾醇化物和長鏈不溶性脂肪酸等。從本次實驗還可以看出，苔蘚植物中確實含有某些抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，且部分物質(zhì)可以溶于有機溶劑乙醇中，后繼應(yīng)對有明顯抗菌作用的苔蘚植物做更進一步的研究，以期篩選出新的藥用苔蘚植物。