補(bǔ)陽還五湯通過SIRT1/NF-κB p65信號通路減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷*

辛紫媛，靳曉飛，周曉紅，劉真一，高 萍，馬 嫻，高維娟，△

（1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050091）

腦卒中是急性腦血液循環(huán)紊亂的一類腦血管疾病，可導(dǎo)致全球范圍內(nèi)患者的高致殘率和高死亡率，造成巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其中最常見的是缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）［1］。目前CIS的主要治療方法有早期靜脈注射組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen aetivator，tPA）、血管內(nèi)取栓、改善側(cè)支循環(huán)等［2］。然而，在長時(shí)間的缺血條件下，血液發(fā)生再灌注可能會(huì)導(dǎo)致更大的腦梗死體積，反過來加重初始損傷產(chǎn)生繼發(fā)性腦神經(jīng)損傷，稱為腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI）［3］。在CIRI 過程中可觸發(fā)的一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)會(huì)形成惡性循環(huán)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，這些反應(yīng)通過特定的炎癥信號通路發(fā)出信號，導(dǎo)致缺血性腦組織產(chǎn)生炎癥性病變，在CIRI 作用機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用［4-5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulation 1，SIRT1）是哺乳動(dòng)物Ⅲ類組蛋白脫乙?；竤irtuin 家族的一個(gè)重要成員，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的脫乙?；富钚?，在CIRI 中可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存活、軸突伸長、突觸可塑性決定細(xì)胞的命運(yùn)，介導(dǎo)相關(guān)的信號通路參與保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中的神經(jīng)細(xì)胞免受損傷，其中包括抑制其下游的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）核轉(zhuǎn)位進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)［6-7］。補(bǔ)陽還五湯（Buyang-Huanwu decoction，BYHWD）在清朝王清任所著的《醫(yī)林改錯(cuò)·下卷·癱痿論》一書中被首次提出，對癥治療氣虛血瘀所致中風(fēng)沿用至今，具有顯著的療效，但其確切的藥理機(jī)制尚不清楚［8］。有研究表明BYHWD 含藥血清能夠有效延緩?fù)砥谒ダ弦鸬难芷交〖?xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的異常遷移和侵襲，并伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）表達(dá)的減少，發(fā)現(xiàn)SIRT1 可能是影響其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［9］。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明BYHWD 在抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫紊亂調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用，減輕炎癥反應(yīng)緩解疾病進(jìn)展［10］。本研究建立SD 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型并給予BYHWD 干預(yù)，觀察BYHWD 是否可以通過調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB p65 炎癥信號通路發(fā)揮對CIRI 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步探索BYHWD調(diào)節(jié)CIRI的可能作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

75只SPF級健康雄性SD 大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK（京）2016-0011，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開始實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道關(guān)懷，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)，審核編號：DWLL2019025。

2 主要藥物、試劑和儀器

TTC 染液、HE 染液和免疫組化試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司）；SIRT1 抑制劑EX527（Selleck Chemicals）；兔抗SIRT1 抗體、兔抗NF-κB p65 抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗NF-κB p65 acetyl K310 抗體（Abcam）；鼠抗IL-6 抗體、鼠抗TNFα 抗體（Santa Cruz）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑（Sigma）；QuickBlock?免疫染色封閉液、含DAPI抗熒光淬滅封片液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；FITC-羊抗兔IgG 熒光標(biāo)記抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；PVDF膜（Millipore）；

MCAO 栓線（北京西濃科技有限公司）；組織包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、冰凍切片機(jī)及顯微拍照系統(tǒng)（Leica）；電泳系統(tǒng)及半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（Bio-Rad）；高速低溫組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；冷凍高速離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；多功能成像系統(tǒng)（Vilber）。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與給藥 健康雄性SD 大鼠75只隨機(jī)分為5 組：假手術(shù)（sham）組、模型組（MCAO/R組）、BYHWD組、SIRT1抑制劑組（EX527組）和BYHWDZ+EX527組，每組15只大鼠。除sham 組外，其余各組大鼠均參照文獻(xiàn)［11］建立MCAO 模型模擬CIRI，手術(shù)缺血2 h 后再灌注3 d。BYHWD 組和BYHWD+EX527組大鼠給予BYHWD，劑量參照實(shí)驗(yàn)室前期研究［12］為14.3 g/kg。EX527 是一種SIRT1 特異性抑制劑，可有效抑制SIRT1 去乙?；富钚?，EX527 粉末需要溶解在1%二甲基亞砜，20%聚乙二醇和79%雙蒸水混合而成的溶劑中。EX527 組和BYHWD+EX527 組大鼠造模前開始腹腔注射給予EX527 溶液，劑量參照文獻(xiàn)［13］為5 mg/kg。BYHWD 于造模后2 h 開始至取材前，每1 d 灌胃給藥1 次；EX527 于造模前3 d開始至取材前2 h，每2 d腹腔注射給藥1次。同樣，設(shè)置EX527未經(jīng)干預(yù)的sham 組、MCAO/R 組和BYHWD 組腹腔注射相同體積的二甲基亞砜和聚乙二醇溶劑作為對照。

3.2 Zea Longa 評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)神經(jīng)功能缺損狀況大鼠清醒后根據(jù)Zea Longa 評分，將得到1、2、3 分的大鼠隨機(jī)分配入組，其余剔除；MCAO 缺血2 h 再灌注3 d，觀察神經(jīng)功能缺損狀況并記錄各組大鼠評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為：無神經(jīng)功能缺損記為0 分；懸尾時(shí)對側(cè)前爪不能伸展記為1 分；行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2 分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒記為3 分；無自主活動(dòng)或意識喪失記為4分。

3.3 TTC 染色檢測腦梗死體積百分比 所有大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，立即取出腦組織冰凍后切成6 個(gè)2 mm 厚的冠狀切片，浸泡在TTC 溶液中于37 ℃恒溫箱避光染色30 min，然后在4%中性甲醛固定液中固定，隔天將組織切片按順序放置，使用相機(jī)拍攝圖像后應(yīng)用Image J 軟件計(jì)算缺血側(cè)局部腦梗死體積占總體積百分比。

3.4 HE 染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化 大鼠麻醉后取出完整腦組織，4%中性甲醛固定液充分固定24 h 以上，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后制備厚度約5μm 的石蠟切片。染色時(shí)切片脫蠟復(fù)水，蘇木素染色后流水沖洗，蘇木素分化液分化后流水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)后流水沖洗，伊紅染液染色后流水沖洗，經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖像，觀察各組大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域病理學(xué)改變。

3.5 Western blot 檢測SIRT1、乙酰化NF-κB p65（Ac NF-κB p65）、NF-κB p65 及IL-6 蛋白表達(dá)水平 冰上快速取出新鮮腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域，用液氮處理之后冷凍貯存?zhèn)溆?。檢測時(shí)組織在冰冷裂解緩沖液（裂解液由RIPA、PMSF、Cocktail混合而成）中快速剪碎，并用低溫研磨儀勻漿，離心后進(jìn)行BCA法蛋白定量，其余上清液在loading buffer 中100 ℃煮沸變性。蛋白經(jīng)過SDS-PAGE 分離，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，TBST 洗膜后在Ⅰ抗［SIRT1 抗體（1∶1 000）、Ac NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、IL-6 抗體（1∶200）及內(nèi)參照β-actin抗體（1∶2 000）］溶液中4 ℃孵育過夜，洗膜后與相應(yīng)種屬的Ⅱ抗［辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的IgG 抗體］室溫孵育2 h，洗膜后ECL 顯色劑避光孵育后曝光成像，使用VisionCapt凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。實(shí)驗(yàn)以β-actin 為內(nèi)參照蛋白，通過觀察目的蛋白與β-actin比值，乙?；鞍着c總蛋白比值分析蛋白的相對表達(dá)水平。

3.6 免疫熒光染色檢測NF-κB p65入核表達(dá)水平新鮮腦組織固定至少24 h，蔗糖溶液中梯度脫水，OCT 包埋劑包埋后制備厚度8 μm 的冰凍切片低溫保存。染色時(shí)切片恢復(fù)室溫后封閉液封閉，滴加Ⅰ抗NF-κB p65（1∶1 000）抗體于4 ℃冰箱中孵育過夜，洗片后滴加Ⅱ抗（FITC-羊抗兔IgG 熒光抗體，1∶100）室溫避光孵育1 h，洗片后使用含DAPI 抗熒光淬滅劑封片避光保存，熒光顯微鏡下分別采集大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域DAPI 圖像和NF-κB p65 圖像，將兩種熒光圖像融合分析細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65熒光強(qiáng)度。

實(shí)習(xí)后期的主要壓力源來自就業(yè)。實(shí)習(xí)后期，實(shí)習(xí)護(hù)生在應(yīng)對日益繁重的實(shí)習(xí)任務(wù)之余，還需為未來做準(zhǔn)備。當(dāng)前就業(yè)的供需矛盾及部分護(hù)生過高的就業(yè)期望，使許多實(shí)習(xí)護(hù)生精疲力竭(“才發(fā)現(xiàn)護(hù)理專業(yè)也不是我們想象中那樣好就業(yè)”[2]，“競爭那么激烈，找個(gè)編內(nèi)工作實(shí)在太難了”[6])。

3.7 免疫組化染色檢測TNF-α 表達(dá)水平 石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，浸泡在檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻后PBS 洗片；雙氧水溶液避光孵育30 min 消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗片；3%BSA 室溫封閉30 min；Ⅰ抗TNF-α抗體（1∶50）濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，防止干片；次日PBS 洗片，Ⅱ抗（HRP-山羊抗小鼠抗體）室溫孵育1 h，PBS洗片；滴加DAB 顯色液并在顯微鏡下觀察到陽性表達(dá)為棕黃色時(shí)，自來水洗片；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，自來水洗片，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水洗片，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，自來水洗片；切片染色完成后脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域并采集圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析并計(jì)算平均光密度（average optical density）以評價(jià)蛋白表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.0.1 軟件對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制柱狀圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示。各組間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Zea Longa評分觀察不同處理組大鼠神經(jīng)功能缺損狀況

sham 組神經(jīng)功能正常，其它各組大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損；與sham 組相比，MCAO/R 組出現(xiàn)顯著神經(jīng)功能缺損狀況，神經(jīng)功能學(xué)評分升高（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組神經(jīng)功能缺損狀況有所恢復(fù)，神經(jīng)功能學(xué)評分降低（P＜0.05），EX527 組神經(jīng)功能缺損程度加重，神經(jīng)功能學(xué)評分升高（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527出現(xiàn)更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損狀況，神經(jīng)功能學(xué)評分升高（P＜0.05），見圖1。

2 TTC染色觀察不同處理組大鼠腦梗死體積改變

TTC 染色結(jié)果顯示，sham 組腦組織呈均勻紅色，無缺血梗死灶出現(xiàn)，其它各組大鼠均有不同程度的缺血梗死灶；與sham 組相比，MCAO/R 組缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的白色缺血梗死灶，腦梗死體積百分比增加（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組白色缺血梗死灶有所減小，腦梗死體積百分比降低（P＜0.05），EX527 組白色缺血梗死灶增大，腦梗死體積百分比增加（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527 組出現(xiàn)更大面積的白色缺血梗死灶，腦梗死體積百分比增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 1.Zea Longa score was used to observe the neurological deficits of the rats in different groups.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖1 Zea Longa評分觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損狀況

3 HE染色觀察不同處理組大鼠腦組織病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，sham 組腦組織皮質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞完整、數(shù)量豐富，細(xì)胞核清晰可見；與sham 組相比，MCAO/R 組腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)部分呈疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、完整性被破壞甚至萎縮、數(shù)量減少，核固縮、碎裂；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組腦組織病理損傷減輕，神經(jīng)細(xì)胞萎縮形態(tài)有所改善、數(shù)量增多；EX527 組腦組織病理損傷更為嚴(yán)重，呈疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、空泡狀，神經(jīng)細(xì)胞丟失、破裂甚至壞死，核溶解；與BYHWD組相比，BYHWD+EX527組腦組織病理損傷加重，神經(jīng)細(xì)胞破壞程度有所增加，見圖3。

4 Western blot 觀察不同處理組大鼠SIRT1、Ac NF-κB p65、NF-κB p65和IL-6蛋白表達(dá)水平

與sham 組相比，MCAO/R 組SIRT1 表達(dá)顯著降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65比值和IL-6表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組SIRT1表達(dá)顯著升高，Ac NF-κB p65/NF-κB p65 比值和IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05），EX527 組SIRT1 表達(dá)降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65 比值和IL-6 表達(dá)升高（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527 組SIRT1表達(dá)降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65比值和IL-6表達(dá)升高（P＜0.05），見圖4。

5 免疫熒光染色觀察不同處理組大鼠NF-κB p65入核表達(dá)水平

Figure 2.TTC staining was used to observe the cerebral infarction volume changes of the rats in different groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖2 TTC染色觀察不同處理組大鼠腦梗死體積改變

Figure 3.HE staining was used to observe the brain histopathological changes of the rats in different groups.圖3 HE染色觀察不同處理組大鼠腦組織病理學(xué)變化

免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞核陽性表達(dá)為藍(lán)色熒光標(biāo)記，NF-κB p65 陽性表達(dá)為綠色熒光標(biāo)記，NF-κB p65在細(xì)胞漿中表達(dá)處于無活性的靜止?fàn)顟B(tài)，在細(xì)胞核中表達(dá)處于被激活的活性狀態(tài)。sham組腦組織皮質(zhì)區(qū)NF-κB p65 主要表達(dá)于細(xì)胞漿中；與sham 組相比，MCAO/R 組缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)NF-κB p65 主要表達(dá)于細(xì)胞核中，核內(nèi)NF-κB p65 表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組細(xì)胞漿和細(xì)胞核中NF-κB p65 均有表達(dá)，核內(nèi)NF-κB p65 表達(dá)水平減少（P＜0.05），EX527 組核內(nèi)NF-κB p65 表達(dá)增多（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527 組核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)增多（P＜0.05），見圖5。

6 免疫組化染色觀察不同處理組大鼠TNF-α 蛋白表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示TNF-α 陽性表達(dá)主要集中在細(xì)胞漿中，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。sham 組腦組織皮質(zhì)區(qū)僅有少量TNF-α 表達(dá)；與sham 組相比，MCAO/R 組TNF-α 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組TNF-α 表達(dá)量有所降低（P＜0.05），EX527 組TNF-α 表達(dá)量增加（P＜0.05）；與BYHWD組相比，BYHWD+EX527 組TNF-α 表達(dá)量增加（P＜0.05），見圖6。

討 論

CIRI導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制是級聯(lián)和多因素的，與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，涉及到多種病理生理機(jī)制形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)，威脅人類機(jī)體的健康產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害作用，靶向這些機(jī)制顯示有益的神經(jīng)保護(hù)作用，探索減輕CIRI的發(fā)病機(jī)制、治療方法和治療藥物是CIS治療中的亟待解決的關(guān)鍵難點(diǎn)［14-15］。

炎癥反應(yīng)是CIRI 重要的發(fā)病機(jī)制，也是缺血腦組織繼發(fā)性損傷的重要原因，貫穿了CIRI 的整個(gè)病理生理過程［16］。CIRI 會(huì)快速引起炎癥反應(yīng)，后者是免疫系統(tǒng)去除有害的感染性或非感染性刺激并啟動(dòng)愈合過程的生理性防御反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)不僅影響局部血液供應(yīng)，還對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷，造成血腦屏障破壞，神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步損傷［17-18］。早期死亡和受損神經(jīng)細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式（damageassociated molecular patterns，DAMPs）誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞激活，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和外周白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）的滲出，這些炎癥細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎癥介質(zhì)，如TNF-α 和IL-6 等促炎因子的產(chǎn)生，其過表達(dá)是炎癥反應(yīng)在CIRI 損傷的一個(gè)典型病理特征，主要炎癥信號通路如NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等信號通路通過調(diào)節(jié)這些炎癥介質(zhì)減輕CIRI［19-22］。因此，如何通過干預(yù)炎癥反應(yīng)，以影響CIS 患者的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，是值得關(guān)注的研究方向。

Figure 4.Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1，Ac NF-κB p65，NF-κB p65 and IL-6 of the rats in different groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖4 Western blot檢測不同處理組大鼠SIRT1、Ac NF-κB p65、NF-κB p65、IL-6的蛋白表達(dá)水平

隨著近年來的研究表明，SIRT1在體內(nèi)和體外都能保護(hù)機(jī)體改善CIRI，激活SIRT1 可以被認(rèn)為是一種神經(jīng)保護(hù)策略，有望成為越來越多心腦血管疾病有前途的治療靶點(diǎn)［23］。Yeung 等［24］首次證明SIRT1作為去乙?；福粌H可以去乙?；M蛋白底物，還可以調(diào)節(jié)下游非組蛋白底物NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生存。NF-κB 通常以p50/p65 異源二聚體形式存在，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的核心和關(guān)鍵調(diào)控因子，生理狀態(tài)下NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合主要以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在受到刺激后IκB 蛋白被磷酸化、泛素化及蛋白酶體降解，退化的IκB 與NF-κB 解離，使NF-κB p65 轉(zhuǎn)移進(jìn)入到細(xì)胞核被激活，促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生，有效調(diào)控NF-κB 信號通路抑制其核轉(zhuǎn)位是調(diào)控局灶CIRI早期炎性損傷至關(guān)重要的環(huán)節(jié)［25］。然而，NF-κB p65亞基需要經(jīng)過多種翻譯后修飾才能調(diào)控轉(zhuǎn)錄的激活［26］。在CIRI 發(fā)生后，調(diào)控SIRT1 靶點(diǎn)在缺血后炎癥反應(yīng)中起重要作用，SIRT1 可以通過抑制Ac NF-κB p65 310 賴氨酸殘基乙?；?，減少NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，使NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性下降，阻止發(fā)揮促炎的活性作用，減少炎癥因子TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生，以減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用［27-28］。

Figure 5.Immunofluorescence staining was used to observe the nuclear expression of NF-κB p65 of the rats in different groups.Blue represents DAPI positive signal；green represents NF-κB p65 positive signal.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖5 免疫熒光染色觀察不同處理組大鼠NF-κB p65入核表達(dá)情況

Figure 6.Immunohistochemical staining was used to observe the protein expression levels of TNF-α of the rats in different groups.The scale bar=50μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖6 免疫組化染色觀察不同處理組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平

在中醫(yī)學(xué)上將腦卒中稱之為中風(fēng)，傳統(tǒng)中藥BYHWD 是臨床上廣泛應(yīng)用、切合中風(fēng)病機(jī)的一個(gè)中醫(yī)經(jīng)典名方。方中重用大劑量的黃芪益氣固表為君藥，當(dāng)歸活血化瘀佐君配合加入為臣藥，其它單味藥赤芍、紅花、地龍、桃仁、川芎活血祛瘀通經(jīng)活絡(luò)均為佐藥。用藥主次分明，以補(bǔ)氣為主兼以活血化瘀通絡(luò)之功效，對癥治療氣虛血瘀所致中風(fēng)［29］。雖然BYHWD 在治療腦卒中進(jìn)程發(fā)展中被證明可降低炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制仍未明確［30］。

本研究表明，建立CIRI 在體MCAO 模型并于再灌注損傷早期給予BYHWD治療，可減輕MCAO/R大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦梗死體積，減輕腦組織病理損傷。進(jìn)一步的研究表明，其藥理作用的具體機(jī)制可能通過激活SIRT1 降低Ac NF-κB p65 表達(dá)，抑制NF-κB p65 活性，減輕TNF-α 和IL-6 等促炎因子的表達(dá)，通過EX527 干預(yù)后，BYHWD 引起的這些作用被減弱。這提示BYHWD 可能通過調(diào)控SIRT1/NF-κB p65 炎癥信號通路的潛在機(jī)制發(fā)揮其減輕CIRI 的藥理作用，了解這種修飾方式可以更加精確調(diào)節(jié)NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活，以此作為靶點(diǎn)的抗炎治療為BYHWD 治療腦血管疾病提供更精準(zhǔn)的理論基礎(chǔ)。