齊墩果酸通過Nrf2抑制鐵死亡并減輕重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷*

李 建，常東鴿，霍劉斌，程曉丹，潘曉立，吳慧麗

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院1急診科，2消化內(nèi)科，河南鄭州 450001）

急性胰腺炎是一種臨床常見胰腺炎性疾病，伴隨腹痛和血清淀粉酶（amylase，AMY）濃度升高，一般預(yù)后良好，然而少數(shù)可能發(fā)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），易引起多器官損傷，導(dǎo)致死亡［1］。肝損傷是SAP常見器官損傷之一，且肝衰竭是導(dǎo)致死亡的重要因素［2］，目前仍缺乏有效防治措施，因此分析SAP 肝損傷的機(jī)制可能有利于尋找治療策略。

SAP 發(fā)生時，機(jī)體炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)爆發(fā)，攻擊各組織器官，引起細(xì)胞凋亡、壞死，造成器官結(jié)構(gòu)和功能損傷［3］。鐵死亡為2012 年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡的形式，依賴脂質(zhì)過氧化和鐵積累［4］。研究證明，鐵死亡參與非酒精性脂肪性肝損傷［5］、缺血再灌注肺損傷［6］、SAP 腎損傷［7］等病理過程，通過抑制鐵死亡可減輕上述損傷。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗氧化軸為調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化、死亡和存活的重要通路，激活Nrf2 通路可改善SAP 肝或腎損傷［8-9］。另外，Nrf2 活化后可通過影響谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）等表達(dá)調(diào)節(jié)鐵死亡過程，實現(xiàn)對非酒精性肝損傷［5］和缺血再灌注肺損傷［6］等的治療。然而鐵死亡在SAP肝損傷中的作用尚不清楚。

齊墩果酸（oleanolic acid，OLA）是提取自木犀科植物的天然萜類化合物，具有抗氧化、抗病原物、抗炎、抗糖尿病及保肝等作用，已被用作保肝藥物多年［10］。在膽汁淤積急性肝損傷大鼠中的研究表明，OLA 可促進(jìn)肝臟對膽酸的代謝能力，減輕肝損傷［11］。本實驗擬建立SAP 大鼠模型，探討鐵死亡與SAP 大鼠肝損傷的關(guān)系，并分析OLA 對SAP 大鼠肝損傷過程中鐵死亡和Nrf2-抗鐵死亡軸的影響。

材料和方法

1 動物

40 只雄性8 周齡SD 大鼠，SPF 級，體重（300±10）g，購自北京維通利華公司，許可證號：SCXK（京）-2016-0011。均飼養(yǎng)于（24±1）℃、50%±5%濕度、12 h光/暗循環(huán)的動物房中，保持水和食物充足。

2 主要試劑和儀器

OLA 購自西安力邦制藥公司；鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（FER1）和Nrf2 抑制劑brusatol（BRU）購自MCE；總膽汁酸（total bile acid，TBA）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）及AMY試劑盒購自安圖生物工程有限公司；總蛋白提取試劑盒、核蛋白提取試劑盒、HE 試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）比色試劑盒購自上海生工生物公司；DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）和總谷胱甘肽（total glutathione，t-GSH）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；抗GAPDH、Nrf2、histone H3、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）和GPX4 抗體，羊抗兔Ⅱ抗，鐵檢測試劑盒，4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）試劑盒和TUNEL 凋亡試劑盒購自Abcam；cleaved caspase-3、HO-1 和鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1；即AIFM2）抗體均購自Affinity。酶標(biāo)儀購自Thermo；熒光和普通顯微鏡購自Leica；熒光定量PCR 儀和電泳轉(zhuǎn)膜儀器購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 SAP 模型的建立 大鼠術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。經(jīng)腹部皮下注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后行開腹手術(shù)，參照文獻(xiàn)［7］，經(jīng)十二指腸逆行用微量注射泵將5%?；悄懰徕c（1 mg/kg）以0.1 mL/min 勻速泵入胰膽管，持續(xù)10 min，移開注射泵并逐層縫合腹部傷口。假手術(shù)（sham）組行開腹手術(shù)后，僅觸碰胰膽管部位。

3.2 動物分組及給藥 將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分組為sham 組、SAP 組、OLA+SAP 組、FER1+SAP 組和OLA+BRU+SAP 組，每 組8 只。OLA+SAP 組在注 射?；悄戔c酸后0.5、3 和6 h 先腹腔注射生理鹽水，再立即給予60 mg/kg OLA 灌胃［12］；FER1+SAP 組在注射牛磺膽鈉酸后0.5、3 和6 h 先腹腔注射2 mg/kg FER1［13］，再立即給予生理鹽水灌胃；OLA+BRU+SAP組在給予OLA 前腹腔注射2 mg/kg BRU［5］；sham 組和SAP組同步灌胃和腹腔注射生理鹽水。

3.3 樣本采集 造模后6 h（即末次給藥后）經(jīng)尾靜脈取血，4 ℃離心分離血清。造模后12 h（即末次給藥后6 h），處死大鼠取腹主動脈血，4 ℃離心分離血清；隨后分離胰臟及肝臟，沖凈后將肝臟分為3 份，一份置于-80 ℃凍存；一份與胰臟一起用4%多聚甲醛浸沒固定，分別制備5μm 厚的胰臟和肝臟石蠟切片；一份制備新鮮肝臟組織勻漿液。

3.4 HE 和TUNEL 染色 用HE 試劑盒分別對3.3中胰臟和肝臟石蠟切片染色，普通顯微鏡下觀察胰臟和肝臟形態(tài)變化。另外用TUNEL 試劑盒染色后觀察肝細(xì)胞死亡情況，熒光顯微鏡下拍照，ImageJ 軟件分析肝細(xì)胞凋亡率。凋亡率（%）=（凋亡肝細(xì)胞TUNEL+數(shù)量/視野下總肝細(xì)胞DAPI+數(shù)量）×100%。

3.5 血清指標(biāo)測定 用自動分析儀聯(lián)合ALT、AST、TBA、ALB 及AMY 試劑盒測定3.3 中血清的各指標(biāo)水平。

3.6 肝組織MDA、ROS、4-HNE、t-GSH 水平及鐵含量測定 取3.3 中新鮮肝臟組織勻漿液，離心取上清，測定蛋白濃度后，用酶標(biāo)儀聯(lián)合MDA、ROS、4-HNE、t-GSH及鐵檢測試劑盒，測定各指標(biāo)水平。

3.7 Western blot 檢測 分別使用總蛋白和核蛋白提取試劑盒從3.3 中冷凍肝組織中提取總蛋白和核蛋白，并定量。取30μg蛋白通過凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，將膜用5%脫脂奶粉封閉，用Ⅰ抗（GAPDH、Nrf2、histone H3、cleaved caspase-3、HO-1、GSS、GPX4和FSP1）稀釋液（GAPDH 為1∶2 000，其他均為1∶1 000）孵育過夜，再用羊抗兔Ⅱ抗稀釋液（1∶2 000）孵育60 min，最后用ECL 發(fā)光液避光孵育5 min。將膜置于蛋白凝膠成像儀中拍照并分析蛋白條帶灰度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述并使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析。用單因素方差分析行多組間比較，用SNK-q檢驗行兩兩比較。以P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較

造模后6 和12 h，相較于sham 組，SAP 組血清ALT、AST、TBA、AMY 水平升高（P＜0.05），ALB 水平降低（P＜0.05）；造模后6 h，相較于SAP組，OLA+SAP組、FER1+SAP 組血清AMY 水平降低（P＜0.05）；造模后6 h，相較于OLA+SAP 組，F(xiàn)ER1+SAP 組、OLA+BRU+SAP 組血清AMY 水平升高（P＜0.05）；造模后12 h，相較于SAP組，OLA+SAP組、FER1+SAP組血清ALT、AST、TBA、AMY 水平降低（P＜0.05），ALB 水平升高（P＜0.05）；造模后12 h，相較于OLA+SAP 組，F(xiàn)ER1+SAP 組、OLA+BRU+SAP 組血清ALT、AST、TBA、AMY 水平升高（P＜0.05），ALB 水平降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組ALT、AST、TBA、ALB及AMY水平的比較Table 1.Comparison of ALT，AST，TBA，ALB and AMY levels in the 5 groups（Mean±SD. n=8）

2 各組大鼠胰腺及肝組織形態(tài)的比較

sham組胰腺及肝細(xì)胞胞膜、胞核結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，均未見炎性細(xì)胞；SAP 組胰腺及肝葉間隙增大，細(xì)胞排列不規(guī)則且細(xì)胞腫脹變形，可見較多炎性細(xì)胞；OLA+SAP 組、FER1+SAP 組胰腺及肝損傷明顯緩解，且OLA+SAP 組改善效果優(yōu)于FER1+SAP 組；OLA+BRU+SAP組較OLA+SAP組加重，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of pancreatic and liver tissues in the 5 groups（HE staining，scale bar=100μm）.圖1 各組胰腺和肝組織形態(tài)的比較

3 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡的比較

相較于sham 組，SAP 組cleaved caspase-3 蛋白水平和肝細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；相較于SAP組，OLA+SAP 組和FER1+SAP 組cleaved caspase-3 蛋白水平和肝細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；相較于OLA+SAP 組，F(xiàn)ER1+SAP 組 和OLA+BRU+SAP 組cleaved caspase-3 蛋白水平和肝細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），見圖2、3。

Figure 2.TUNEL assay was used to detect hepatocyte apoptosis.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.圖2 TUNEL染色檢測肝細(xì)胞凋亡

4 各組大鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

Figure 3.Comparison of liver cleaved caspase-3 protein level in the 5 groups.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.圖3 各組肝臟cleaved caspase-3的比較

相較于sham 組，SAP 組肝組織中ROS、MDA 和4-HNE水平顯著增高（P＜0.05），t-GSH水平顯著降低（P＜0.05）；相較于SAP組，OLA+SAP 組和FER1+SAP組肝組織中ROS、MDA 和4-HNE 水平顯著降低（P＜0.05），t-GSH 水平顯著增高（P＜0.05）；相較于OLA+SAP 組，OLA+BRU+SAP 組肝組織中ROS、MDA 和4-HNE 水平顯著增高（P＜0.05），t-GSH 水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組ROS、MDA、4-HNE及t-GSH水平的比較Table 2.Comparison of ROS，MDA，4-HNE and t-GSH levels in the 5 groups（Mean±SD. n=8）

5 各組大鼠肝組織中鐵含量的比較

相較于sham 組，SAP 組肝組織中鐵含量顯著增加（P＜0.05）；相較于SAP 組，OLA+SAP 組、FER1+SAP 組肝組織中鐵含量顯著減少（P＜0.05）；相較于OLA+SAP 組，F(xiàn)ER1+SAP 組、OLA+BRU+SAP 組肝組織中鐵含量顯著增加（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Comparison of iron content in the 5 groups.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.圖4 各組鐵含量比較

6 各組大鼠肝組織中Nrf2-抗鐵死亡軸相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

相較于sham 組，SAP 組核蛋白及總蛋白中Nrf2水平，總蛋白中HO-1、GSS、GPX4 和FSP1 水平顯著降 低（P＜0.05）；相較于SAP 組，OLA+SAP 組 和FER1+SAP 組核蛋白及總蛋白中Nrf2 水平，總蛋白中HO-1、GSS、GPX4 和FSP1 水平顯 著增加（P＜0.05）；相較于OLA+SAP 組，F(xiàn)ER1+SAP 組和OLA+BRU+SAP 組核蛋白及總蛋白中Nrf2 水平，總蛋白中HO-1、GSS、GPX4 和FSP1 水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

討 論

SAP 肝損傷涉及炎癥和過氧化等共同作用。OLA 在抑制肝臟炎癥和脂肪累積［14］、抑制肝纖維化［15］、提高脂肪代謝［16］及改善肝臟氧化應(yīng)激和膽汁代謝［17］的效果已被證實，這是其作為保肝藥物的基礎(chǔ)。研究顯示，OLA 可改善肝纖維化大鼠的肝功能血清指標(biāo)，減輕肝中炎癥和細(xì)胞壞死［15］。本研究中SAP 大鼠經(jīng)OLA 治療12 h 后，胰腺和肝形態(tài)損傷均減輕，且血清ALT、AST、TBA 及AMY 水平降低，ALB水平升高。胰腺或肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷后，細(xì)胞內(nèi)AMY、ALT 和AST 等代謝酶釋放入血，且肝細(xì)胞代謝膽紅素及合成ALB 等蛋白的能力降低，表現(xiàn)為血清水平異常［17］。本研究在SAP 大鼠中也觀察到與人類胰腺和肝細(xì)胞損傷類似的血清指標(biāo)變化，提示OLA 可改善SAP 大鼠肝臟合成代謝能力，保護(hù)胰腺和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，對SAP肝損傷也有治療作用。

Figure 5.Comparison of the expression of Nrf2-antiferroptosis axis-related proteins in the 5 groups.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.圖5 各組Nrf2-抗鐵死亡軸相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

過度氧化應(yīng)激是急性炎癥性疾病中細(xì)胞損傷的重要原因，研究顯示，氧化應(yīng)激和相關(guān)ROS的累積在AP 的胰腺腺泡細(xì)胞損傷中起主要作用［18］。過量的ROS 可對核酸和脂質(zhì)等進(jìn)行氧化修飾破壞它們的功能，如果細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平升高，則可能發(fā)生鐵死亡［19］。通常情況下，機(jī)體內(nèi)循環(huán)鐵主要與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并以Fe3+形式存在，當(dāng)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)失衡時，F(xiàn)e3+通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)入細(xì)胞，被還原為具有活性的Fe2+，這些Fe2+進(jìn)一步將脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為ROS，引起細(xì)胞鐵死亡［20］。因此，ROS、脂質(zhì)過氧化物和Fe2+的產(chǎn)生及累積是誘導(dǎo)鐵死亡的基礎(chǔ)。本研究在SAP 大鼠肝臟中檢測到細(xì)胞死亡率、鐵離子含量、ROS、MDA 和4-HNE 水平增高，t-GSH 水平降低，且鐵死亡抑制劑FER1 可減輕SAP 大鼠肝中脂質(zhì)過氧化程度、鐵累積及細(xì)胞死亡，說明鐵死亡參與SAP 肝損傷過程。研究顯示，抑制氧化應(yīng)激可抑制急性肝衰竭鐵死亡，可以降低病理損傷，改善肝功能［21］。本研究中，OLA 治療可明顯增加SAP 大鼠t-GSH 水平，減少細(xì)胞死亡率、鐵離子含量及ROS、MDA和4-HNE水平，提示OLA 可減少鐵死亡所需的脂質(zhì)氧化物和鐵累積，具有抑制鐵死亡的活性。

鐵死亡是依賴于鐵的脂質(zhì)過氧化性細(xì)胞死亡，GSH、HO-1、GPX4 及FPS 等抗氧化分子或酶共同組成抗鐵死亡軸，抵抗鐵死亡。GSS 為合成GSH 所必需的酶，而GPX4 可與GSH 共同作用，將脂質(zhì)過氧化物還原為無細(xì)胞毒性的脂質(zhì)醇，是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子，當(dāng)GSH合成受阻時，GPX4的活性下降，細(xì)胞抗氧化能力下降，導(dǎo)致ROS 積累，促進(jìn)鐵死亡［22-23］。FSP為鐵死亡抑制蛋白，可通過促進(jìn)輔酶Q10再生增強(qiáng)機(jī)體對脂質(zhì)過氧化自由基的還原能力，和GPX 途徑平行發(fā)揮作用［13，24］。Nrf2 通路是細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化機(jī)制，可以被氧化刺激入核活化，誘導(dǎo)下游信號分子HO-1、GSS 和GPX4 等的表達(dá)，以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)［25］。此外，Nrf2 通路的激活已被證實可阻礙鐵死亡［25］，而鐵死亡是炎癥性疾病的治療靶點［26］。本研究中，OLA 可顯著增加SAP 大鼠肝組織核蛋白及總蛋白中Nrf2 水平，總蛋白中HO-1、GSS、GPX4 及FSP1水平，提示OLA 可促進(jìn)大鼠肝中Nrf2-抗鐵死亡軸活化。進(jìn)一步研究顯示，Nrf2 抑制劑BRU 可減弱OLA 對SAP 肝損傷的作用及對氧化應(yīng)激、鐵死亡的抵抗作用，提示Nrf2-抗鐵死亡軸在OLA 保護(hù)SAP 大鼠肝損傷中發(fā)揮作用。

綜上所述，鐵死亡參與SAP 大鼠肝損傷過程，OLA 可通過激活Nrf2-抗鐵死亡軸抵抗細(xì)胞鐵死亡，減輕SAP 大鼠肝損傷。另外，SAP 肝損傷還涉及肌醇需求酶1α 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路［27］、TLR4/NF-κB p65 介導(dǎo)的炎癥通路［28］，結(jié)合本研究內(nèi)容，推測OLA可能通過多途徑發(fā)揮對SAP肝損傷的保護(hù)。