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    丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制▲

    2022-09-01 03:05:14梁偉華李建玲許方方
    廣西醫(yī)學(xué) 2022年13期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期孵育丙泊酚

    梁偉華 蔣 淼 李建玲 許方方

    [上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院)麻醉科,上海市 200431]

    丙泊酚是臨床上腫瘤切除手術(shù)中常用的麻醉藥,具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、止吐等功能[1]。近年有研究顯示,丙泊酚還具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[2]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明,丙泊酚可抑制乳腺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和新生血管形成,但是丙泊酚影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制尚不清楚[3-5]。Wnt信號(hào)通路是一個(gè)在生物進(jìn)化過程中比較重要的信號(hào)通路[6]。研究顯示,Wnt信號(hào)通路與丙泊酚的抗腫瘤機(jī)制有關(guān),丙泊酚可以通過降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等的Wnt信號(hào)通路的活化程度,發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞惡性表型的作用[7-8]。本研究以胃癌SGC7901細(xì)胞作為研究對(duì)象,探討丙泊酚對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制,以期為丙泊酚抗腫瘤機(jī)制的研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料 丙泊酚購自上海晶抗生物工程有限公司(批號(hào):JKG8628);DMEM購自江蘇齊氏生物科技有限公司(批號(hào):3-2010);細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體、C-myc抗體、二甲基亞砜均購自美國Sigma-Aldrich公司(批號(hào):SAB4700958、C7464、D2650);MTT溶液(批號(hào):SH-0163)、Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)(批號(hào):SOS-174)試劑盒均購自北京凱詩源生物科技有限公司;Transwell小室購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào):SPL-37524);兔抗活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體、鼠抗GAPDH抗體、山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗均購自美國Abcam公司(批號(hào):ab2302、ab205718、ab8245、ab205719);β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司(批號(hào):sc-7963);Wnt激活劑氯化鋰(LiCl)購自北京百奧萊博科技有限公司(批號(hào):M00507-NES);PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司(批號(hào):KGA511);RIPA裂解液(貨號(hào):R0020-100)購自北京索萊寶科技有限公司;胃癌SGC7901細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。MK3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Labsystems 公司;BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

    1.2 MTT法測(cè)定胃癌細(xì)胞增殖情況 采用DMEM,并置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種到96孔板內(nèi),設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)過夜,吸棄上清,然后分別添加含有0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL丙泊酚的DMEM 100 μL(將0 μg/mL丙泊酚處理組記為空白組),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔添加MTT溶液15 μL,孵育4 h,棄去上清,加入150 μL二甲基亞砜,振蕩反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值,以吸光度值表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3 細(xì)胞分組與處理 采用DMEM,并置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種到96孔板內(nèi),將細(xì)胞分為對(duì)照組、丙泊酚組、干預(yù)組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。(1)對(duì)照組添加含有0 μg/mL丙泊酚的DMEM 100 μL;(2)丙泊酚組添加含有15 μg/mL丙泊酚的DMEM 100 μL;(3)干預(yù)組添加含有15 μg/mL丙泊酚和20 mmol/L Wnt激活劑LiCl[9]的DMEM 100 μL。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4 PI單染法測(cè)定胃癌細(xì)胞周期 取1.3處理后的各組細(xì)胞,用0.25%胰酶充分消化后,PBS洗滌5 min,然后4 ℃下2 000 r/min離心5 min,棄上清取細(xì)胞沉淀,加入500 μL的70%乙醇固定細(xì)胞,4 ℃冰箱過夜;然后用PBS洗滌5 min,4 ℃下2 000 r/min離心5 min,棄上清,加入100 μL RNase A,37 ℃水浴30 min,加入400 μL PI染液,4 ℃避光反應(yīng)20 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm處的紅色熒光,同時(shí)檢測(cè)光散射情況,采用MultiCycle軟件分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法測(cè)定胃癌細(xì)胞凋亡情況 取1.3處理后的各組細(xì)胞,用0.25%胰酶充分消化后,以預(yù)冷的PBS將洗滌3次,每次5 min,加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸后收集細(xì)胞,制成106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液后加入10 μL的Annexin Ⅴ-FITC混合均勻,室溫避光孵育10 min,再加入10 μL PI染液混合均勻,室溫避光孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞凋亡率(%)=(早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100 %。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6 Western blot測(cè)定cleaved Caspase-3、cyclin D1、C-myc、β-catenin蛋白表達(dá)量 收集1.3處理后的對(duì)照組、丙泊酚組、干預(yù)組細(xì)胞,用0.25%胰酶充分消化后獲取細(xì)胞,采用RIPA試劑盒提取細(xì)胞的總蛋白,采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。行10% SDS-PAGE,然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將膜放在5%脫脂奶粉溶液中孵育1 h,再置于TBST溶液中洗滌2次,5 min/次;以GAPDH為內(nèi)參,將膜依次放在一抗(cleaved Caspase-3、cyclin D1、β-catenin、C-myc,稀釋比均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST溶液中洗滌2次,5 min/次,二抗(稀釋比1 ∶2 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜5 min,5 min/次。采用ECL試劑發(fā)光后,在凝膠圖像分析儀檢測(cè)目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各濃度丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL丙泊酚處理后的胃癌細(xì)胞吸光度值均低于0 μg/mL丙泊酚處理的胃癌細(xì)胞(均P<0.05),隨著丙泊酚干預(yù)濃度的升高,胃癌細(xì)胞吸光度值隨之降低(均P<0.05),見表1。與0 μg/mL丙泊酚組相比,15 μg/mL丙泊酚處理后的胃癌細(xì)胞增殖抑制率約為50%,故選用15 μg/mL的丙泊酚處理胃癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    表1 各濃度丙泊酚干預(yù)后胃癌細(xì)胞吸光度值的比較(x±s)

    2.2 各組胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期分布情況和cleaved Caspase-3、cyclin D1蛋白表達(dá)量的比較 與對(duì)照組相比,丙泊酚組胃癌細(xì)胞的吸光度值、S期細(xì)胞比例、G2/M期細(xì)胞比例、cyclin D1蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05),G0/G1細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05);與丙泊酚組相比,干預(yù)組胃癌細(xì)胞的吸光度值、S期細(xì)胞比例、cyclin D1蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05),G0/G1細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05),見圖1、表2。

    圖1 各組胃癌細(xì)胞凋亡和Western blot條帶圖

    表2 各組胃癌細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡情況和cleaved Caspase-3、cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

    2.3 各組胃癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較 與對(duì)照組相比,丙泊酚組細(xì)胞的β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05);與丙泊酚組相比,干預(yù)組細(xì)胞的β-catenin、C-myc蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.05),見圖2、表3。

    圖2 Wnt信號(hào)通路Western blot條帶圖

    表3 各組胃癌細(xì)胞中β-catenin、C-myc蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

    3 討 論

    丙泊酚是臨床常用的麻醉藥,除麻醉作用以外,丙泊酚還具有減輕神經(jīng)損傷、提高免疫功能的作用[10]。有研究表明,丙泊酚有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[11]。丙泊酚可在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力及腫瘤細(xì)胞血管生成[3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),經(jīng)丙泊酚處理后的肺癌細(xì)胞凋亡水平升高[12]。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示,丙泊酚具有抑制胃癌細(xì)胞移植瘤裸鼠的瘤體生長(zhǎng)和胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的作用[5,13]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)丙泊酚處理后胃癌細(xì)胞的增殖能力下降,細(xì)胞凋亡增加,表明丙泊酚具有體外抑制胃癌細(xì)胞惡性表型的作用,這與之前的研究結(jié)果[5,13]相符合,提示丙泊酚可能具有抑制胃癌進(jìn)展的作用。

    細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ),細(xì)胞周期可以分為分裂期和分裂間期,分裂間期是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備階段,其有序進(jìn)展與細(xì)胞內(nèi)的多種基因表達(dá)有關(guān)[14]。cyclin D1具有調(diào)控細(xì)胞周期G1期的作用,也是目前為止公認(rèn)的原癌基因,其表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展,從而誘導(dǎo)細(xì)胞惡性生長(zhǎng)[15]。與細(xì)胞周期一樣,細(xì)胞凋亡的發(fā)生也是細(xì)胞內(nèi)多種基因共同調(diào)控的結(jié)果[16]。Caspase蛋白家族含有多個(gè)成員,均具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[17]。研究表明,Caspase蛋白成員在正常情況下以無活性的酶原形式存在,只有被活化后才可以發(fā)揮促凋亡作用[18]。Caspase-3是位于Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的促凋亡因子,其被激活后能夠不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)丙泊酚處理后的胃癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量升高,細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)量下降,說明丙泊酚可以通過阻滯細(xì)胞周期抑制胃癌細(xì)胞增殖,以及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

    Wnt信號(hào)通路是一個(gè)在腫瘤組織中過度激活的信號(hào)通路,其激活水平越高,腫瘤惡性程度也就越高,抑制Wnt信號(hào)激活可以體外抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)[20]。研究顯示,丙泊酚可以抑制肝癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的激活,從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[7-8]。β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白,C-myc是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因,其表達(dá)水平高低與Wnt信號(hào)通路激活水平呈正相關(guān)[21-22]。本研究結(jié)果顯示,丙泊酚可以抑制胃癌細(xì)胞中β-catenin、C-myc蛋白的表達(dá),而Wnt信號(hào)通路激活劑可以逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響,這證實(shí)丙泊酚調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制可能與抑制Wnt信號(hào)通路激活有關(guān)。

    綜上所述,丙泊酚具有體外抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,其作用機(jī)制可能與抑制Wnt信號(hào)通路激活有關(guān)。這或許可為研究丙泊酚抗胃癌的作用機(jī)制提供了參考,今后將會(huì)在多株胃癌細(xì)胞和體內(nèi)試驗(yàn)中驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果。

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